Name: absolute quantification of cell-free protein synthesis metabolism by reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry
Uploaded: 2019-10-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry at JoVE.com

تم دعم العمل الموصوف من قبل المركز علي فيزياء استقلاب السرطان من خلال الجائزة رقم 1U54CA210184-01 من المعهد الوطني للسرطان (https://www.cancer.gov/). المحتوي هو فقط مسؤوليه المؤلفين ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعهد الوطني للسرطان أو المعاهد الوطنية للصحة. ولم يكن لدي الممولين اي دور في تصميم الدراسة ، وجمع البيانات وتحليلها ، واتخاذ قرار بنشر المخطوطة أو اعدادها.

1. اعداد الكواشف لوضع العلامات الانيلين
<ol><li>اعداد محلول انيلين 6 م في 4.5 pH. العمل في هود ، والجمع بين 550 μL من الانيلين مع 337.5 μL من المياه LCMS الصف و 112.5 μL من حمض الهيدروكلوريك 12 م (HCl) في أنبوب الطرد المركزي. دوامه جيدا وتخزين في 4 درجه مئوية. ملاحظه: يمكن تخزين الانيلين في 4 درجه مئوية لمده شهرين...

<ol>
	<li>Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthetic+biology:+thinking+outside+the+cell.">Cell-free synthetic biology: thinking outside the cell.</a> Metabolic Engineering. 14, 261-269 (2012).</li><li>Vilkhovoy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+specific+modeling+of+E.+coli+cell-free+protein+synthesis.">Sequence specific modeling of E. coli cell-free protein synthesis.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (8), 1844-1857 (2018).</li><li>Vilkhovoy, M., Minot, M., Varner, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+dynamic+models+of+metabolic+networks.">Effective dynamic models of metabolic networks.</a> IEEE Life Sciences Letters. 2 (4), 51-54 (2016).</li><li>Horvath, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+genome+scale+sequence+specific+dynamic+model+of+cell-free+protein+synthesis+in+Escherichia+coli.">Toward a genome scale sequence specific dynamic model of cell-free protein synthesis in Escherichia coli.</a> bioRxiv. , 215012 (2017).</li><li>Dettmer, K., Aronov, P. A., Hammock, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+metabolomics.">Mass spectrometry-based metabolomics.</a> Mass spectrometry reviews. 26 (1), 51-78 (2007).</li><li>Hajjaj, H., Blanc, P. J., Goma, G., Fran&#231;ois, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sampling+techniques+and+comparative+extraction+procedures+for+quantitative+determination+of+intra-+and+extracellular+metabolites+in+filamentous+fungi.">Sampling techniques and comparative extraction procedures for quantitative determination of intra- and extracellular metabolites in filamentous fungi.</a> FEMS Microbiology Letters. 164 (1), 195-200 (1998).</li><li>Ruijter, G. J. G., Visser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+intermediary+metabolites+in+Aspergillus+niger.">Determination of intermediary metabolites in Aspergillus niger.</a> Journal of Microbiological Methods. 25 (3), 295-302 (1996).</li><li>Mailinger, W., Baltes, M., Theobald, U., Reuss, M., Rizzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+metabolic+dynamics+in+Saccharomyces+cerevisiae:+I.+Experimental+observations.">In vivo analysis of metabolic dynamics in Saccharomyces cerevisiae: I. Experimental observations.</a> Biotechnology and Bioengineering. 55 (2), 305-316 (1997).</li><li>Dunn, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+appeal:+metabolite+identification+in+mass+spectrometry-focused+untargeted+metabolomics.">Mass appeal: metabolite identification in mass spectrometry-focused untargeted metabolomics.</a> Metabolomics. 9 (1), 44-66 (2013).</li><li>Huang, T., Toro, M., Lee, R., Hui, D. S., Edwards, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-functional+derivatization+of+amine,+hydroxyl,+and+carboxylate+groups+for+metabolomic+investigations+of+human+tissue+by+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Multi-functional derivatization of amine, hydroxyl, and carboxylate groups for metabolomic investigations of human tissue by electrospray ionization mass spectrometry.</a> Analyst. 143 (14), 3408-3414 (2018).</li><li>Huang, T., Armbruster, M. R., Coulton, J. B., Edwards, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+Tagging+in+Mass+Spectrometry+for+Systems+Biology.">Chemical Tagging in Mass Spectrometry for Systems Biology.</a> Analytical Chemistry. 91 (1), 109-125 (2019).</li><li>Yang, W. C., Sedlak, M., Regnier, F. E., Mosier, N., Ho, N., Adamec, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+quantification+of+metabolites+involved+in+central+carbon+and+energy+metabolism+using+reversed-phase+liquid+chromatography-mass+spectrometry+and+in+vitro+13C+labeling.">Simultaneous quantification of metabolites involved in central carbon and energy metabolism using reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry and in vitro 13C labeling.</a> Analytical Chemistry. 80 (24), 9508-9516 (2008).</li><li>Jannasch, A., Sedlak, M., Adamec, J., Metz, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Pentose+Phosphate+Pathway+(PPP)+Metabolites+by+Liquid+Chromatography-Mass+Spectrometry+(LC-MS).">Quantification of Pentose Phosphate Pathway (PPP) Metabolites by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS).</a> Metabolic Profiling. Methods in Molecular Biology 708 (Methods and Protocols). , 159-171 (2011).</li><li>Luo, B., Groenke, K., Takors, R., Wandrey, C., Oldiges, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+multiple+intracellular+metabolites+in+glycolysis,+pentose+phosphate+pathway,+and+tricarboxylic+acid+cycle+by+liquid+chromatography-mass+spectrometry.">Simultaneous determination of multiple intracellular metabolites in glycolysis, pentose phosphate pathway, and tricarboxylic acid cycle by liquid chromatography-mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography A. 1147 (2), 153-164 (2007).</li></ol>

