Name: quaternary structure modeling through chemical cross-linking mass spectrometry: extending tx-ms jupyter reports
Uploaded: 2021-10-20T13:00:00
Duration: 5 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quaternary Structure Modeling Through Chemical Cross-Linking Mass Spectrometry: Extending TX-MS Jupyter Reports at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Stiftelsen Knut og Alice Wallenberg (tilskuddsnr. 2016.0023) og Swiss National Science Foundation (tilskuddsnr. P2ZHP3_191289). I tillegg takker vi S3IT, Universitetet i Zürich, for sin beregningsinfrastruktur og tekniske støtte.

1. Send inn arbeidsflyt på https://txms.org.
<ol><li>Gå til https://txms.org og klikk Bruk Cheetah-MS.</li>
	<li>Hvis du vil sende inn arbeidsflyt, må du oppgi to PDB-filer og én MS/MS mzML- eller MGF-fil. Du kan også klikke på "last inn eksempeldata" for å se demoversjonen av arbeidsflyten. MERK: Se på den manuelle siden på webserveren for detaljert informasjon om hvordan du sender inn en jobb. Webserveren støtter forskjellige ikke-cleavable cross-linker agenter, opptil 12 post-oversettelsesendringer (PTMer), alternativer relatert til beregningsmodellering og MS-dataanalyse. Små hjelpeknapper er også utformet på send-siden for å vise mer informasjon om hvert alternativ.</li>
</ol>2. Kjør Cheetah-MS.
MERK: Konverter de leverandørspesifikke formatene til mzML eller MGF ved hjelp av ProteoWizard MSConvert-programvaren19.
<ol><li>Last opp MS-dataene til https://txms.org. Klikk deretter på "Velg fil" og velg MS-dataene, som må være i mzML / MGF-dataformatene18. MERK: Eksempeldata er tilgjengelige på https://txms.org. Disse dataene er også direkte tilgjengelige via zenodo.org, DOI 10.5281/zenodo.3361621.</li>
	<li>Last opp to PDB-filer til https://txms.org. Klikk på "Velg fil" og velg PDB-filene som skal lastes opp. MERK: Hvis det ikke finnes noen eksperimentelle strukturer, kan du lage modeller ved hjelp av for eksempel SWISS-MODEL20 hvis homologstrukturer er tilgjengelige, eller trRosetta 21,22 eller Robetta23,24 webservere for de novo struktur spådommer.</li>
	<li>Send inn en ny arbeidsflyt. Klikk på "Send" for å motta en jobbidentifikator-tag. Deretter følger du skjemaet til resultatinndelingen ved hjelp av denne koden. MERK: Databehandling av resultatet tar tid, så vent til arbeidsflyten er ferdig, og lagre jobbidentifikatorkoden for å gå tilbake til resultatsiden. Beregningen utføres på ekstern databehandlingsinfrastruktur. Hvis du vil kjøre TX-MS lokalt, kan du se Hauri et al.10.</li>
	<li>Undersøk Jupyter Notebook-rapporten ved hjelp av den elektroniske seeren. Bla deretter ned til «Rapport» i resultatdelen ved hjelp av jobbidentifikator-taggen.</li>
</ol>3. Installer JupyterHub.
<ol><li>Monter dokkingstasjonen som anvist på https://docs.docker.com/install/.</li>
	<li>Last ned JupyterHub docker-beholderen med Jupyter openBIS25-utvidelsen. Den generelle kommandoen er "docker pull malmstroem/jove:latest", men kan variere på andre plattformer. MERK: Hvis du vil ha en generell diskusjon om hvordan du laster ned beholdere, kan du se https://www.docker.com/get-started. Det er også mulig å laste ned beholderen fra zenodo.org, DOI 10.5281/zenodo.3361621. MERK: Jupyter openBIS-kildekoden er tilgjengelig her: https://pypi.org/project/jupyter-openbis-extension/.</li>
	<li>Start dockerbeholderen: docker run -p 8178:8000 malmstroem/jove:latest. MERK: Porten som JupyterHub bruker som standard er 8000. Denne porten kan konfigureres, og kommandoene ovenfor må justeres tilsvarende hvis de endres. Port 8178 er et vilkårlig valg og kan endres. Eksempel-URL-adressene nedenfor må justeres tilsvarende.</li>
	<li>Gå til følgende adresse: http://127.0.0.1:8178. Logg inn med brukernavnet "bruker" og passordet "bruker". MERK: Adressen http://127.0.0.1 innebærer at dockerbeholderen kjører på den lokale datamaskinen. Hvis dockerbeholderen kjøres på en server, bruker du serverens IP-adresse eller URL-adresse (f.eks. https://example.com). Docker-beholderen er basert på Ubuntu Bionic 18.04, JupyterHub 0.9.6 og Jupyter openBIS-utvidelse 0.2. Det er mulig å installere dette i andre operativsystemer, men dette ble ikke testet.</li>
</ol>4. Last ned rapporten.
<ol><li>Opprett en ny notatblokk ved å klikke Ny| Python 3 ved hjelp av menyen øverst til høyre på siden. Dette åpner en ny fane med en notatblokk som heter Uten navn (eller noe lignende).</li>
	<li>Klikk på "Konfigurer openBIS Connections" i Jupyter-verktøymenyen.</li>
	<li>Fyll ut navnet: txms; URL-adresse: https://txms.org; bruker: gjest; passord: guestpasswd.</li>
	<li>Klikk koble til.</li>
	<li>Velg den nye tilkoblingen og klikk på "Velg tilkobling."</li>
	<li>Søk etter rapportmalen (for eksempel /CHEETAH/WF70), og klikk Last ned. MERK: Du må justere rapportmalen basert på resultatene og rapporten du fikk fra å kjøre jobben din på Cheetah-MS-webserveren.</li>
	<li>Kjøre rapporten på nytt ved å klikke Celle | Kjør alle.</li>
</ol>5. Utvid rapporten.
<ol><li>Legge til en ny celle nederst: Celle | Sett inn nedenfor.</li>
	<li>Skriv inn den ønskede koden. Se for eksempel delen Representative resultater nedenfor.</li>
