심부전은 전 세계 남성과 여성 모두에게 주요 사망 원인입니다. 새로운 증거는 심장과 전신 대사에 있는 변경이 심부전의 병리학에 기여한다는 것을 건의합니다. 어떤 대사산물이 흥분 수축 커플링에 영향을 미치는지 신속하게 식별하는 것은 여전히 어려운 일입니다.
성인 마우스에서 심장 심근세포를 분리하는 전통적인 접근 방식은 시간이 많이 걸리고 도전적인 과정입니다. 이 문서의 혁신적인 방법을 사용하면 엄격한 프로세스를 보다 효율적이고 쉽게 수행할 수 있습니다. 또한 형광 프로브를 사용하여 화학 물질이 세포 수준에서 심장 독성 이나 기능 장애를 유도 할 수있는 방법에 대한 많은 현상 평가를 수행 할 수 있습니다.
어떤 분자가 심낭성 기능을 변경하는지 확인함으로써, 새로운 치료법은 심부전의 치료를 위해 규명될 수 있다. 형질 전환성 마우스를 사용하여, 우리는 심장 마비를 방지하고 기여할 수 있는 결정하기 위하여 다른 유전자를 탐구할 수 있습니다. 이 정보는 심부전의 미래 치료에 필수적일 것입니다.
절차를 시연하는 것은 매튜 클로스와 학생 슈레아스 슈어쉬가 될 것입니다. 먼저 작업 중인 라미닌 솔루션을 얼음 위에 해동하십시오. P1000 파이펫을 사용하여, 라미닌의 200 마이크로리터를 흡면하고 부드럽게 소독 된 커버 슬립의 한 가장자리를 따라 파이펫 팁을 드래그하여 모세관 작용이 6 웰 플레이트에 커버 슬립 부착을 용이하게하기 위한 소량의 라미닌을 꺼낼 수 있도록합니다.
그런 다음 나머지 라미닌을 커버슬립의 중앙에 원형 모션으로 추방합니다. 커버슬립을 가로질러 라미닌 방울을 펼쳐보세요. 커버립을 섭씨 37도인 큐베이터에 최소 한 시간 동안, 최대 24시간 동안 분리하십시오.
차가운 KHB-HB에서 제조된 심혼에서 심Cytes를 격리하기 위하여는, 스테레오 현미경의 밑에 견본을 놓습니다. 색전을 방지하기 위해, 대동맥 캐뉼라를 KHB-HB 용액에 잠그고 20 밀리리터 주사기를 사용하여 용액을 강제로 통과하십시오. 심장이 잠기고 캐뉼라가 심장 절제 전에 준비되었는지 확인하십시오.
5 개의 집게로 심장을 캐너레이합니다. 대동맥 삽입보다 약 1mm 이상 캐뉼라의 끝을 심실로 시각화하여 캐뉼라의 적절한 위치를 확인합니다. 그런 다음 랑겐도르프에서 스톱콕을 회전하여 KHB-HB의 흐름을 시작합니다.
칸누라를 랑겐도르프에 연결하여 5분 동안 심장을 감내보십합니다. 다음으로, 스톱콕을 회전하여 KHB-HB 저수지에서 소화 버퍼 저장소로 관류를 전환합니다. 소화 버퍼가 심혼에 도달하면 타이머를 설정합니다.
멸균 100 밀리리터 비커로 퍼퓨라기를 수집합니다. 소화 시간이 만료될 때까지 난투로 필요에 따라 소화 버퍼 저장소를 다시 채웁니다. 소화 후, 멸균 100 밀리리터 비커에서, 집게와 홍채 가위로 심장의 챔버를 분리합니다.
각 챔버를 6웰 플레이트의 별도 우물에 놓습니다. 콜라게나제 용액 5밀리리터를 각 우물에 붓습니다. 즉시 가위를 사용하여 심장 조직을 약 1 입방 미터의 덩어리로 다진다.
