Name: quaternary structure modeling through chemical cross-linking mass spectrometry: extending tx-ms jupyter reports
Uploaded: 2021-10-20T13:00:00
Duration: 5 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quaternary Structure Modeling Through Chemical Cross-Linking Mass Spectrometry: Extending TX-MS Jupyter Reports at JoVE.com

Detta arbete stöddes av Knut och Alice Wallenbergs stiftelse (anslag nr 2016.0023) och Swiss National Science Foundation (anslag nr. P2ZHP3_191289). Dessutom tackar vi S3IT, Zürichs universitet, för dess beräkningsinfrastruktur och tekniska support.

1. Skicka arbetsflöde på https://txms.org.
<ol><li>Gå till https://txms.org och klicka på "Använd Cheetah-MS.".</li>
	<li>Om du vill skicka arbetsflöde måste du ange två PDB-filer och en MS/MS mzML- eller MGF-fil. Du kan också klicka på "ladda exempeldata" för att se demoversionen av arbetsflödet. OBS: Titta på webbserverns manuella sida för detaljerad information om hur du skickar in ett jobb. Webbservern stöder olika icke-klyvbara tvärlänkningsagenter, upp till 12 posttranslationella modifieringar (PTM), alternativ relaterade till beräkningsmodellering och MS-dataanalys. Små hjälpknappar är också utformade på skicka-sidan för att visa mer information om varje alternativ.</li>
</ol>2. Kör Cheetah-MS.
Konvertera de leverantörsspecifika formaten till mzML eller MGF med hjälp av ProteoWizard MSConvert-programvaran19.
<ol><li>Ladda upp MS-data till https://txms.org. Klicka sedan på "Välj fil" och välj MS-data, som måste finnas i mzML / MGF-dataformat18. OBS: Exempeldata finns tillgängliga på https://txms.org. Dessa data är också direkt tillgängliga via zenodo.org, DOI 10.5281/zenodo.3361621.</li>
	<li>Ladda upp två PDB-filer till https://txms.org. Klicka på "Välj fil" och välj PDB-filerna som ska laddas upp. OBS: Om det inte finns några experimentella strukturer, skapa modeller med till exempel SWISS-MODEL20 om homologstrukturer är tillgängliga, eller trRosetta 21,22 eller Robetta23,24 webbservrar för de novo-strukturförutsägelser.</li>
	<li>Skicka ett nytt arbetsflöde. Klicka på "Skicka" för att få en jobbidentifierartagg. Följ sedan formuläret till resultatavsnittet med den här taggen. Obs!: Det tar tid att beräkna resultatet, så vänta tills arbetsflödet är klart och lagra jobbidentifierartaggen för att återgå till resultatsidan. Beräkningen utförs på fjärrberäkningsinfrastruktur. Om du vill köra TX-MS lokalt, se Hauri et al.10.</li>
	<li>Granska Jupyter Notebook-rapporten med hjälp av onlinevisningsprogrammet. Rulla sedan ned till "Rapportera" i resultatavsnittet med hjälp av jobbidentifierartaggen.</li>
</ol>3. Installera JupyterHub.
<ol><li>Installera docker enligt anvisningarna i https://docs.docker.com/install/.</li>
	<li>Ladda ned JupyterHub docker-containern med Jupyter openBIS25-tillägget. Det allmänna kommandot är "docker pull malmstroem/jove:latest", men kan skilja sig åt på andra plattformar. OBS: För en allmän diskussion om hur man laddar ner containrar, se https://www.docker.com/get-started. Det är också möjligt att ladda ner behållaren från zenodo.org, DOI 10.5281/zenodo.3361621. Källkoden för Tillägget Jupyter openBIS finns här: https://pypi.org/project/jupyter-openbis-extension/.</li>
	<li>Starta dockercontainern: docker run -p 8178:8000 malmstroem/jove:latest. OBS: Porten som JupyterHub använder som standard är 8000. Den här porten kan konfigureras och kommandona ovan måste justeras i enlighet med detta om de ändras. Port 8178 är ett godtyckligt val och kan ändras. Exempel-URL:erna nedan måste justeras i enlighet med detta.</li>
	<li>Gå till följande adress: http://127.0.0.1:8178. Logga in med användarnamnet "användare" och lösenordet "användare". Adressen http://127.0.0.1 innebär att Docker-containern körs på den lokala datorn. Om Docker-containern körs på en server använder du serverns IP-adress eller URL (t.ex. https://example.com). Docker-containern baseras på Ubuntu Bionic 18.04, JupyterHub 0.9.6 och Jupyter openBIS-tillägget 0.2. Det är möjligt att installera detta i andra operativsystem, men detta testades inte.</li>
</ol>4. Ladda ner rapporten.
<ol><li>Skapa en ny anteckningsbok genom att klicka på Ny| Python 3 med hjälp av menyn som ligger nära den övre högra delen av sidan. Detta öppnar en ny flik med en anteckningsbok som heter Untitled (eller något liknande).</li>
	<li>Klicka på "Konfigurera openBIS-anslutningar" i Jupyter-verktygsmenyn.</li>
	<li>Fyll i namnet: txms; Webbadress: https://txms.org; användare: gäst; lösenord: guestpasswd.</li>
	<li>Klicka på "Anslut".</li>
	<li>Välj den nya anslutningen och klicka på "Välj anslutning."</li>
	<li>Sök efter rapportmallen (t.ex. /CHEETAH/WF70) och klicka på Ladda ned. OBS: Du måste justera rapportmallen baserat på de resultat och rapporter du fick från att köra ditt jobb på Cheetah-MS webbserver.</li>
	<li>Kör rapporten igen genom att klicka på Cell | Kör alla.</li>
</ol>5. Förläng rapporten.
<ol><li>Lägg till en ny cell längst ned: Cell | Infoga nedan.</li>
	<li>Skriv in den önskade koden. Ett exempel finns i avsnittet Representativa resultat nedan.</li>
	<li>Kör cellen genom att trycka på "Shift-Enter."</li>
</ol>