	<li>Utfør cellen ved å trykke SKIFT-ENTER.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Berman, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Protein+Data+Bank.">The Protein Data Bank.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 58 (6), 899-907 (2002).</li><li>Herzog, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Probing+of+a+Protein+Phosphatase+2A+Network+by+Chemical+Cross-Linking+and+Mass+Spectrometry.">Structural Probing of a Protein Phosphatase 2A Network by Chemical Cross-Linking and Mass Spectrometry.</a> Science. 337 (6100), 1348-1352 (2012).</li><li>Hoopmann, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kojak:+efficient+analysis+of+chemically+cross-linked+protein+complexes.">Kojak: efficient analysis of chemically cross-linked protein complexes.</a> Journal of Proteome Research. 14 (5), 2190-2198 (2015).</li><li>Seebacher, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+cross-linking+analysis+using+mass+spectrometry,+isotope-coded+cross-linkers,+and+integrated+computational+data+processing.">Protein cross-linking analysis using mass spectrometry, isotope-coded cross-linkers, and integrated computational data processing.</a> Journal of Proteome Research. 5 (9), 2270-2282 (2006).</li><li>Rinner, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+cross-linked+peptides+from+large+sequence+databases.">Identification of cross-linked peptides from large sequence databases.</a> Nature Methods. 5 (4), 315-318 (2008).</li><li>Walzthoeni, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=False+discovery+rate+estimation+for+cross-linked+peptides+identified+by+mass+spectrometry.">False discovery rate estimation for cross-linked peptides identified by mass spectrometry.</a> Nature Methods. 9 (9), 901-903 (2012).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+cross-linked+peptides+from+complex+samples.">Identification of cross-linked peptides from complex samples.</a> Nature Methods. 9 (9), 904-906 (2012).</li><li>Chu, F., Baker, P. R., Burlingame, A. L., Chalkley, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+Chimeras:+a+Bioinformatics+Strategy+for+Identification+of+Cross-linked+Peptides.">Finding Chimeras: a Bioinformatics Strategy for Identification of Cross-linked Peptides.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 9 (1), 25-31 (2010).</li><li>Holding, A. N., Lamers, M. H., Stephens, E., Skehel, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hekate:+Software+Suite+for+the+Mass+Spectrometric+Analysis+and+Three-Dimensional+Visualization+of+Cross-Linked+Protein+Samples.">Hekate: Software Suite for the Mass Spectrometric Analysis and Three-Dimensional Visualization of Cross-Linked Protein Samples.</a> Journal of Proteome Research. 12 (12), 5923-5933 (2013).</li><li>Hauri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+determination+of+quaternary+protein+structures+in+complex+biological+samples.">Rapid determination of quaternary protein structures in complex biological samples.</a> Nature Communications. 10 (1), 192 (2019).</li><li>R&#246;st, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OpenSWATH+enables+automated,+targeted+analysis+of+data-independent+acquisition+MS+data.">OpenSWATH enables automated, targeted analysis of data-independent acquisition MS data.</a> Nature Biotechnology. 32 (3), 219-223 (2014).</li><li>R&#246;st, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OpenMS:+a+flexible+open-source+software+platform+for+mass+spectrometry+data+analysis.">OpenMS: a flexible open-source software platform for mass spectrometry data analysis.</a> Nature Methods. 13 (9), 741-748 (2016).</li><li>Quandt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+synthetic+peptides+to+benchmark+peptide+identification+software+and+search+parameters+for+MS/MS+data+analysis.">Using synthetic peptides to benchmark peptide identification software and search parameters for MS/MS data analysis.</a> EuPA Open Proteomics. 5, 21-31 (2014).</li><li>Bradley, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+modeling+with+Rosetta+in+CASP6.">Free modeling with Rosetta in CASP6.</a> Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics. 61 (S7), 128-134 (2005).</li><li>Gray, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+protein-protein+docking.">High-resolution protein-protein docking.</a> Current Opinion in Structural Biology. 16 (2), 183-193 (2006).</li><li>Khakzad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cheetah-MS:+a+web+server+to+model+protein+complexes+using+tandem+cross-linking+mass+spectrometry+data.">Cheetah-MS: a web server to model protein complexes using tandem cross-linking mass spectrometry data.</a> Bioinformatics. , (2021).</li><li>Malmstr&#246;m, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+15:+Computational+Proteomics+with+Jupyter+and+Python.">Chapter 15: Computational Proteomics with Jupyter and Python.</a> Methods in Molecular Biology. 15, 237-248 (1977).</li><li>Martens, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mzML--a+community+standard+for+mass+spectrometry+data.">mzML--a community standard for mass spectrometry data.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 10 (1), (2011).</li><li>Chambers, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cross-platform+toolkit+for+mass+spectrometry+and+proteomics.">A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics.</a> Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).</li><li>Waterhouse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SWISS-MODEL:+homology+modelling+of+protein+structures+and+complexes.">SWISS-MODEL: homology modelling of protein structures and complexes.</a> Nucleic Acids Research. 46 (W1), W296-W303 (2018).</li><li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+protein+structure+prediction+using+predicted+interresidue+orientations.">Improved protein structure prediction using predicted interresidue orientations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (3), 1496-1503 (2020).</li><li>Koehler Leman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+modeling+and+design+in+Rosetta:+recent+methods+and+frameworks.">Macromolecular modeling and design in Rosetta: recent methods and frameworks.</a> Nature Methods. 17 (7), 665-680 (2020).