멸균 전달 파이펫을 사용하여 다진 심장 조직을 소화 버퍼로 부드럽게 세살합니다. 조직 덩어리가 흰색과 깃털이되면, 세포를 검사하기 위해 반전 된 현미경 아래에 접시를 놓습니다. 실행 가능한 세포의 수가 80% 이상이면 100 미크론 세포 스트레이너를 사용하여 세포를 50 밀리리터 원추형 튜브로 변형시키기 위해 진행됩니다.
실행 가능한 세포의 수가 80 % 미만인 경우 cannulate하는 데 걸린 시간을 확인합니다. 캐니언레이션 시간이 5분 이상인 경우 다른 하트를 사용해 보십시오. 그렇지 않은 경우, 콜라게나아제 샘플링 프로그램을 통해 새로운 콜라게나아제 슬롯을 분석한다.
다음으로, 2분 동안 215배 g에서 원심분리로 세포를 펠릿한다. 펠릿은 컴팩트하고 느슨하지 않아야합니다. 펠릿이 느슨해지면 준비에는 많은 죽은 세포가 포함되어 있습니다.
조직 배양 후드에서, 정지 버퍼의 10 밀리리터에 컴팩트 펠릿을 다시 중단. 2 분 동안 215 배 g에서 원심 분리하여 세포를 다시 펠렛. 도금 버퍼의 5 밀리리터에서 세포를 다시 중단합니다.
사이토 카운터에 세포 수를 수행하고 밀리리터 당 4 세포에 2 회 10의 최종 심근 세포 농도에 도달하기 위해 도금 버퍼의 부피를 조정합니다. 이제 인큐베이터에서 라미닌 코팅 커버립을 제거합니다. 라미닌 액적을 흡인합니다.
각 커버슬립에 심근세포 현탁액 200 마이크로리터를 플레이트. 커버립을 섭씨 37도의 인큐베이터에 21%의 산소와 5%의 이산화탄소를 부착할 수 있도록 2시간 동안 배치합니다. 2 시간 후, 커버립을 꺼내 부착되지 않은 세포를 흡인.
최대 4일 동안 인큐베이터에 문화 미디어와 문화를 2밀리리터를 추가합니다. 먼저 멤브레인 전위 키트에서 부품 A 및 부품 B를 제거합니다. 15 밀리리터 원내 튜브에서 50마이크로리터의 성분 B와 5개의 마이크로리터의 성분 A를 결합하여 전압 염료 혼합물을 형성합니다.
혼합 소용돌이. 전압 염료 혼합물을 포함하는 15 밀리리터 원내 형관에 도금 매체 10 밀리리터를 추가하여 멤브레인 염색 혼합물을 형성합니다. 다시, 혼합 소용돌이.
그런 다음 인큐베이터에서 심사이클의 6웰 플레이트 하나를 제거합니다. 미디어를 흡인합니다. 각 우물에 멤브레인 염색 혼합물의 800 마이크로리터를 추가합니다.
호일로 접시를 덮고 접시를 실온에서 15 분 동안 둡니다. 그 후, 각 우물에서 염료 미디어 혼합물을 흡인하고 각 우물에 수정 된 Tyrode의 용액1 밀리리터를 추가합니다. 호일로 덮습니다.
현미경, 아크 램프, 하이퍼 스위치, 형광 인터페이스 시스템, MyoCam 전원 공급 장치, 필드 자극기 및 컴퓨터의 순서로 장비를 켭니다. 여기 방출 필터 세트가 이미징 염료에 적합한지 확인하십시오. 예를 들어, fura-2는 340 나노미터 및 380 나노미터의 빛으로 흥분됩니다.
그것은 빛의 510 나노 미터에서 방출한다. 플루오-4와 전압 멤브레인 염료는 485 나노미터의 빛으로 흥분되고 520 나노미터의 빛에서 방출됩니다. 진공을 켜고 호스 클램프를 완전히 열고, 매니폴드에 티로드의 용액으로 60밀리리터 주사기를 부드럽게 떨어뜨립니다.