<ol>
	<li>Berman, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Protein+Data+Bank.">The Protein Data Bank.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 58 (6), 899-907 (2002).</li><li>Herzog, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Probing+of+a+Protein+Phosphatase+2A+Network+by+Chemical+Cross-Linking+and+Mass+Spectrometry.">Structural Probing of a Protein Phosphatase 2A Network by Chemical Cross-Linking and Mass Spectrometry.</a> Science. 337 (6100), 1348-1352 (2012).</li><li>Hoopmann, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kojak:+efficient+analysis+of+chemically+cross-linked+protein+complexes.">Kojak: efficient analysis of chemically cross-linked protein complexes.</a> Journal of Proteome Research. 14 (5), 2190-2198 (2015).</li><li>Seebacher, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+cross-linking+analysis+using+mass+spectrometry,+isotope-coded+cross-linkers,+and+integrated+computational+data+processing.">Protein cross-linking analysis using mass spectrometry, isotope-coded cross-linkers, and integrated computational data processing.</a> Journal of Proteome Research. 5 (9), 2270-2282 (2006).</li><li>Rinner, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+cross-linked+peptides+from+large+sequence+databases.">Identification of cross-linked peptides from large sequence databases.</a> Nature Methods. 5 (4), 315-318 (2008).</li><li>Walzthoeni, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=False+discovery+rate+estimation+for+cross-linked+peptides+identified+by+mass+spectrometry.">False discovery rate estimation for cross-linked peptides identified by mass spectrometry.</a> Nature Methods. 9 (9), 901-903 (2012).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+cross-linked+peptides+from+complex+samples.">Identification of cross-linked peptides from complex samples.</a> Nature Methods. 9 (9), 904-906 (2012).</li><li>Chu, F., Baker, P. R., Burlingame, A. L., Chalkley, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+Chimeras:+a+Bioinformatics+Strategy+for+Identification+of+Cross-linked+Peptides.">Finding Chimeras: a Bioinformatics Strategy for Identification of Cross-linked Peptides.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 9 (1), 25-31 (2010).</li><li>Holding, A. N., Lamers, M. H., Stephens, E., Skehel, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hekate:+Software+Suite+for+the+Mass+Spectrometric+Analysis+and+Three-Dimensional+Visualization+of+Cross-Linked+Protein+Samples.">Hekate: Software Suite for the Mass Spectrometric Analysis and Three-Dimensional Visualization of Cross-Linked Protein Samples.</a> Journal of Proteome Research. 12 (12), 5923-5933 (2013).</li><li>Hauri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+determination+of+quaternary+protein+structures+in+complex+biological+samples.">Rapid determination of quaternary protein structures in complex biological samples.</a> Nature Communications. 10 (1), 192 (2019).</li><li>R&#246;st, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OpenSWATH+enables+automated,+targeted+analysis+of+data-independent+acquisition+MS+data.">OpenSWATH enables automated, targeted analysis of data-independent acquisition MS data.</a> Nature Biotechnology. 32 (3), 219-223 (2014).</li><li>R&#246;st, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OpenMS:+a+flexible+open-source+software+platform+for+mass+spectrometry+data+analysis.">OpenMS: a flexible open-source software platform for mass spectrometry data analysis.</a> Nature Methods. 13 (9), 741-748 (2016).</li><li>Quandt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+synthetic+peptides+to+benchmark+peptide+identification+software+and+search+parameters+for+MS/MS+data+analysis.">Using synthetic peptides to benchmark peptide identification software and search parameters for MS/MS data analysis.</a> EuPA Open Proteomics. 5, 21-31 (2014).</li><li>Bradley, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+modeling+with+Rosetta+in+CASP6.">Free modeling with Rosetta in CASP6.</a> Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics. 61 (S7), 128-134 (2005).</li><li>Gray, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+protein-protein+docking.">High-resolution protein-protein docking.</a> Current Opinion in Structural Biology. 16 (2), 183-193 (2006).</li><li>Khakzad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cheetah-MS:+a+web+server+to+model+protein+complexes+using+tandem+cross-linking+mass+spectrometry+data.">Cheetah-MS: a web server to model protein complexes using tandem cross-linking mass spectrometry data.</a> Bioinformatics. , (2021).</li><li>Malmstr&#246;m, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+15:+Computational+Proteomics+with+Jupyter+and+Python.">Chapter 15: Computational Proteomics with Jupyter and Python.</a> Methods in Molecular Biology. 15, 237-248 (1977).</li><li>Martens, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mzML--a+community+standard+for+mass+spectrometry+data.">mzML--a community standard for mass spectrometry data.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 10 (1), (2011).</li><li>Chambers, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cross-platform+toolkit+for+mass+spectrometry+and+proteomics.">A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics.</a> Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).</li><li>Waterhouse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SWISS-MODEL:+homology+modelling+of+protein+structures+and+complexes.">SWISS-MODEL: homology modelling of protein structures and complexes.</a> Nucleic Acids Research. 46 (W1), W296-W303 (2018).</li><li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+protein+structure+prediction+using+predicted+interresidue+orientations.">Improved protein structure prediction using predicted interresidue orientations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (3), 1496-1503 (2020).</li><li>Koehler Leman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+modeling+and+design+in+Rosetta:+recent+methods+and+frameworks.">Macromolecular modeling and design in Rosetta: recent methods and frameworks.</a> Nature Methods. 17 (7), 665-680 (2020).</li><li>Chivian, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+CASP6+structures+using+automated+Robetta+protocols.">Prediction of CASP6 structures using automated Robetta protocols.</a> Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics. 61 (S7), 157-166 (2005).</li><li>Chivian, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+prediction+of+CASP-5+structures+using+the+Robetta+server.">Automated prediction of CASP-5 structures using the Robetta server.</a> Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics. 53 (S6), 524-533 (2003).</li><li>Bauch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=openBIS:+a+flexible+framework+for+managing+and+analyzing+complex+data+in+biology+research.">openBIS: a flexible framework for managing and analyzing complex data in biology research.</a> BMC Bioinformatics. 12, 468 (2011).</li><li>Lima, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIM-XL:+A+powerful+and+user-friendly+tool+for+peptide+cross-linking+analysis.">SIM-XL: A powerful and user-friendly tool for peptide cross-linking analysis.</a> Journal of Proteomics. 129, 51-55 (2015).</li><li>Happonen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+Streptococcus+pyogenes-human+protein-protein+interaction+map+reveals+localization+of+opsonizing+antibodies.">A quantitative Streptococcus pyogenes-human protein-protein interaction map reveals localization of opsonizing antibodies.</a> Nature Communications. 10, 2727 (2019).</li><li>Khakzad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+determination+of+Streptococcus+pyogenes+M1+protein+interactions+with+human+immunoglobulin+G+using+integrative+structural+biology.">Structural determination of Streptococcus pyogenes M1 protein interactions with human immunoglobulin G using integrative structural biology.</a> PLOS Computational Biology. 17 (1), E1008169 (2021).</li><li>Khakzad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cross-linking+MS+of+the+complement+system+MAC+assembled+on+live+Gram-positive+bacteria.">In vivo cross-linking MS of the complement system MAC assembled on live Gram-positive bacteria.</a> Frontiers in Genetics. 11, (2020).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