</li><li>Chivian, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+CASP6+structures+using+automated+Robetta+protocols.">Prediction of CASP6 structures using automated Robetta protocols.</a> Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics. 61 (S7), 157-166 (2005).</li><li>Chivian, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+prediction+of+CASP-5+structures+using+the+Robetta+server.">Automated prediction of CASP-5 structures using the Robetta server.</a> Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics. 53 (S6), 524-533 (2003).</li><li>Bauch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=openBIS:+a+flexible+framework+for+managing+and+analyzing+complex+data+in+biology+research.">openBIS: a flexible framework for managing and analyzing complex data in biology research.</a> BMC Bioinformatics. 12, 468 (2011).</li><li>Lima, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIM-XL:+A+powerful+and+user-friendly+tool+for+peptide+cross-linking+analysis.">SIM-XL: A powerful and user-friendly tool for peptide cross-linking analysis.</a> Journal of Proteomics. 129, 51-55 (2015).</li><li>Happonen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+Streptococcus+pyogenes-human+protein-protein+interaction+map+reveals+localization+of+opsonizing+antibodies.">A quantitative Streptococcus pyogenes-human protein-protein interaction map reveals localization of opsonizing antibodies.</a> Nature Communications. 10, 2727 (2019).</li><li>Khakzad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+determination+of+Streptococcus+pyogenes+M1+protein+interactions+with+human+immunoglobulin+G+using+integrative+structural+biology.">Structural determination of Streptococcus pyogenes M1 protein interactions with human immunoglobulin G using integrative structural biology.</a> PLOS Computational Biology. 17 (1), E1008169 (2021).</li><li>Khakzad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cross-linking+MS+of+the+complement+system+MAC+assembled+on+live+Gram-positive+bacteria.">In vivo cross-linking MS of the complement system MAC assembled on live Gram-positive bacteria.</a> Frontiers in Genetics. 11, (2020).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Moderne databehandlingsarbeidsflyter er ofte komplekse, med flere verktøy fra mange forskjellige leverandører, komplekse gjensidige avhengigheter, høye datavolumer og mangefasetterte resultater. Følgelig blir det stadig vanskeligere å nøyaktig dokumentere alle trinnene som kreves for å oppnå et resultat, noe som gjør det vanskelig å reprodusere det gitte resultatet. Her demonstrerer vi en generell strategi som kombinerer automatiseringen og enkelheten til en automatisert arbeidsflyt som produserer en generisk rapport, med fleksibiliteten til å tilpasse rapporten på en reproduserbar måte.
Tre krav må oppfylles for at protokollen skal fungere: For det første må proteinene som er valgt for analyse samhandle på en slik måte at det kjemiske krysskoblingseksperimentet kan produsere krysskoblede arter med tilstrekkelig høy konsentrasjon for å bli oppdaget av massespektrometeret; forskjellige massespektrometre har forskjellige nivåer av deteksjon og er også avhengige av oppkjøpsprotokollen samt valget av krysskoblingsreagens. Den nåværende versjonen av TX-MS-protokollen tillater bare DSS, et lysin-lysin homobifunctional krysskoblingsreagens. Likevel skyldes denne begrensningen først og fremst muligheten for at maskinlæringstrinnet må justeres for andre reagenser. Denne begrensningen er forbedret i Cheetah-MS-webserveren, da ytterligere to krysskoblingsreagenser kan vurderes, men alle tre er ikke-cleavable reagenser. For det andre trenger de to proteinene enten å ha en eksperimentelt bestemt struktur eller modelleres ved hjelp av komparative modelleringsteknikker eller de novo-teknikker . Ikke alle proteiner kan modelleres, men en kombinasjon av forbedret programvare og en konstant avsetning av eksperimentelle strukturer i PDB utvider antall proteiner som kan modelleres. For det tredje bør de interagerende proteinene forbli tilstrekkelig like i sine bundne og ubundne tilstander, slik at dokkingalgoritmene som brukes av TX-MS og Cheetah-MS, kan skape kvartære strukturer av tilstrekkelig kvalitet for å muliggjøre poengregning. Dette kravet er relativt vagt, da akseptabel kvalitet er svært systemavhengig, hvor mindre proteiner av kjent struktur generelt er lettere å sammenligne enn større proteiner av ukjent struktur.
Ved et negativt resultat må du først kontrollere at TX-MS fant intrakoblinger, krysskoblinger mellom rester som er en del av samme polypeptidkjede. Hvis ingen blir oppdaget, er den mest sannsynlige forklaringen at noe gikk galt med prøveforberedelsen eller datainnsamlingen. Hvis flere avstandsbegrensninger ikke støtter modellene, må du visuelt inspisere modellene for å sikre at konformasjonen støttes av krysskoblede rester. Det er ingen åpenbar måte å dreie en av interaktivitetene uten å forstyrre minst en krysskobling. Hvis det er krysskoblinger lenger enn tillatt avstand for det gitte krysskoblingsreagenset, kan du prøve å forbedre modelleringen av interaktivitetene ved å inkorporere krysskoblingsdata.
Det er mulig å bruke alternative programmer for å oppnå tilsvarende resultater, forutsatt at følsomheten til den valgte programvaren er sammenlignbar med følsomheten til TX-MS. For eksempel er det online versjoner av RosettaDock, HADDOCK og andre. Det er også mulig å analysere kjemiske krysskoblingsdata gjennom xQuest/xProphet 5,6, plink7 og SIM-XL26.
Vi bruker kontinuerlig TX-MS og Cheetah-MS på nye prosjekter 27,28,29, og forbedrer dermed rapportene som produseres av disse tilnærmingene for å muliggjøre en mer detaljert analyse av resultatene uten å gjøre rapportene større.