칼슘 레코딩의 경우 표준 Tyrode의 솔루션을 사용하십시오. 전압 레코딩의 경우 수정된 Tyrode의 솔루션을 사용합니다. 라인 히터를 켭니다.
챔버의 난투가 적어도 15 분 동안 섭씨 36 플러스 또는 마이너스 1도되도록 온도를 유지합니다. 다음으로 인수 소프트웨어를 엽니다. 올바른 이미징 염료에 대한 매개 변수가 설정되어 있는지 확인합니다.
자극을 끕니다. 어둠 속에서 6웰 플레이트에서 호일을 제거하고 변속실에 덮개 슬립을 놓습니다. 현미경 아래에 접시를 놓고 10X 목표를 사용하여 심근세포에 초점을 맞춥니다.
한 번 초점에, 하나의 hertz와 0.2 볼트에서 자극 필드로 속도를 시작합니다. 일대일 페이징이 얻어질 때까지 전압을 점진적으로 증가시다. 그런 다음 임계값에 도달할 때까지 전압을 증가시면 됩니다.
10X 목표에서 40X 목표로 전환합니다. 일대일 속도를 따르는 셀에 집중합니다. 플라스틱 음영을 조정하여 하나의 셀만 시야에 있도록 합니다.
소프트웨어를 사용하여 관심 상자 영역을 잘 정의된 사혜성에 배치합니다. 수집 소프트웨어를 시작하여 흥분 광을 시작합니다. 중립 밀도 필터를 사용하여 강도 설정을 적절히 조정하여 적절한 신호 대 잡음 비율을 얻습니다.
여기서, 대표적인 칼슘 및 사코프레 쇼트트레이스는 후라-2를 이용한 C57BL/6 마우스 심사이클로부터 기록된 것을 나타내고 있다. C57BL/6 마우스와 그들의 형질전환 쓰레기 동료에게서 얻은 앙상블 평균 데이터의 정량화는 10 헤르츠 속도에서 휴식 시간을 제외하고는 단 사이 아무 차이가 없음을 보여줍니다. 10 헤르츠에서 진행된 C57BL/6 마우스 심근세포로부터 기록된 전압 추적은 사용 가능한 신호를 얻기 위해 사후 처리되었다.
로우 패스 버터워스 또는 사비츠키 골레이 디지털 필터가 적용된 후 이 앙상블의 평균 액션 잠재력은 액션 잠재력의 미묘한 차이를 보여줍니다. 한 헤르츠에서 진행된 쥐 심낭에서 기록된 흔적은 칼슘 신호보다 낮은 전압 신호 이외에, 수축 운동학도 다르다. 이는 칼슘 염료 가압 칼슘을 완충하고 전압 염료는 그렇지 않기 때문입니다.
칼슘과 마찬가지로, 심근세포는 광학 작용 의 잠재적 인 기간에 종속적 변화를 진행입증. 약물 유발 된 작업 잠재력의 연장도 입증되었다. 20초 간의 녹화의 마지막 11초는 심근세포가 청색광에 장기간 노출되면 트리거된 활동으로 이어진다는 것을 나타냅니다.
이 절차를 시도할 때 기억해야 할 가장 중요한 것은 가능한 가장 낮은 강도의 빛을 사용하여 심근세포가 손상되지 않도록 하는 것입니다. 우리의 접근을 사용하여 분리된 근구는 또한 면역히스토케를 위해 이용되거나 서양 얼룩 분석을 위해 수행될 수 있습니다. 이 기술의 아름다움은, 연구원은 분자와 유전자의 다양성이 단일 시스템을 사용하여 흥분 수축 커플링을 어떻게 돕는지 빠르게 평가할 수 있게 합니다.
