Optisk avbildning av isolert murine ventrikkel myocytter

Hjertesvikt er den viktigste dødsårsaken for både menn og kvinner i verden. Nye bevis tyder på endring i hjerte- og systemisk metabolisme bidrar til patologien til hjertesvikt. Raskt identifisere hvilke metabolitter påvirker excitation-sammentrekning kobling er fortsatt en utfordring.

Den tradisjonelle tilnærmingen til å isolere hjerte myocytt fra voksen mus er en tidkrevende og utfordrende prosess. Den innovative metoden i denne artikkelen gjør en streng prosess mer effektiv og enklere å utføre. Videre, ved hjelp av fluorescerende sonde, kan vi utføre mange fenotypiske vurderinger av hvordan kjemikalier kan indusere hjertetoksisitet eller dysfunksjon på cellenivå.

Ved å identifisere hvilke molekyler som endrer myocyttfunksjonen, kan nye terapeutiske midler identifiseres for behandling av hjertesvikt. Ved hjelp av transgene mus kan vi undersøke forskjellige gener for å avgjøre hvilke som kan forebygge og bidra til hjertesvikt. Denne informasjonen vil være avgjørende i fremtiden herding av hjertesvikt.

Å demonstrere prosedyren vil være Matthew Klos og en student Shreyas Suresh. Til å begynne med tine den arbeidende lamininløsningen på is. Bruk en P1000 pipette, aspirer 200 mikroliter laminin og dra forsiktig pipettespissen langs den ene kanten av den steriliserte dekkslippen slik at kapillært kan trekke ut en minuscule mengde laminin for å lette dekksliptilbehøret til seksbrønnsplaten.

Fjern deretter den gjenværende lamininen i midten av dekkslippen i en sirkulær bevegelse. Spre laminindråpen over dekkglasset. Plasser dekkglassene i en 37 graders Celsius inkubator i minst en time og opptil 24 timer før isolasjonen.

For å isolere myocytter fra et forberedt hjerte i kaldt KHB-HB, plasser prøven under et stereomikroskop. For å forhindre emboli, prime aorta kanylen ved å senke den i KHB-HB-oppløsningen og bruke en 20 milliliter sprøyte for å tvinge oppløsningen gjennom. Pass på at hjertet er nedsenket og kanylen er primet før hjertet excision.

Med en 5 tang, kanylere hjertet. Bekreft riktig posisjonering av kanylen ved å visualisere spissen av kanylen omtrent en millimeter over aortainnsetting i ventrikkelen. Start deretter flyten av KHB-HB ved å rotere stoppekranen på Langendorf.

Koble kanylen til Langendorf for å perfuse hjertet i fem minutter. Deretter roterer du stoppekranen for å bytte perfusjonen fra KHB-HB-reservoaret til fordøyelsesbufferreservoaret. Når fordøyelsesbufferen når hjertet, sett en timer.

Samle perfusat i en steril 100 milliliter beger. Fyll på fordøyelsesbufferreservoaret etter behov med perfusat til fordøyelsestiden er utløpt. Etter fordøyelsen, i et sterilt 100 milliliter beger, skille hjertekamrene med tang og Iris saks.

Plasser hvert kammer i en egen brønn av en seks-brønns plate. Hell fem milliliter collagenaseløsning i hver brønn. Bruk umiddelbart saks til å hakke hjertevevet i biter på omtrent en kubikkmeter.

Ved hjelp av en steril overføring pipette, forsiktig triturate hakket hjertevev med fordøyelsen buffer. Når vevbitene blir hvite og fjærkledde, legg platen under et omvendt mikroskop for å undersøke cellene. Hvis antall levedyktige celler er større enn 80% fortsette å spenne cellene inn i en 50 milliliter konisk rør ved hjelp av en 100 mikron celle sil.

Hvis antall levedyktige celler er mindre enn 80%sjekk tiden det tok å kanylere. Hvis hermetuleringstiden er over fem minutter, prøv et annet hjerte. Hvis ikke, analyse nye collagenase spor gjennom collagenase prøvetaking programmet.

Deretter pellet cellene ved sentrifugering på 215 ganger g i to minutter. Pelleten skal være kompakt og ikke løs. Hvis pelleten er løs, inneholder preparatet mange døde celler.

I en vevskulturhette bruker du den kompakte pelleten i 10 milliliter stoppebuffer. Pellet cellene igjen ved sentrifugering på 215 ganger g i to minutter. Resuspend cellene i fem milliliter av plating buffer.

Utfør en celletelling på en cytoteller og juster volumet av platingbuffer for å nå en endelig myocyttkonsentrasjon på to ganger 10 til de fire cellene per milliliter. Fjern nå lamininbelagte dekkglass fra inkubatoren. Aspirer laminindråpen hvis den er tilstede.

Plate 200 mikroliter myocytt suspensjon på hver dekkslipp. Plasser dekkglassene i en 37 graders Celsius inkubator med 21% oksygen og 5% karbondioksid i to timer for å tillate vedlegg. Etter to timer, ta ut dekkglassene og aspirer de ufestede cellene.