Moderna beräkningsarbetsflöden är ofta komplexa, med flera verktyg från många olika leverantörer, komplexa ömsesidiga beroenden, höga datavolymer och mångfacetterade resultat. Följaktligen blir det allt svårare att exakt dokumentera alla steg som krävs för att få ett resultat, vilket gör det svårt att reproducera det givna resultatet. Här demonstrerar vi en allmän strategi som kombinerar automatisering och enkelhet i ett automatiserat arbetsflöde som producerar en generisk rapport, med flexibiliteten att anpassa rapporten på ett reproducerbart sätt.
Tre krav måste uppfyllas för att protokollet ska fungera: För det första måste de proteiner som valts ut för analys interagera på ett sådant sätt att det kemiska tvärbindningsexperimentet kan producera tvärbundna arter i en tillräckligt hög koncentration för att detekteras av masspektrometern; olika masspektrometrar har olika detektionsnivåer och är också beroende av förvärvsprotokollet samt valet av tvärbindningsreagens. Den nuvarande versionen av TX-MS-protokollet tillåter endast DSS, ett lysin-lysinhomobifunktionellt tvärbindningsreagens. Ändå beror denna begränsning främst på möjligheten att maskininlärningssteget skulle behöva justeras för andra reagenser. Denna begränsning har förbättrats i Cheetah-MS-webbservern eftersom ytterligare två tvärbindningsreagens kan övervägas, men alla tre är icke-klyvbara reagenser. För det andra måste de två proteinerna antingen ha en experimentellt bestämd struktur eller modelleras med hjälp av jämförande modelleringstekniker eller de novo-tekniker . Inte alla proteiner kan modelleras, men en kombination av förbättrad programvara och en konstant avsättning av experimentella strukturer i PDB utökar antalet proteiner som kan modelleras. För det tredje bör de interagerande proteinerna förbli tillräckligt lika i sina bundna och obundna tillstånd så att dockningsalgoritmerna som används av TX-MS och Cheetah-MS kan skapa kvartära strukturer av tillräcklig kvalitet för att möjliggöra poängsättning. Detta krav är relativt vagt, eftersom acceptabel kvalitet är mycket systemberoende, där mindre proteiner med känd struktur i allmänhet är lättare att jämföra än större proteiner med okänd struktur.
Vid ett negativt resultat, kontrollera först att TX-MS hittade intralänkar, tvärlänkar mellan rester som ingår i samma polypeptidkedja. Om ingen upptäcks är den mest troliga förklaringen att något gick fel med provberedningen eller datainsamlingen. Om flera avståndsbegränsningar inte stöder modellerna, inspektera modellerna visuellt för att säkerställa att konformationen stöds av tvärbundna rester. Det finns inget uppenbart sätt att vrida en av interaktörerna utan att störa minst en tvärlänk. Om det finns tvärlänkar som är längre än det tillåtna avståndet för det givna tvärbindningsreagenset, försök att förbättra modelleringen av interaktorerna genom att införliva tvärbindningsdata.
Det är möjligt att använda alternativa program för att uppnå likvärdiga resultat förutsatt att känsligheten hos den valda programvaran är jämförbar med känsligheten hos TX-MS. Det finns till exempel onlineversioner av RosettaDock, HADDOCK och andra. Det är också möjligt att analysera kemiska tvärbindningsdata genom xQuest/xProphet 5,6, plink7 och SIM-XL26.
Vi tillämpar kontinuerligt TX-MS och Cheetah-MS på nya projekt 27,28,29, vilket förbättrar rapporterna som produceras av dessa metoder för att möjliggöra en mer detaljerad analys av resultaten utan att göra rapporterna större.