أنظمه خاليه من الخلايا ليس لديها جدار الخلية ، التالي هناك امكانيه الوصول المباشر إلى الأيض وآلات الحيوية دون الحاجة إلى اعداد عينه معقده. غير انه لم ينجز سوي القليل جدا من العمل لوضع بروتوكولات شامله وقويه لاجراء الاستجواب الكمي لنظم رد الفعل الخالي من الخلايا. في هذه الدراسة ، قمنا بتطو?...

تخليق البروتين الخالي من الخلايا (CFPS) هو منصة واعده لتصنيع البروتينات والمواد الكيميائية ، وهو التطبيق الذي تم حجزه تقليديا للخلايا الحية. وتستمد الانظمه الخالية من الخلايا من مستخلصات الخلايا الخام وتزيل المضاعفات المرتبطة بنمو الخلايا1. الاضافه إلى ذلك ، يسمح CFPS للوصول المباشر إلى الأيض وآلات الحيوية دون تدخل جدار الخلية. ومع ذلك ، فقد افتقر إلى فهم أساسي لحدود أداء العمليات الخالية من الخلايا. الطرق عاليه الانتاجيه للقياس المستقلب هي قيمه لتوصيف الأيض وحاسمه لبناء نماذج الحسابية الايضيه2,3,4. وتشمل الأساليب الشائعة المستخدمة لتحديد تركيزات المستقلب الرنين المغناطيسي النووي (nmr) ، تحويل fourier-الطيفي الاشعه تحت الحمراء (FT-IR) ، والاختبارات القائمة علي انزيم ، والطيف الكتلي (MS)5،6،7 ،8. ومع ذلك ، غالبا ما تكون هذه الطرق محدوده بسبب عدم قدرتها علي قياس مركبات متعددة بكفاءة في ان واحد ، وغالبا ما تتطلب حجم عينه أكبر من ردود الفعل النموذجية الخالية من الخلايا. علي سبيل المثال ، يمكن غالبا استخدام الاختبارات المستندة إلى الانزيم فقط لقياس مركب واحد في التشغيل ، وتكون محدوده عندما يكون حجم العينة صغيرا ، مثل تفاعلات تخليق البروتين الخالية من الخلايا (عاده ما يتم تشغيلها علي مقياس 10-15 μL). وفي الوقت نفسه ، يتطلب NMR وفره عاليه من نواتج الأيض للكشف والتقدير الكمي5.  النسبة لأوجه القصور هذه ، توفر أساليب الفصل اللوني بالترادف مع قياس الطيف الكتلي (LC/MS) العديد من المزايا ، بما في ذلك الحساسية العالية وقدره الأنواع المتعددة فيان واحد فينفس الوقت ؛ ومع ذلك ، فان التعقيد التحليلي يزيد كثيرا مع عدد وتنوع الأنواع التي يجري قياسها. ولذلك ، من المهم تطوير أساليب تحقق بالبالكامل الإمكانات العالية الانتاجيه لأنظمه LC/MS. يتم فصل المركبات في عينه بواسطة اللوني السائل وتحديدها من خلال قياس الطيف الكتلي. تعتمد اشاره المركب علي تركيزه وكفاءه التاين ، حيث يمكن ان يختلف التاين بين المركبات وقد يعتمد أيضا علي مصفوفة العينة.
ويمثل تحقيق نفس كفاءه التاين بين العينة والمعايير تحديا عند استخدام LC/MS لقياس التحاليل. وعلاوة علي ذلك ، يصبح القياس الكمي أكثر تحديا مع تنوع المستقلب بسبب تقسيم الاشاره والتغاير في تقارب البروتون والقطبية10. وأخيرا ، يمكن لمصفوفة العينة المشتركة ان تؤثر أيضا علي كفاءه تاين المركبات. لمعالجه هذه القضايا ، يمكن ان تكون الأيض ديريفاتيزيد كيميائيا ، وزيادة دقه الفصل والحساسية من قبل أنظمه LC/MS ، في حين خفض تقسيم الاشاره في وقت واحد في بعض الحالات10،11. اشتقاق الكيميائية يعمل عن طريق وضع علامات مجموعات وظيفية محدده من الأيض لضبط خصائصها الفيزيائية مثل تهمه أو هيدروفوبيسيتي لزيادة كفاءه التاين11. يمكن استخدام عوامل الوسم المختلفة لاستهداف مجموعات وظيفية مختلفه (علي سبيل المثال ، الأمينات ، هيدروكسي ls ، الفوسفات ، الأحماض الكربوكسيليه ، الخ). انيلين ، واحده من هذه العوامل اشتقاق ، تستهدف مجموعات وظيفية متعددة في وقت واحد ، ويضيف مكون مسعور في جزيئات هيدروفيله ، التالي زيادة قرار الانفصال واشاره12. للتصدي للتاثير المشترك لقمع أيون المصفوفة ، قام يانغ وزملاء البحث بتطوير تقنيه تستند إلى وضع العلامات الخاصة بالتكنولوجيا القياسية الداخلية الخاصة بالمجموعة (جسيست) حيث يتم تمييز المعايير مع نظائر الانيلين 13ج ومزجها مع العينة 12,13. المستقلب والمعايير الداخلية المقابلة لها نفس كفاءه التاين لأنها مشتركه ، ويمكن استخدام نسبه شدتها لقياس التركيز في العينة التجريبية.
في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير بروتوكول للكشف عن وكميه 40 المركبات المشاركة في تحلل الجلوكوز ، والمسار الفوسفات البنتوز ، ودوره حمض تريكاربوكسيليك ، واستقلاب الطاقة وتجديد العامل المساعد في تفاعلات cfps. ويستند هذا الأسلوب علي نهج جسيست, حيث استخدمنا 12ج-الانيلين و 13ج-الانيلين لوسم, كشف, وقياس الأيض باستخدام عكس المرحلة LC/MS. وامتدت المجموعة الخطية لجميع المركبات 2-3 أوامر الحجم بمعامل ارتباط متوسطه 0.988. التالي ، فان الأسلوب هو نهج قوي ودقيق لاستجواب الأيض خاليه من الخلايا ، وربما مقتطفات خليه كامله.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:665px;" width="665">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">12C Aniline</td>
			<td style="width:121px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">242284</td>
			<td style="width:167px;">Aniline 12C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">13C labeled aniline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>485797</td>
			<td>Aniline 13C6</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">3-Phosphoglyceric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8877</td>
			<td>3PG</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetic Acid</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>AC222140010</td>
			<td>ACE</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile, LCMS</td>
			<td>JT BAKER</td>
			<td>9829-03</td>
			<td>ACN</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetyl-coenzyme A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2056</td>
			<td>ACA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acquity UPLC BEH C18 1.7 &#956;M, 2.1 x 150 mm Column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186002353</td>
			<td>Column</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adenosine diphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2754</td>
			<td>ADP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adenosine monophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1752</td>
			<td>AMP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adenosine triphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td>ATP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alpha-ketoglutarate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1128</td>
			<td>aKG</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>251275</td>
			<td>CIT</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytidine diphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9755</td>
			<td>CDP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytidine monophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1006</td>
			<td>CMP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytidine triphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9274</td>