Legg til to milliliter kulturmedier og kultur i inkubatoren ved 37 grader Celsius i opptil fire dager. Fjern først komponent A og komponent B fra membranpotensialets sett. I et konisk rør på 15 milliliter kombinerer du 50 mikroliter komponent B og fem mikroliter av komponent A for å danne en spenningsfargeblanding.

Vortex å blande. Tilsett 10 milliliter med plating media til 15 milliliter konisk rør som inneholder spenningsfargeblandingen for å danne membranens potensielle fargestoffblanding. Igjen, vortex å blande.

Fjern deretter en seksbrønns tallerken med myocytter fra inkubatoren. Aspirer media. Tilsett 800 mikroliter av membranens potensielle fargestoffblanding til hver brønn.

Dekk platen med folie og la platen stå ved romtemperatur i 15 minutter. Deretter aspirerer fargemedieblandingen fra hver brønn og legger til en milliliter modifisert Tyrodes løsning til hver brønn. Dekk med folie.

Slå på utstyret i rekkefølgen av mikroskop, buelampe, HyperSwitch, fluorescens grensesnittsystem, MyoCam strømforsyning, feltstimulator og datamaskin. Kontroller at eksitasjonsfiltersettene passer for bildefargestoffet. Fura-2 er for eksempel spent på 340 nanometer og 380 nanometer lys.

Det avgir ved 510 nanometer lys. Fluo-4 og spenningsmembranfargen er begeistret for 485 nanometer lys og avgir ved 520 nanometer lys. Prime opptakssystemet ved å slå på vakuumet, åpne slangeklemmen helt og forsiktig stupe hver 60 milliliter sprøyte med Tyrodes oppløsning i manifolden.

For kalsiumopptak, bruk standard Tyrodes løsning. For spenningsopptak, bruk modifisert Tyrodes løsning. Slå på i linjevarmeren.

Opprettholde temperaturen slik at perfusate i kammeret er på 36 pluss eller minus en grad Celsius i minst 15 minutter. Deretter åpner du anskaffelsesprogramvaren. Kontroller at parameterne er angitt for riktig bildefarge.

Slå av stimulatoren. I mørket, fjern folien fra seks-brønnsplaten og legg en dekkslips i pacing kammeret. Plasser platen under et mikroskop og fokuser på myocytter ved hjelp av 10X-målet.

Når du er i fokus, start tempoet etter felt stimulere på en hertz og 0,2 volt. Gradvis øke spenningen til en en-til-en pacing er oppnådd. Øk deretter spenningen til 1,5 ganger terskelen er nådd.

Bytt fra 10X-målet til 40X-målet. Fokuser på en celle som følger en en-til-en-tempo. Juster plastnyansene slik at bare én celle er i synsfeltet.

Bruk programvaren til å plassere interesseområdet på veldefinerte sarcomeres. Start oppkjøpsprogramvaren for å starte eksitasjonslyset. Bruk de nøytrale tetthetsfiltrene til å justere intensitetsinnstillingen tilsvarende for å oppnå et tilstrekkelig signal-til-støy-forhold.

Her vises de representative kalsium- og sarcomere-forkortingssporene som er registrert fra C57BL/6-muse myocytter ved hjelp av fura-2. En kvantifisering av ensemble gjennomsnitt data hentet fra C57BL/ 6 mus og deres transgene kull kamerater viser ingen forskjell mellom gruppene bortsett fra avslapningstid på 10 hertz pacing. Spenningen sporing registrert fra en C57BL / 6 mus myocyte tempoet på 10 hertz ble post behandlet for å få et brukbart signal.

Ensemblet gjennomsnittlig handlingspotensial etter en lav pass Butterworth eller en Savitzky-Golay digital filter ble brukt viser subtile forskjeller i form av handlingen potensialer. Sporene som er registrert fra rotte myocytter tempoet på en hertz viser i tillegg til spenningssignalet er lavere enn kalsiumsignalet, sammentrekning kinetikk er også forskjellige. Dette skyldes at kalsiumfargestoffer bufrer kalsium mens spenningsfargestoffer ikke gjør det.

Som med kalsiumtransienten viste myocytter pacing avhengige endringer i deres optiske virkning potensiellvarighet. Legemiddelindusert forlengelse av handlingspotensialet ble også demonstrert. De siste 11 sekundene av et 20-sekunders opptak indikerte at langvarig eksponering av myocytter til blått lys fører til utløst aktivitet.

Når du prøver denne prosedyren, er det viktigste å huske å bruke lavest intensitetslys mulig, slik at du ikke skader myocytter. Myocyte isolert ved hjelp av vår tilnærming kan også brukes til immunohistochemistry eller utføres for vestlig flekkanalyse. Det fine med denne teknikken, det tillater forskere å raskt vurdere hvordan mangfoldet av molekyler og gener hjelpe eksitasjon-sammentrekning kobling ved hjelp av et enkelt system.