İzole Murine Ventriküler Miyositlerin Optik Görüntülemesi

Kalp yetmezliği dünyada hem erkekler hem de kadınlar için önde gelen ölüm nedenidir. Yeni kanıtlar kardiyak ve sistemik metabolizmada değişiklik kalp yetmezliği patolojisine katkıda göstermektedir. Hangi metabolitlerin uyarma-daralma kaplinini etkilediğini hızla belirlemek hala zor.

Yetişkin fareden kardiyak miyositi izole etme geleneksel yaklaşım zaman alıcı ve zorlu bir süreçtir. Bu makaledeki yenilikçi yöntem, sıkı bir süreci daha verimli ve gerçekleştirmeyi kolaylaştırır. Ayrıca, floresan prob kullanarak, kimyasalların hücresel düzeyde kardiyak toksisite veya disfonksiyon neden olabilir nasıl birçok henotipik değerlendirmeler gerçekleştirebilirsiniz.

Hangi moleküllerin miyosit fonksiyonunu değiştirdiğini belirleyerek, kalp yetmezliğinin tedavisinde yeni terapötikler tanımlanabilir. Transgenik fareler kullanarak, kalp yetmezliğini önleyip katkıda bulunabilecek genleri belirlemek için farklı genleri inceleyebiliriz. Bu bilgi kalp yetmezliği gelecekte tedavi esastır.

Prosedürü gösteren Matthew Klos ve öğrenci Shreyas Suresh olacaktır. Başlamak için, buz üzerinde çalışan laminin çözeltisi çözültün. P1000 pipet kullanarak, 200 mikrolitre laminin aspire edin ve pipet ucunu steril coverslip'in bir kenarı boyunca hafifçe sürükleyerek kılcal damar hareketinin altı kuyulu plakaya kapak ekinini kolaylaştırmak için küçük miktarda laminin çıkarmasını bekleyin.

Sonra dairesel bir hareketle kapak merkezinde kalan laminin dışarı. Laminin damlacıkını kapak lı kayanın her tarafına yayın. Kapaklar izolasyondan önce en az bir saat ve 24 saat kadar 37 derecelik bir kantitöre yerleştirin.

Soğuk KHB-HB'de miyositleri hazır bir kalpten izole etmek için örneği stereo mikroskop altına yerleştirin. Emboli önlemek için, KHB-HB çözeltisi içinde batırarak ve çözelti zorlamak için 20 mililitreşlik şırınga kullanarak aort kanül astar. Kalbin su altında olduğundan ve kanülkalp eksizyonu önce astarlı olduğundan emin olun.

5 forceps ile, kalp kanül. Kanülün ucunu ventriküle aort eklemenin yaklaşık bir milimetre üzerinde görselleştirerek kanülün doğru konumlandırın. Sonra Langendorf üzerinde stopcock döndürerek KHB-HB akışını başlatın.

Kanülleri Langendorf'a bağlayın ve kalbi beş dakika perfüzyonlayın. Daha sonra, khb-HB rezervuarından sindirim tampon deposuna perfüzyon geçmek için stopcock döndürün. Sindirim tamponu kalbe ulaştığında, bir zamanlayıcı ayarlayın.

Steril bir 100 mililitrelik beher perfusate toplamak. Sindirim süresi dolana kadar perfusate ile gerektiği gibi sindirim tampon rezervuar yeniden doldurun. Sindirim den sonra, steril bir 100 mililitrelik beher, forceps ve Iris makas ile kalp odaları ayırın.

Her odayı altı kuyuluktan ayrı bir kuyuya yerleştirin. Her kuyuya beş mililitre kollajenaz çözeltisi dökün. Hemen yaklaşık bir metreküp parçalar halinde kalp dokusu kıyma makas kullanın.

Steril transfer pipetkullanarak, hafifçe sindirim tampon ile kıyılmış kalp dokusu triturate. Doku parçaları beyaz ve tüylü hale geldikten sonra, hücreleri incelemek için ters bir mikroskop altında plaka yerleştirin. Canlı hücre sayısı% 80'den fazla ise 100 mikron hücresüz kullanarak 50 mililitrekonik tüp içine hücreleri zorlanma devam edin.

Canlı hücre sayısı %80'den azsa kanüle sokulmak için geçen süreyi kontrol edin. Kanülasyon süresi beş dakikadan fazlaysa, başka bir kalp dene. Değilse, kollajenaz örnekleme programı ile yeni kollajenaz yuvaları saymak.

Daha sonra, iki dakika için 215 kez g santrifüj ederek hücreleri pelet. Pelet kompakt ve gevşek olmamalıdır. Pelet gevşek ise, hazırlık birçok ölü hücreleri içerir.

Bir doku kültürü başlık olarak, durdurma tampon 10 mililitre kompakt pelet resuspend. İki dakika boyunca 215 kez g santrifüj ederek hücreleri tekrar pelet. Beş mililitre kaplama tamponundaki hücreleri yeniden askıya alın.

Bir sito sayacı üzerinde bir hücre sayımı gerçekleştirin ve mililitre başına dört hücre iki kez 10 son bir miyosit konsantrasyonu ulaşmak için kaplama tampon hacmini ayarlayın. Şimdi kuvözden laminin kaplı kapakları çıkarın. Varsa laminin damlacık aspire.

Her kapak ta 200 mikrolitre miyosit süspansiyonu. Eki izin vermek için iki saat boyunca% 21 oksijen ve% 5 karbondioksit ile 37 derece Santigrat kuvöz kapakları yerleştirin. İki saat sonra, kapakları çıkarmak ve bekar hücreleri aspire.