			<td>CTP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">D-glyceraldehyde 3-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>39705</td>
			<td>GAP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Erythrose 4-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E0377</td>
			<td>E4P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EX0276</td>
			<td>EtOH</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fisher Scientific accuSpin Micro 17 Centrifuge</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td></td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Flavin adenine dinucleotide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6625</td>
			<td>FAD</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fructose 1,6-bisphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6803</td>
			<td>F16P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fructose 6-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3627</td>
			<td>F6P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fumarate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8509</td>
			<td>FUM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gluconate 6-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7877</td>
			<td>6PG</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>GLC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose 6-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7879</td>
			<td>G6P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol 3-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7886</td>
			<td>Gly3P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Guanosine diphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7127</td>
			<td>GDP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Guanosine monophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8377</td>
			<td>GMP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Guanosine triphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td>GTP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258148</td>
			<td>HCl</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isocitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1252</td>
			<td>ICIT</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L1750</td>
			<td>LAC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Malate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>02288</td>
			<td>MAL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">myTXTL - Sigma 70 Master Mix Kit</td>
			<td>ArborBiosciences</td>
			<td>507024</td>
			<td>Cell-free protein synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N-(3-dimethylaminopropyl)-N&#8242;-ethylcarbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03449</td>
			<td>EDC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nicotinamide adenine dinucleotide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43410</td>
			<td>NAD</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N5755</td>
			<td>NADP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>481973</td>
			<td>NADPH</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nicotinamide adenine dinucleotide reduced</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N8129</td>
			<td>NADH</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Oxalacetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O4126</td>
			<td>OAA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphoenolpyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0564</td>
			<td>PEP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280</td>
			<td>PYR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ribose 5-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R7750</td>
			<td>R5P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ribulose 5-phosphate</td>
			<td>CarboSynth</td>
			<td>MR45852</td>
			<td>RL5P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sedoheptulose 7-phosphate</td>
			<td>CarboSynth</td>
			<td>MS07457</td>
			<td>S7P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Succinate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3674</td>
			<td>SUCC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tributylamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90780</td>
			<td>TBA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triethylamine</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>O4884</td>
			<td>TEA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ultrapure water</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>10977-015</td>
			<td>water</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Uridine diphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U4125</td>
			<td>UDP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Uridine monophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6375</td>
			<td>UMP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Uridine triphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6625</td>
			<td>UTP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">VWR Heavy Duty Vortex</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>Vortex</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Water, LCMS</td>
			<td>JT BAKER</td>
			<td>9831-03</td>
			<td>WATER</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters Acquity H UPLC Class Quaternary Solvent Manager</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>LCMS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters Acquity H UPLC Class Sample Manager FTN</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>LCMS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters Acquity Qda detector</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>LCMS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters Empower 3</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters LCMS Total Recovery Vial</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186000384c</td>
			<td>LCMS Vial</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