Proteinproteininteraksjoner underbygger strukturen og funksjonen til biologiske systemer. Å ha tilgang til kvartære strukturer av proteiner kan gi innsikt i hvordan to eller flere proteiner samhandler for å danne høyordensstrukturer. Dessverre er det fortsatt utfordrende å skaffe kvartærstrukturer; Dette gjenspeiles i det relativt små antallet PDB-oppføringer (Protein DataBank)som inneholder mer enn ett polypeptid. Proteinproteininteraksjoner kan studeres med teknologier som røntgenkrystallografi, NMR og kryo-EM, men det kan være tidkrevende å oppnå tilstrekkelig mengde renset protein under forhold der metodene kan brukes.
Kjemisk krysskobling av massespektrometri ble utviklet for å innhente eksperimentelle data om proteinproteininteraksjoner med færre restriksjoner på prøvepreparering, da massespektrometri kan brukes til å skaffe data om vilkårlig komplekse prøver 2,3,4,5,6,7,8,9 . Imidlertid krever den kombinatoriske karakteren av dataanalysen og det relativt små antallet krysskoblede peptider at prøvene fraksjoneres før analyse. For å løse denne mangelen utviklet vi TX-MS, en metode som kombinerer beregningsmodellering med kjemisk krysskoblingsmassespektrometri10. TX-MS kan brukes på vilkårlig komplekse prøver og er betydelig mer følsom sammenlignet med tidligere metoder10. Det oppnår dette ved å score alle data knyttet til en gitt proteinproteininteraksjon som et sett i stedet for å tolke hvert MS-spektrum uavhengig. TX-MS bruker også opptil tre forskjellige MS-anskaffelsesprotokoller: høyoppløselig MS1 (hrMS1), dataavhengig anskaffelse (DDA) og datauavhengig anskaffelse (DIA), noe som ytterligere gir muligheter til å identifisere et krysskoblet peptid ved å kombinere flere observasjoner. Den beregningsbaserte arbeidsflyten TX-MS er kompleks av flere grunner. For det første er det avhengig av flere MS-analyseprogrammer 11,12,13 for å lage proteinstrukturmodeller 14,15. For det andre kan datamengden være betydelig. For det tredje kan modelleringstrinnet bruke betydelige mengder databehandlingskraft.
TX-MS brukes derfor best som en automatisert, forenklet databehandlingsarbeidsflyt gjennom Cheetah-MS webserver16 som kjører på store databehandlingsinfrastrukturer som dataskyer eller klynger. For å lette tolkningen av resultatene produserte vi en interaktiv Jupyter Notebook17. Her demonstrerer vi hvordan Jupyter Notebook-rapporten kan utvides for å gi en mer dyptgående analyse av et gitt resultat.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Two Protein DataBank files of the proteins of interest.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Example files available on txms.org and zenodo.org, DOI 10.5281/zenodo.3361621</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>An mzML data file acquired on a sample where the proteins of interest were crosslinked.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Example files available on txms.org or zenodo.org, DOI 10.5281/zenodo.3361621</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quaternary structure modeling through chemical cross-linking mass spectrometry: extending tx-ms jupyter reports