Protein-proteininteraktioner ligger till grund för biologiska systems struktur och funktion. Att ha tillgång till kvartära strukturer av proteiner kan ge insikter i hur två eller flera proteiner interagerar för att bilda högordnad strukturer. Tyvärr är det fortfarande utmanande att få kvartära strukturer; Detta återspeglas i det jämförelsevis lilla antalet PDB-poster (Protein DataBank)1 som innehåller mer än en polypeptid. Protein-proteininteraktioner kan studeras med tekniker som röntgenkristallografi, NMR och kryo-EM, men att erhålla en tillräcklig mängd renat protein under förhållanden där metoderna kan tillämpas kan vara tidskrävande.
Kemisk tvärbindning av masspektrometri utvecklades för att erhålla experimentella data om protein-proteininteraktioner med färre begränsningar för provberedning eftersom masspektrometri kan användas för att förvärva data om godtyckligt komplexa prover 2,3,4,5,6,7,8,9 . Dataanalysens kombinatoriska karaktär och det relativt lilla antalet tvärbundna peptider kräver emellertid att proverna fraktioneras före analys. För att åtgärda denna brist utvecklade vi TX-MS, en metod som kombinerar beräkningsmodellering med kemisk tvärbindning av masspektrometri10. TX-MS kan användas på godtyckligt komplexa prover och är betydligt känsligare jämfört med tidigare metoder10. Det åstadkommer detta genom att poängsätta alla data som är associerade med en given protein-proteininteraktion som en uppsättning istället för att tolka varje MS-spektrum oberoende. TX-MS använder också upp till tre olika MS-förvärvsprotokoll: högupplöst MS1 (hrMS1), databeroende förvärv (DDA) och dataoberoende förvärv (DIA), vilket ytterligare ger möjligheter att identifiera en tvärbunden peptid genom att kombinera flera observationer. TX-MS-beräkningsarbetsflödet är komplext av flera skäl. För det första förlitar den sig på flera MS-analysprogram 11,12,13 för att skapa proteinstrukturmodeller 14,15. För det andra kan mängden data vara betydande. För det tredje kan modelleringssteget förbruka betydande mängder datorbehandlingskraft.
Följaktligen används TX-MS bäst som ett automatiserat, förenklat beräkningsarbetsflöde via Cheetah-MS webbserver16 som körs på stora beräkningsinfrastrukturer som datormoln eller kluster. För att underlätta tolkningen av resultaten tog vi fram en interaktiv Jupyter Notebook17. Här visar vi hur Jupyter Notebook-rapporten kan utökas för att ge en mer djupgående analys av ett visst resultat.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Two Protein DataBank files of the proteins of interest.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Example files available on txms.org and zenodo.org, DOI 10.5281/zenodo.3361621</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>An mzML data file acquired on a sample where the proteins of interest were crosslinked.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Example files available on txms.org or zenodo.org, DOI 10.5281/zenodo.3361621</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quaternary structure modeling through chemical cross-linking mass spectrometry: extending tx-ms jupyter reports