absolute quantification of cell-free protein synthesis metabolism by reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry

تخليق البروتين الخالي من الخلايا (CFPS) هو تكنولوجيا ناشئه في النظم والبيولوجيا التركيبية لإنتاج البروتينات في المختبر. ومع ذلك ، إذا CFPS هو الذهاب إلى الانتقال إلى ما وراء المختبر وتصبح واسعه النطاق والقياسية فقط في الوقت تصنيع التكنولوجيا ، يجب علينا ان نفهم حدود الأداء لهذه الانظمه. نحو هذا السؤال ، قمنا بتطوير بروتوكول قوي لتحديد كميه المركبات 40 المشاركة في تحلل الجلوكوز ، ومسار الفوسفات خماسي ، ودوره حمض تريكاربوكسيليك ، واستقلاب الطاقة وتجديد العامل المساعد في تفاعلات cfps. يستخدم الأسلوب المعايير الداخلية الموسومة مع 13ج-الانيلين ، في حين ان المركبات في العينة هي ديريفاتيزيد مع 12ج-الانيلين. وكانت المعايير والعينات الداخلية مختلطة ومحلله بواسطة الفصل اللوني السائل للمرحلة المعكوسة-قياس الطيف الكتلي (LC/MS). التخلص من المركبات القضاء علي قمع الأيونات ، والسماح للقياس الدقيق لتركيزات المستقلب أكثر من 2-3 أوامر الحجم حيث كان معامل الارتباط المتوسط 0.988. وكانت خمسه من المركبات 40 غير الموسومة مع الانيلين ، ومع ذلك ، كانت لا تزال الكشف عنها في عينه CFPS وكميتها مع طريقه منحني قياسي. يستغرق التشغيل الكروماتوغرافي حوالي 10 دقائق لإكماله. معا ، قمنا بتطوير طريقه سريعة وقويه لفصل وتحديد كميات 40 المركبات المشاركة في CFPS في واحد LC/MS تشغيل. الأسلوب هو نهج شامل ودقيق لتوصيف الأيض خاليه من الخلايا ، بحيث في نهاية المطاف ، يمكننا فهم وتحسين الغلة والانتاجيه وكفاءه الطاقة من الانظمه الخالية من الخلايا.

كدليل علي المفهوم ، استخدمنا البروتوكول لقياس نواتج الأيض في نظام CFPS القائم علي كولاي الذي يعبر عن البروتين الفلوري الأخضر (gfp).  وكان رد فعل CFPS (14 μL) مروي و deبروتينيه مع الايثانول. ثم تم المفتاحية عينه CFPS مع 12ج-الانيلين, في حين تم الموسومة المعايير مع 13ج-الانيلين. ثم جمعت الع...

Watch this Scientific Journal Video about Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry at JoVE.com

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

هنا ، نقدم بروتوكولا قويا لقياس 40 المركبات المشاركة في استقلاب الكربون المركزي والطاقة في تفاعلات تخليق البروتين الخالية من الخلايا. وديريفاتيزيد خليط التوليف الخالي من الخلايا مع الانيلين للفصل الفعال باستخدام الفصل اللوني السائل للمرحلة المعكوسة ثم تحديده كميا عن طريق قياس الطيف الكتلي باستخدام معايير داخلية موسومة بالنظائر.

التحديد الكمي المطلق لاستقلاب تخليق البروتين الخالي من الخلايا بواسطة الفصل اللوني السائل للمرحلة المعكوسة