Proteinproteininteraksjoner kan være utfordrende å studere, men gir innsikt i hvordan biologiske systemer fungerer. Målrettet krysskobling av massespektrometri (TX-MS), en metode som kombinerer kvartær proteinstrukturmodellering og kjemisk krysskobling av massespektrometri, skaper strukturmodeller med høy nøyaktighet ved hjelp av data hentet fra komplekse, ukfraksjonerte prøver. Dette fjerner en av de store hindringene for proteinkompleksstrukturanalyse fordi proteinene av interesse ikke lenger trenger å renses i store mengder. Cheetah-MS webserver ble utviklet for å gjøre den forenklede versjonen av protokollen mer tilgjengelig for samfunnet. Med tanke på tandem-MS/MS-dataene genererer Cheetah-MS en Jupyter Notebook, en grafisk rapport som oppsummerer de viktigste analyseresultatene. Utvidelse av Jupyter bærbar PC kan gi mer dyptgående innsikt og bedre forstå modellen og massespektrometridataene som støtter den. Den tekniske protokollen som presenteres her demonstrerer noen av de vanligste utvidelsene og forklarer hvilken informasjon som kan fås. Den inneholder blokker for å analysere tandem MS / MS-innsamlingsdata og den totale effekten av de oppdagede XLene på de rapporterte kvartære modellene. Resultatet av slike analyser kan brukes på strukturelle modeller som er innebygd i den bærbare PCen ved hjelp av NGLView.