Protein-proteininteraktioner kan vara utmanande att studera men ändå ge insikter i hur biologiska system fungerar. Riktad tvärbindningsmasspektrometri (TX-MS), en metod som kombinerar kvaternär proteinstrukturmodellering och kemisk tvärbindningsmasspektrometri, skapar strukturmodeller med hög noggrannhet med hjälp av data erhållna från komplexa, ofraktionerade prover. Detta tar bort ett av de största hindren för proteinkomplexstrukturanalys eftersom proteinerna av intresse inte längre behöver renas i stora mängder. Cheetah-MS webbserver utvecklades för att göra den förenklade versionen av protokollet mer tillgänglig för samhället. Med tanke på tandem MS/MS-data genererar Cheetah-MS en Jupyter Notebook, en grafisk rapport som sammanfattar de viktigaste analysresultaten. Genom att utöka Jupyter Notebook kan du få mer djupgående insikter och bättre förstå modellen och de masspektrometridata som stöder den. Det tekniska protokollet som presenteras här visar några av de vanligaste tilläggen och förklarar vilken information som kan erhållas. Den innehåller block som hjälper till att analysera tandem MS/MS-förvärvsdata och den totala effekten av de upptäckta RL: erna på de rapporterade kvartära modellerna. Resultatet av sådana analyser kan tillämpas på strukturella modeller som är inbäddade i anteckningsboken med NGLView.