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

تخلي تخلي عن تخليد البروتينات هو التكنولوجيا الناشئة في النظم والبيولوجيا الاصطناعية لإنتاج في المختبر من البروتينات. أنظمة تخليد البروتين خالية من الخلايا ليس لها جدار الخلية، وبالتالي لدينا الوصول المباشر إلى المستقلبات. في هذا البروتوكول، نقوم بتحديد القياسات المطلقة لـ 40 مستقلبات تدخل في استقلاب الكربون والطاقة المركزي، مما يسمح لنا بتوصيف الأيض الخالي من الخلايا.البروتوكول يعتمد على الانبثاث المركبات مع الانيلين، والذي يسمح لفصل أفضل وارتفاع دقة الطيف الكتلي. بالإضافة إلى ذلك، نحن نستخدم المعايير الداخلية مع نظائرنا نسمي أنيلين، من أجل التحديد الكمي المطلق للاستقلابات. الأيض الموسومة coelute، الذي يلغي آثار قمع الحديد.السماح بالتدين الكمي الدقيق للمركبات. العمل في غطاء محرك السيارة، والجمع بين 550 ميكرولترات من النيولين، مع 337.5 ميكرولترات من LC-MS من المياه الصف. و112.5 ميكرولترات من 12 حمض الهيدروكلوريك المولر في أنبوب الطرد المركزي.دوامة جيدا، وتخزين محلول ال وأنيلين المولوس ستة في درجة الحرارة 4.5 و 4 درجات مئوية. لإعداد ستة مولكر الكربون 13 حل انيلين، في درجة الحموضة 4.5، والجمع بين 250 ملليغرام من الكربون-13 انيلين مع 132 ميكرولترات من الماء، و 44 ميكرولترات من 12 حمض الهيدروكلوريك المولر. دوامة جيدا، وتخزينها في أربع درجات مئوية.لإعداد 200 ملليغرام لكل ملليلتر حل EDC، حل اثنين ملليغرام من EDC في 10 ميكرولترات من الماء لكل عينة أن تكون الموسومة. ودوامة جيدة. لإعداد العينات، وإخماد وتعجيل البروتينات في تفاعل تخليق البروتين خالية من الخلايا، عن طريق إضافة حجم متساو من الجليد البارد 100٪ الإيثانول إلى تفاعل تخليق خالية من الخلايا.أجهزة الطرد المركزي العينة في 12، 000 مرة ز، لمدة 15 دقيقة في أربع درجات مئوية. نقل المُنَعِر من العينة إلى أنبوب جديد للطرد المركزي. لتسمية العينة بمحلول انيلين كربوني-12، قم بنقل ستة ميكرولترات من العينة إلى أنبوب جديد للطرد المركزي، وإحضار الحجم إلى 50 ميكرولترات مع الماء.إضافة 5 ميكرولترات من 200 ملليغرام لكل مللي EDC الحل، مزيج من الكربون 12 حل الأنيلين جيدا، ونقل 5 ميكرولترات في أنبوب. دوامة رد الفعل مع اهتزاز لطيف لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. بعد ساعتين، قم بإزالة الأنابيب من الشاكر ونقلها إلى غطاء أبخرة.إضافة 1.5 ميكرولترات من ثلاثية اليثيلامين إلى كل رد فعل لوقف رد فعل وضع علامات الانيسين وتثبيت المركبات. أجهزة الطرد المركزي في 13،500 مرات ز لمدة ثلاث دقائق. وأنقذ المُندفع.لتسمية المعايير الداخلية بمحلول انيلين من الكربون-13، قم بتخفيف محلول المخزون الداخلي إلى 80 ميكرومولار بحجم نهائي من 50 ميكرولترات. إضافة خمسة ميكرولترات من 200 ملليغرام في حل EDC ملليلتر، وخمسة ميكرولترات من محلول النيلين الكربون مختلطة جيدا-13. دوامة رد الفعل مع اهتزاز لطيف لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة.