Optisk avbildning av isolerade murina ventrikulär myocyter

Hjärtsvikt är den vanligaste dödsorsaken för både män och kvinnor i världen. Nya bevis tyder på förändring i hjärt och systemisk metabolism bidra till patologi hjärtsvikt. Snabbt identifiera vilka metaboliter påverkar excitation-kontraktion koppling är fortfarande en utmaning.

Den traditionella metoden att isolera hjärt myocyte från vuxna mus är en tidskrävande och utmanande process. Den innovativa metoden i denna artikel gör en stringent process effektivare och enklare att utföra. Vidare, med hjälp av fluorescerande sond, vi kan utföra många fenotypiska bedömningar av hur kemikalier kan framkalla hjärt toxicitet eller dysfunktion på cellnivå.

Genom att identifiera vilka molekyler som ändrar myocytefunktion kan nya terapier identifieras för behandling av hjärtsvikt. Med hjälp av transgena möss kan vi undersöka olika gener för att avgöra vilka som kan förebygga och bidra till hjärtsvikt. Denna information kommer att vara avgörande i framtiden bota hjärtsvikt.

Demonstrera förfarandet kommer att Matthew Klos och en student Shreyas Suresh. Till att börja tina arbetslamininlösningen på is. Använd en P1000-pipett, aspirera 200 mikroliter av laminin och dra försiktigt pipettspetsen längs den ena kanten av den steriliserade täckplattan för att tillåta kapillärverkan för att dra ut en minimal mängd laminin för att underlätta täckplasttillsats till sex-brunnsplattan.

Utvisa sedan den återstående lamininen i mitten av täcket i en cirkulär rörelse. Sprid laminindroplet över täcket. Placera täckskydden i en 37 grader Celsius inkubator i minst en timme och upp till 24 timmar före isoleringen.

För att isolera myocyter från ett förberett hjärta i kallt KHB-HB, placera provet under ett stereomikroskop. För att förhindra emboli, prime aorta kanylen genom att dränka den i KHB-HB lösningen och använda en 20 milliliter spruta för att tvinga lösningen igenom. Se till att hjärtat är nedsänkt och kanylen primas före hjärtat excision.

Med en 5 typpor, kannulate hjärtat. Bekräfta korrekt positionering av kanylen genom att visualisera spetsen på kanylen ungefär en millimeter ovanför aortainfogning i ventrikeln. Starta sedan flödet av KHB-HB genom att rotera stopcock på Langendorf.

Anslut kanylen till Langendorf för att genomsyra hjärtat i fem minuter. Därefter roterar du stopcock för att växla perfusionen från KHB-HB-reservoaren till rötningsbuffertreservoaren. När matsmältningsbufferten når hjärtat, ställ in en timer.

Samla in perfusatet i en steril 100 milliliter bägare. Fyll på rötningsbuffertbehållaren efter behov med perfusatet tills rötningstiden har gått ut. Efter matsmältningen, i en steril 100 milliliter bägare, separera kamrarna i hjärtat med tlyktor och Iris sax.

Placera varje kammare i en separat brunn av en sex-brunnsplatta. Häll fem milliliter kollagenaslösning i varje brunn. Använd omedelbart sax för att finhacka hjärtvävnaden i bitar av cirka en kubikmeter.

Med hjälp av en steril överföringspipett, triturtera försiktigt den malda hjärtvävnaden med matsmältningsbuffert. När vävnaden bitar blir vita och fjäderlätt, placera plattan under en inverterad mikroskop för att undersöka cellerna. Om antalet livskraftiga celler är större än 80%fortsätter att sila cellerna i en 50 milliliter koniska röret med hjälp av en 100 mikron cell sil.

Om antalet livskraftiga celler är mindre än 80% kontrollera den tid det tog att cannulate. Om kanyleringstiden är över fem minuter, prova ett annat hjärta. Om inte, assay nya kollagenas slitsar genom kollagenas provtagningsprogram.

Därefter pellet cellerna genom centrifugering vid 215 gånger g i två minuter. Pelleten ska vara kompakt och inte lös. Om pelleten är lös innehåller preparatet många döda celler.

I en vävnadskulturhuva, resuspend den kompakta pelleten i 10 milliliter stoppbuffert. Pellet cellerna igen genom centrifugering vid 215 gånger g i två minuter. Resuspend cellerna i fem milliliter av plätering buffert.

Utför en cellräkning på en cytoräknare och justera volymen av pläteringsbuffert för att nå en slutlig myocytekoncentration på två gånger 10 till de fyra cellerna per milliliter. Ta nu bort de lamininbelagda täcksliparna från inkubatorn. Aspirera laminindroplet om det finns.

Plate 200 mikroliter av myocyte suspension på varje coverslip. Placera täcklinerna i en 37 grader Celsius inkubator med 21%syre och 5%koldioxid i två timmar för att möjliggöra fastsättning. Efter två timmar, ta ut täcken och aspirera de obundna cellerna.