TX-MS tillhandahåller strukturella utdata som stöds av MS-härledda experimentella begränsningar. Det fungerar genom att kombinera olika MS-datainsamlingstyper med beräkningsmodellering. Därför är det bra att analysera varje MS-data separat och tillhandahålla visualisering av utdatastrukturen. Kompletterande data 1 innehåller ett exempel på en notebook-fil som kan parsa DDA- och DIA-data som produceras som TX-MS-utdata. Användare kan välja XL av intresse. Genom att köra anteckningsboken kommer MS2-spektrumet för den XL att visas där olika färger hjälper till att skilja mellan fragment relaterade till den första peptiden, den andra peptiden och de kombinatoriska fragmentjonerna. XL kan också mappas till strukturen med hjälp av NGLView-widgeten inbäddad i en Jupyter Notebook.
En annan cell i den här anteckningsboken kan hjälpa användare att parsa och visualisera DIA-data. Det är dock svårare att visualisera DIA-data eftersom de analyserade data måste förberedas i rätt format.
Figur 1 visar en exempelstruktur av M1 och albumin med de översta XL: erna mappade på strukturen. TX-MS erhöll alla XLs efter parsning av hrMS1-, DDA- och DIA-data, och RosettaDock-protokollet tillhandahöll beräkningsmodellerna.
Eftersom den här rapporten är en Jupyter Notebook kan valfri Giltig Python-kod läggas till i nya notebook-celler. Koden nedan skapar till exempel ett histogram över MS2-räkningarna, vilket anger hur väl stödd varje tvärlänk stöds av underliggande data. importera seaborn som sns sns.distplot(ms2['count']);
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60311/60311fig01.jpg"> Figur 1: Strukturell modell av Streptococcus pyogenes M1-protein och humant albumin med TL kartlagda på strukturen. M1-proteinet visas i grått och utgör en homodimer. De sex albuminmolekylerna presenteras som par i olika nyanser av blått. Korslänkar och avstånd anges i rött med svart text. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60311/60311fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
Kompletterande akt. Jupyter notebook-data. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60311/Supplementary%20Data%201.ipynb" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Quaternary Structure Modeling Through Chemical Cross-Linking Mass Spectrometry: Extending TX-MS Jupyter Reports at JoVE.com

Quaternary Structure Modeling Through Chemical Cross-Linking Mass Spectrometry: Extending TX-MS Jupyter Reports

Riktad tvärbindning av masspektrometri skapar kvartära proteinstrukturmodeller med hjälp av masspektrometridata som förvärvats med upp till tre olika förvärvsprotokoll. När resultatet körs som ett förenklat arbetsflöde på Cheetah-MS-webbservern rapporteras de i en Jupyter Notebook. Här visar vi de tekniska aspekterna av hur Jupyter Notebook kan utökas för en mer djupgående analys.

Kvartär strukturmodellering genom kemisk tvärbindning av masspektrometri: Utvidgning av TX-MS Jupyter-rapporter

Protein-protein interactions can be challenging to study yet provide insights into how biological systems function. Targeted cross-linking mass ...