بعد ساعتين ، قم بإزالة الأنابيب من الشاكر ، وأضف 1.5 ميكرولترات ثلاثية الإيثيلامين إلى التفاعل في غطاء الدخان. جهاز طرد مركزي في 13،500 مرات ز لمدة ثلاث دقائق وحفظ الفائق. إلى الإلهية القياسية الداخلية الموسومة، وعينة الموسومة، مزيج 25 ميكرولترات من كل في قارورة autosampler.وتحليل بواسطة الإجراء LC-MS. ثم، لإنشاء منحنى قياسي لالاستقلابات غير الموسومة، أولا، تمييع محلول المخزون من المستقلبات غير الموسومة إلى تركيزات مختلفة، مع حجم 50 ميكرولترات. إضافة خمسة ميكرولترات من 200 ملليغرام في حل EDC ملليلتر، وخمسة ميكرولترات من حل النيلين الكربون-12 لكل تركيز.دوامة رد الفعل مع اهتزاز لطيف لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. والمضي قدما في علاج ثلاثي الإيثيلامين. والطرد المركزي قبل تحليل من قبل LC-MS كما كان سابقا.بعد تهيئة LC-MS ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، وحقن خمسة ميكرولترات من العينة في العمود. والحصول على مناسبة م على ض أيونات كثافة للكربون-12 aniline الموسومة العينة. ثم، حقن خمسة ميكرولترات من نفس العينة مرة أخرى.والحصول على درجة m على زد أيونات للمعايير الموسومة الكربون-13 aniline. في هذا البروتوكول، تم تحديد كمية الأيض التي تعبر عن البروتين الفلوري الأخضر في تخليق البروتين الخالي من الخلايا القائم على الإشريكية القولونية. تم الكشف عن 40 من نواتج الأيض التي تدخل في عملية التمثيل الغذائي المركزي للكربون والطاقة، وتم تحديدها كميا باستخدام معايير داخلية.في حين تم تطوير منحنى قياسي لخمسة من الأيض التي لم تكن الموسومة مع aniline. وكانت الأيضات المتنوعة المشاركة في هذه المسارات فئة من السكريات الفوسفورية، والأحماض الفسفو الكربوكسيلية، والأحماض الكربوكسيلية، والنيوكليوتيدات، والعوامل المشتركة. وبالإضافة إلى ذلك، مكنت الطريقة فصل أزواج الايزومر الهيكلية، مثل فوسفات الجلوكوز-ستة، والفوسفات من الفركتوز-ستة في تشغيل واحد LC-MS.الخطوة الأكثر أهمية هي وضع علامة على عينة دي البروتين مع انيلين. وبما أن حل الـ aniline ينفصل، فمن المهم العمل بسرعة وفعالية، مع الحفاظ على ممارسات السلامة الجيدة. هذه الطريقة تساعد على وصف الأيض خالية من الخلايا مع تحديد كمي من 40 المستقلبات.ولكن، مركبات إضافية في الخليط خالية من الخلايا، مثل الأحماض الأمينية التي يمكن تحديد كميا. وهذا من شأنه أن يساعد في توفير نظرة أكثر شمولا في التمثيل الغذائي خالية من الخلايا. وكشفت هذه الطريقة أن الأنظمة الخالية من الخلايا لها عمليات استقلاب معقدة، لا تزال تعمل ويمكن استغلالها لتحسين كفاءة الطاقة وغلة الكربون.ويعتمد البروتوكول على وضع علامات على المركبات باستخدام الـ ANILINE باستخدام EDC كمحفز. كل من هذه الكواشف خطرة وينبغي استخدامها بحذر.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