Lägg till två milliliter av kulturmedia och kultur i inkubatorn vid 37 grader Celsius i upp till fyra dagar. Ta först bort komponent A och komponent B från membranpotentialsatsen. I en 15 milliliter koniska röret, kombinera 50 mikroliter av komponent B och fem mikroliter av komponent A för att bilda en spänning färgämne blandning.

Vortex att blanda. Tillsätt 10 milliliter pläteringsmedia till det 15 milliliter koniska röret som innehåller blandningen av spänningsfärgämnet för att bilda membranpotentialen dye-blandningen. Återigen, virvel att blanda.

Ta sedan bort en sex-brunnsplatta av myocyter från inkubatorn. Aspirera media. Tillsätt 800 mikroliter av membranet potentiella färgämne blandning till varje brunn.

Täck plattan med folie och låt plattan vara i rumstemperatur i 15 minuter. Därefter aspirera färgämnet media blandningen från varje brunn och tillsätt en milliliter av modifierade Tyrode lösning till varje brunn. Täck med folie.

Slå på utrustningen i storleksordningen mikroskop, båglampa, HyperSwitch, fluorescensgränssnittssystem, MyoCam strömförsörjning, fältstimulator, och dator. Se till att magnetiseringsutsläppsfilteruppsättningarna är lämpliga för bildfärgen. Till exempel är fura-2 upphetsad på 340 nanometer och 380 nanometer av ljus.

Den avger vid 510 nanometer av ljus. Fluo-4 och spänningsmembranet färgämnet är upphetsad vid 485 nanometer av ljus och avger vid 520 nanometer av ljus. Prime registreringssystemet genom att slå på vakuum, helt öppna slangklämman, och försiktigt störta varje 60 milliliter spruta med Tyrode lösning i grenröret.

För kalciuminspelningar, använd Standard Tyrodes lösning. För spänningsinspelningar, använd modifierad Tyrodes lösning. Slå på in line-värmaren.

Bibehåll temperaturen så att perfusatet i kammaren är på 36 plus eller minus en grad Celsius i minst 15 minuter. Öppna därefter förvärvsprogramvaran. Kontrollera att parametrarna är inställda för rätt bildfärg.

Stäng av stimulatorn. I mörkret, ta bort folien från sex-väl plattan och placera en täckskydd i pacing kammaren. Placera plattan under ett mikroskop och fokusera på myocyterna med hjälp av 10X-målsättningen.

Väl i fokus, börja pacing genom fält stimulerande på en hertz och 0,2 volt. Gradvis öka spänningen tills en en-till-en pacing erhålls. Öka sedan spänningen tills 1,5 gånger tröskeln uppnås.

Växla från målet 10X till målet 40X. Fokusera på en cell som följer en en-till-en pacing. Justera plastnyanserna så att bara en cell är i synfältet.

Med hjälp av programvaran, placera området av intresse rutan på väldefinierade sarkomerer. Starta förvärvsprogramvaran för att initiera excitationsljuset. Med hjälp av filterna för neutral densitet justerar du intensitetsinställningen i enlighet med detta för att få ett tillräckligt signal-brusförhållande.

Här visas de representativa kalcium- och sarkomeringsspåren som registrerats från C57BL/6-mus-myocyter med hjälp av fura-2. En kvantifiering av ensemble genomsnittsdata som erhållits från C57BL/6 möss och deras transgena kull kompisar visar ingen skillnad mellan grupperna med undantag för avkoppling tid på 10 hertz tempo. Spänningen spårning registreras från en C57BL/6 mus myocyte tempo på 10 hertz var post bearbetas för att erhålla en användbar signal.

Ensemblen genomsnitt åtgärder potential efter en låg pass Butterworth eller en Savitzky-Golay digitalt filter tillämpades visa subtila skillnader i form av åtgärden potentialer. De spår som registrerats från råtta myocyter tempo på en hertz visar förutom att spänningssignalen är lägre än kalcium signalen, sammandragningen kinetik är olika också. Detta beror på att kalcium färgämnen buffert kalcium medan spänning färgämnen inte.

Som med kalcium övergående, myocyter visat pacing beroende förändringar i deras optiska åtgärder potentiella varaktighet. Droginducerad förlängning av aktionspotentialen visades också. De sista 11 sekunderna av en 20-sekunders inspelning indikerade att långvarig exponering av myocyter för blått ljus leder till utlöst aktivitet.

När du försöker detta förfarande, det viktigaste att komma ihåg är att använda lägsta möjliga intensitet ljus så att du inte skadar myocyterna. Myocyte isolerade med hjälp av vår strategi kan också användas för immunohistokemi eller genomförs för Western blot analys. Skönheten i denna teknik, det gör det möjligt för forskare att snabbt bedöma hur olika molekyler och gener hjälpa excitation-kontraktionskoppling med hjälp av ett enda system.