TX-MS gir strukturelle utdata som støttes av MS-avledede eksperimentelle begrensninger. Det fungerer ved å kombinere forskjellige MS-datainnsamlingstyper med beregningsmodellering. Derfor er det nyttig å analysere hver MS-data separat og gi visualisering av utdatastrukturen. Tilleggsdata 1 inneholder en eksempelnotatblokk som kan analysere DDA- og DIA-data produsert som TX-MS-utdata. Brukere kan velge XL av interesse. Ved å kjøre den bærbare PCen vil MS2-spekteret av den XL vises der forskjellige farger bidrar til å diskriminere mellom fragmenter relatert til det første peptidet, det andre peptidet og kombinatoriske fragmentioner. XL kan også tilordnes strukturen ved hjelp av NGLView-kontrollprogrammet som er innebygd i en Jupyter Notebook.
En annen celle i denne notatblokken kan hjelpe brukere med å analysere og visualisere DIA-data. Det er imidlertid vanskeligere å visualisere DIA-data fordi de analyserte dataene må utarbeides i riktig format.
Figur 1 viser en eksempelstruktur på M1 og albumin med topp-XLer tilordnet strukturen. TX-MS fikk alle XLer etter analyse av hrMS1-, DDA- og DIA-data, og RosettaDock-protokollen leverte beregningsmodellene.
Siden denne rapporten er en Jupyter Notebook, kan alle gyldige Python-koder legges til i nye notatblokkceller. Koden nedenfor vil for eksempel opprette et histogram over MS2-tellingene, som angir hvor godt støttet hver krysskobling er av de underliggende dataene. importere sjøbårne som sns sns.distplot(ms2['count']);
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60311/60311fig01.jpg"> Figur 1: Strukturell modell av Streptococcus pyogenes M1 protein og human albumin med XLs kartlagt på strukturen. M1-proteinet er vist i grått og utgjør en homodimer. De seks albuminmolekylene presenteres som par i forskjellige nyanser av blått. Krysskoblinger og avstander er gitt i rødt med svart tekst. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60311/60311fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Tilleggsfil. Jupyter-data for notatblokker. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60311/Supplementary%20Data%201.ipynb" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Quaternary Structure Modeling Through Chemical Cross-Linking Mass Spectrometry: Extending TX-MS Jupyter Reports at JoVE.com