وقت حل التأين electrospray الهيدروجين، الديوتيريوم تبادل الطيف الكتلي لدراسة بنية البروتين وديناميكية

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

حل تقارب تنقية البروتين المجمعات التي كتبها Blue الأصلية PAGE والبروتين الارتباط التنميط

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

النهج القائم على الطيف، جنبا إلى جنب السائل اللوني الكتلة لتحليل المستقلب من<em&gt; المكورات العنقودية الذهبية</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

التنميط البروتين العميق بوسم إيسوباريك وواسعة النطاق اللوني السائل والطيف الكتلي وساعدت برامج القياس الكمي

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

قياس حساسية عالية من الانتماءات الملزمة الحمض النووي عامل النسخ بالتنافسية معايرة باستخدام مجهر الأسفار

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

الكشف عن مواقع اكتشاف البروتين من قبل إثراء الببتيد وقياس الطيف الكتلي

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

التحليل الكمي للدهون الخلوية من Saccharomyces Cerevisiae باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي جنبا إلى جنب

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

إنشاء أنظمه تحديد البروتين المستحثة كيميائيا للغاية بواسطة الاختيار المتدرج لمكتبه الأجسام المضادة أحاديه المجال التوافقية

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

تحليل الموجات الاختزالية السائلة غير المستهدفة - قياس الطيف الشامل - Metabolomics من حبوب القمح

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...