Den här metoden använder kraften i Jupyter Notebook för att leverera informativa och visuellt tilltalande rapporter samtidigt som användarna kan utöka och anpassa rapporten på ett reproducerbart och spårbart sätt. Denna flexibla teknik gör att alla användarändringar kan fångas i tillräcklig detalj för att reproduceras inom en senare tidsram eller av olika användare. Även om denna metod är allmänt tillämplig inom alla forskningsområden, är den främst utformad för Mucor life science, ett forskningsområde som kan producera komplexa data.Innan du påbörjar analysen ska du öppna den riktade tvärlänkande masspektrometriwebbplatsen. Vid navigering till webbplatsen visas en välkomstskärm med en beskrivning på hög nivå av TX MS.web-tjänsten. Under fliken handledning kan en detaljerad beskrivning av de tjänster som tillhandahålls, inklusive information om hur du använder tjänsten och hur du analyserar resultaten, observeras.Under nedladdningsfliken kan programvara och resurser laddas ner. All programvara är tillgänglig under en öppen källkodslicens. Under fliken Licens gör BSD 3-klausullicensen uttryckligen programvaran så brett användbar som möjligt.Fliken Kontakt innehåller kontaktuppgifter för att skicka in frågor eller kommentarer. Om du vill skicka ett e-postmeddelande med begäran om användaruppgifter går du tillbaka till fliken Cheetah och klickar på hyperlänken för e-postadressen längst ned på sidan. Ange relevant information i ämnesraden i brödtexten i e-postmeddelandet.Ett svar skickas så snabbt som möjligt. Efter att ha fått ett bekräftelsemail med användaruppgifterna loggar du in och laddar upp masspektrometridata till webbplatsen. Klicka på Skicka arbetsflöde och ange en titel och en beskrivning.Klicka sedan på visa arbetsflöde och välj Cheetah-arbetsflödet. När du har följt guiden använder du onlinevisaren för att inspektera Jupyter Notebook. Om du vill installera JupyterHub installerar du Docker enligt anvisningarna och laddar ned JupyterHub Docker-containern med Jupyter openBIS-tillägget.Efter att ha startat Docker kör P8171:8000 malmstroem/jove:latest container. Navigera till den angivna webbadressen och logga in med användarnamnet och lösenordet Användare. Om du vill ladda ned rapporten klickar du på nytt i Python 3 för att öppna en ny flik med en namnlös anteckningsbok.Klicka på Konfigurera openBIS-anslutningar i Jupyter-verktygsmenyn och ange TX MS som namn, TX MS-webbadressen för URL:en, Gäst för användaren och G-U-E-S-T-P-A-S-S-W-D för lösenordet. Välj den nya anslutningen och klicka på Välj anslutning för att söka efter rapporten. Klicka sedan, ladda ner i cellen och kör alla för att returnera rapporten.Om du vill utöka rapporten klickar du på cell och infogar nedan för att lägga till en ny cell längst ned. Klicka sedan på kod och tryck på skift och ange för att köra cellen. Om du vill ladda upp rapporten klickar du på uppladdningsknappen för att skapa en ny datauppsättning.En representativ struktur av M1 och albumin med övre tvärbindningar kartlagda på strukturen visas här. Alla tvärbindningar erhölls genom riktad tvärbindning av masspektrometri efter analys av högupplösta MS1-databeroende och oberoende förvärvsdata och beräkningsmodellerna tillhandahölls av RosettaDock-protokollet. Det är viktigt att komma ihåg att proteinproteininteraktioner är olika när det gäller deras stabilitet.Så därför kan dina resultat variera. Den nuvarande metoden är begränsad till binära interaktioner och kan därför inte tillämpas på mer komplexa proteinkvaternära strukturer. Modellering av enskilda par kan dock ge en bra bas för att bygga mer komplexa strukturer.Detaljer om bindningsgränssnittet kan vara användbara på många sätt, till exempel för att föreslå mutationer som antingen kan stabilisera eller destabilisera proteininteraktionerna. Så detta kan vara till hjälp för att förstå rollen som protein-proteininteraktioner bättre.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tidsupplöst elektrosprayjonisering Väte-deuterium Exchange-masspektrometri för att studera Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Lösa affinitetsrenat proteinkomplex av Blue Native PAGE och protein Korrelation profilering

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Lipid Droplet Isolation för Kvantitativ masspektrometri Analys

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Provberedning för Mass Spectrometry-baserade identifiering av RNA-bindande regioner

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

Optimal förberedelse av formalinbeständiga prover för peptid baserat Matrix assisterad Laser Desorption/jonisering masspektrometri Imaging arbetsflöden

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Detektion av protein ubiquitination platser av peptidanrikning och masspektrometri

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptid profilering och identifiering illustrerad av angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

Ett plasmaprovförberedelse för masspektrometri med hjälp av en automatiserad arbetsstation

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Provberedning för probe electrospray jonisering Masspektrometri

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Absolut kvantifiering av cellfri protein syntes metabolism genom omvänd fas vätskekromatografi-masspektrometri

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...