Dört güne kadar 37 santigrat derecede kuvözde iki mililitre kültür medyası ve kültürü ekleyin. İlk olarak, membran potansiyel kitinden Bileşen A ve Bileşen B'yi çıkarın. 15 mililitrelik konik bir tüpte, 50 mikrolitre B bileşeni ni ve a bileşeninin beş mikrolitresini birleştirerek voltaj boyakarışımı oluşturur.

Girdap karıştırmak için. Membran potansiyel boya karışımını oluşturmak için voltaj boyası karışımını içeren 15 mililitrekonik tüpe 10 mililitre kaplama ortamı ekleyin. Yine, girdap karıştırmak için.

Sonra kuvözden bir tane altı kuyuluk miyosit tabağı çıkarın. Medyayı aspire edin. Her kuyuya membran potansiyel boya karışımından 800 mikrolitre ekleyin.

Plakayı folyo ile kaplayın ve tabağı oda sıcaklığında 15 dakika bekletin. Bundan sonra, her kuyudan boya medya karışımı aspire ve her iyi değiştirilmiş Tyrode çözeltisi bir mililitre ekleyin. Folyo ile kaplayın.

Mikroskop, ark lambası, HyperSwitch, floresan arayüz sistemi, MyoCam güç kaynağı, alan uyarıcı ve bilgisayar sırasına göre ekipmanı açın. Uyarma emisyon filtre kümelerinin görüntüleme boyası için uygun olduğundan emin olun. Örneğin, fura-2 340 nanometre ve 380 nanometre ışık ta heyecanlanıyor.

510 nanometre ışık yayıyor. Fluo-4 ve voltaj membran boyası 485 nanometre ışıkta heyecanlanır ve 520 nanometre ışıkya yayılmaktadır. Vakumu açarak, hortum kelepçesini tamamen açarak ve tyrode'un solüsyonuyla her 60 mililitrelik şırıngayı manifolda yavaşça dalarak kayıt sistemini prime.

Kalsiyum kayıtları için standart Tyrode çözeltisi kullanın. Voltaj kayıtları için modifiye Tyrode'un çözeltisi kullanın. Sıralı ısıtıcıyı açın.

En az 15 dakika boyunca odada perfusate 36 artı veya eksi bir derece santigrat olacak şekilde sıcaklık koruyun. Ardından, satın alma yazılımını açın. Parametrelerin doğru görüntüleme boyası için ayarlandıkundan emin olun.

Uyarıcıyı kapat. Karanlıkta, altı kuyuplakadan folyo çıkarın ve pacing odasına bir coverslip yerleştirin. Bir mikroskop altında plaka yerleştirin ve 10X hedefi kullanarak miyosit ler üzerinde odaklanmak.

Bir kez odak, bir hertz ve 0.2 volt alan uyarıcı tarafından pacing başlar. Bire bir tempo elde edilene kadar voltajı kademeli olarak artırın. Daha sonra gerilimi 1,5 kat eşiğe ulaşın.

10X hedefinden 40X hedefine geçin. Bire bir tempoyu takip eden bir hücreye odaklanın. Plastik tonları, görüş alanında yalnızca bir hücre olacak şekilde ayarlayın.

Yazılımı kullanarak, iyi tanımlanmış sarcomeres üzerinde ilgi alanı kutusu yerleştirin. Uyarma ışığını başlatmak için satın alma yazılımını başlatın. Nötr yoğunluk filtrelerini kullanarak, yeterli sinyal-gürültü oranı elde etmek için yoğunluk ayarını buna göre ayarlayın.

Burada fura-2 kullanılarak C57BL/6 fare miyositlerinden kaydedilen temsili kalsiyum ve sarcomere kısaltma izleri gösterilmiştir. C57BL/6 farelerinden ve transgenik çöp arkadaşlarından elde edilen topluluk ortalama verilerinin ölçülmesi, 10 hertz pacing'deki gevşeme süresi dışında gruplar arasında fark göstermez. 10 hertz'de tempolu bir C57BL/6 fare miyositinden kaydedilen voltaj takibi kullanılabilir bir sinyal elde etmek için işlendi.

Topluluk düşük geçiş Butterworth veya Savitzky-Golay dijital filtre uygulandıktan sonra eylem potansiyeli ortalama eylem potansiyelleri eylem potansiyelleri şeklinde ince farklılıklar göstermek uygulanır. Bir hertz'de ilerleyen fare miyositlerinden kaydedilen izler, kalsiyum sinyalinden daha düşük olan gerilim sinyaline ek olarak, daralma kinetiği de farklıdır. Bunun nedeni kalsiyum boyaları tampon kalsiyum ise voltaj boyaları yok olmasıdır.

Kalsiyum geçici olduğu gibi, miyositler optik eylem potansiyel süresi nde pacing bağımlı değişiklikler gösterdi. Uyuşturucuya bağlı eylem potansiyelinin uzaması da gösterilmiştir. 20 saniyelik kaydın son 11 saniyesi miyositlerin mavi ışığa uzun süre maruz kalmasının tetikleyici aktiviteye yol açtığını gösterdi.

Bu prosedürü denerken, hatırlanması gereken en önemli şey miyositlere zarar vermemek için mümkün olan en düşük yoğunluklu ışığı kullanmaktır. Yaklaşımımızı kullanarak izole edilmiş miyosit immünohistokimya için de kullanılabilir veya Batı leke analizi için yapılabilir. Bu tekniğin güzelliği, araştırmacıların molekül ve genlerin çeşitliliğinin tek bir sistem kullanarak uyarma-daralma kaplinine nasıl yardımcı olduğunu hızla değerlendirmelerine olanak tanır.