Quaternary Structure Modeling Through Chemical Cross-Linking Mass Spectrometry: Extending TX-MS Jupyter Reports

Målrettet krysskobling av massespektrometri skaper kvartære proteinstrukturmodeller ved hjelp av massespektrometridata som er samlet inn ved hjelp av opptil tre forskjellige anskaffelsesprotokoller. Når resultatene utføres som en forenklet arbeidsflyt på Cheetah-MS-webserveren, rapporteres de i en Jupyter Notebook. Her demonstrerer vi de tekniske aspektene ved hvordan Jupyter Notebook kan utvides for en mer dyptgående analyse.

Kvartær strukturmodellering gjennom kjemisk krysskobling av massespektrometri: Utvide TX-MS Jupyter-rapporter

Protein-protein interactions can be challenging to study yet provide insights into how biological systems function. Targeted cross-linking mass ...

Denne metoden bruker kraften i Jupyter Notebook til å levere informative og visuelt tiltalende rapporter, samtidig som brukerne kan utvide og tilpasse rapporten på en reproduserbar og sporbar måte. Denne fleksible teknikken gjør at alle brukermodifikasjoner kan fanges opp i tilstrekkelig detalj til å reproduseres i en senere tidsramme eller av en annen bruker. Selv om denne metoden generelt gjelder på alle forskningsfelt, er den først og fremst designet for Mucor life science, et forskningsområde som kan produsere komplekse data.Før du begynner analysen, åpner du det målrettede nettstedet for massespektrometri på tvers av lenker. Når du navigerer til webområdet, vises en velkomstskjerm som gir en beskrivelse på høyt nivå av TX MS.web-tjenesten. Under opplæringsfanen kan en detaljert beskrivelse av tjenestene som tilbys, inkludert informasjon om hvordan du bruker tjenesten og hvordan du analyserer resultatene, observeres.Under nedlastingsfanen kan programvare og ressurser lastes ned. All programvaren er tilgjengelig under en åpen kildekode-lisens. Under Lisens-fanen gjør BSD 3-klausullisensen eksplisitt programvaren så bredt brukbar som mulig.Kategorien Kontakt inneholder kontaktinformasjon for sending av spørsmål eller kommentarer. Hvis du vil sende inn en e-postmelding som ber om brukerlegitimasjon, går du tilbake til Cheetah-fanen og klikker hyperkoblingen for e-postadressen nederst på siden. Skriv inn relevant informasjon i emnelinjen i brødteksten i e-posten.Et svar vil bli sendt så raskt som mulig. Etter å ha mottatt en bekreftelses-e-post med brukerlegitimasjonen, logger du på og laster opp massespektrometridataene til nettstedet. Klikk Send arbeidsflyt, og skriv inn en tittel og en beskrivelse.Klikk deretter vis arbeidsflyt, og velg Cheetah-arbeidsflyten. Når du har fulgt veiviseren, bruker du det elektroniske visningsprogrammet til å undersøke Jupyter Notebook. For å installere JupyterHub installere Docker som instruert og laste ned JupyterHub Docker-beholderen med Jupyter openBIS-utvidelsen.Etter å ha startet Docker kjører P8171:8000 malmstroem/jove:latest container. Naviger til den angitte nettadressen og logg inn med brukernavn og passord Bruker. Hvis du vil laste ned rapporten, klikker du ny i Python 3 for å åpne en ny fane med en notatblokk uten navn.Klikk konfigurer openBIS-tilkoblinger på Jupyter-verktøymenyen og skriv inn TX MS for navnet, TX MS-webadressen for URL-adressen, Gjest for brukeren og G-U-E-S-T-P-A-S-S-W-D for passordet. Velg den nye tilkoblingen, og klikk velg tilkobling for å søke etter rapporten. Klikk deretter, last ned i celle og kjør alle for å returnere rapporten.Hvis du vil utvide rapporten, klikker du cellen og setter inn nedenfor for å legge til en ny celle nederst. Klikk deretter kode og trykk SKIFT og skriv inn for å utføre cellen. Hvis du vil laste opp rapporten, klikker du opplastingsknappen for å opprette et nytt datasett.En representativ struktur av M1 og albumin med topp krysskoblinger kartlagt på strukturen vises her. Alle krysskoblingene ble oppnådd ved målrettet krysskobling av massespektrometri etter å ha analysert MS1-dataavhengige og uavhengige innsamlingsdata med høy oppløsning, og beregningsmodellene ble levert av RosettaDock-protokollen. Det er viktig å huske at proteinproteininteraksjoner er forskjellige når det gjelder stabilitet.Så derfor kan resultatene dine variere. Dagens metodikk er begrenset til binære interaksjoner og kan derfor ikke brukes på mer komplekse proteinkvarternære strukturer. Modellering av individuelle par kan imidlertid gi en god base for å bygge mer komplekse strukturer.Detaljer om bindingsgrensesnittet kan være nyttige på mange måter, for eksempel for å foreslå mutasjoner som enten kan stabilisere eller destabilisere proteininteraksjonene. Så dette kan være nyttig for å forstå rollen som proteinproteininteraksjoner bedre.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrospray-ionisering Hydrogen-deuterium Veksling massespektrometri for å studere Protein struktur og dynamikk

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Løse affinitetsrenset protein komplekser av Blå Native PAGE og Protein korrelasjon Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Lipid Droplet Isolasjon for Quantitative massespektrometri analyse

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Eksempel forberedelse til masse massespektrometri-baserte identifikasjon av RNA-bindende områder

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

Optimal utarbeidelse av Formalin fast prøver for peptid basert Matrix assistert Laser desorpsjon/ionisering massespektrometri Imaging arbeidsflyter

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Påvisning av protein ubiquitination nettsteder av peptid berikelse og masse spektrometri

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptide profilering og identifisering illustrert av angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

En plasmaprøve forberedelse for massespektrometri ved hjelp av en automatisert arbeidsstasjon

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Prøve forberedelse til sonde elektrospray ionisering massespektrometri

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Absolutt kvantifisering av Cell-fri protein syntese metabolisme av reversert-fase flytende kromatografi-Mass massespektrometri

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...