Name: absolute quantification of cell-free protein synthesis metabolism by reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry
Uploaded: 2019-10-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry at JoVE.com

Det beskrevne arbejde blev støttet af Center på fysik af kræft metabolisme gennem Award nummer 1U54CA210184-01 fra National Cancer Institute (https://www.cancer.gov/). Indholdet er udelukkende ansvaret for forfatterne og ikke nødvendigvis repræsenterer de officielle synspunkter af National Cancer Institute eller National Institutes of Health. De finansieringskilder havde ingen rolle i studiet design, dataindsamling og analyse, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet.

1. klargøring af reagenser til anilin mærkning
<ol><li>Forbered en 6 M anilin opløsning ved pH 4,5. Arbejder i en hætte, kombinere 550 μL anilin med 337,5 μL LCMS kvalitet vand og 112,5 μL af 12 M saltsyre (HCl) i et centrifugeglas. Vortex brønd og opbevares ved 4 °C. Bemærk: anilin kan opbevares ved 4 °C i 2 måneder. Forsigtig: anilin er meget giftigt og bør behandles med i en røg hætte. Saltsyre er meget ætsende</li>
	<li>Forbered en 6 M 13C anilin opløsning ved pH 4,5. Kombiner 250 ...

<ol>
	<li>Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthetic+biology:+thinking+outside+the+cell.">Cell-free synthetic biology: thinking outside the cell.</a> Metabolic Engineering. 14, 261-269 (2012).</li><li>Vilkhovoy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+specific+modeling+of+E.+coli+cell-free+protein+synthesis.">Sequence specific modeling of E. coli cell-free protein synthesis.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (8), 1844-1857 (2018).</li><li>Vilkhovoy, M., Minot, M., Varner, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+dynamic+models+of+metabolic+networks.">Effective dynamic models of metabolic networks.</a> IEEE Life Sciences Letters. 2 (4), 51-54 (2016).</li><li>Horvath, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+genome+scale+sequence+specific+dynamic+model+of+cell-free+protein+synthesis+in+Escherichia+coli.">Toward a genome scale sequence specific dynamic model of cell-free protein synthesis in Escherichia coli.</a> bioRxiv. , 215012 (2017).</li><li>Dettmer, K., Aronov, P. A., Hammock, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+metabolomics.">Mass spectrometry-based metabolomics.</a> Mass spectrometry reviews. 26 (1), 51-78 (2007).</li><li>Hajjaj, H., Blanc, P. J., Goma, G., Fran&#231;ois, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sampling+techniques+and+comparative+extraction+procedures+for+quantitative+determination+of+intra-+and+extracellular+metabolites+in+filamentous+fungi.">Sampling techniques and comparative extraction procedures for quantitative determination of intra- and extracellular metabolites in filamentous fungi.</a> FEMS Microbiology Letters. 164 (1), 195-200 (1998).</li><li>Ruijter, G. J. G., Visser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+intermediary+metabolites+in+Aspergillus+niger.">Determination of intermediary metabolites in Aspergillus niger.</a> Journal of Microbiological Methods. 25 (3), 295-302 (1996).</li><li>Mailinger, W., Baltes, M., Theobald, U., Reuss, M., Rizzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+metabolic+dynamics+in+Saccharomyces+cerevisiae:+I.+Experimental+observations.">In vivo analysis of metabolic dynamics in Saccharomyces cerevisiae: I. Experimental observations.</a> Biotechnology and Bioengineering. 55 (2), 305-316 (1997).</li><li>Dunn, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+appeal:+metabolite+identification+in+mass+spectrometry-focused+untargeted+metabolomics.">Mass appeal: metabolite identification in mass spectrometry-focused untargeted metabolomics.</a> Metabolomics. 9 (1), 44-66 (2013).</li><li>Huang, T., Toro, M., Lee, R., Hui, D. S., Edwards, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-functional+derivatization+of+amine,+hydroxyl,+and+carboxylate+groups+for+metabolomic+investigations+of+human+tissue+by+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Multi-functional derivatization of amine, hydroxyl, and carboxylate groups for metabolomic investigations of human tissue by electrospray ionization mass spectrometry.</a> Analyst. 143 (14), 3408-3414 (2018).</li><li>Huang, T., Armbruster, M. R., Coulton, J. B., Edwards, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+Tagging+in+Mass+Spectrometry+for+Systems+Biology.">Chemical Tagging in Mass Spectrometry for Systems Biology.</a> Analytical Chemistry. 91 (1), 109-125 (2019).</li><li>Yang, W. C., Sedlak, M., Regnier, F. E., Mosier, N., Ho, N., Adamec, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+quantification+of+metabolites+involved+in+central+carbon+and+energy+metabolism+using+reversed-phase+liquid+chromatography-mass+spectrometry+and+in+vitro+13C+labeling.">Simultaneous quantification of metabolites involved in central carbon and energy metabolism using reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry and in vitro 13C labeling.</a> Analytical Chemistry. 80 (24), 9508-9516 (2008).</li><li>Jannasch, A., Sedlak, M., Adamec, J., Metz, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Pentose+Phosphate+Pathway+(PPP)+Metabolites+by+Liquid+Chromatography-Mass+Spectrometry+(LC-MS).">Quantification of Pentose Phosphate Pathway (PPP) Metabolites by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS).</a> Metabolic Profiling. Methods in Molecular Biology 708 (Methods and Protocols). , 159-171 (2011).</li><li>Luo, B., Groenke, K., Takors, R., Wandrey, C., Oldiges, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+multiple+intracellular+metabolites+in+glycolysis,+pentose+phosphate+pathway,+and+tricarboxylic+acid+cycle+by+liquid+chromatography-mass+spectrometry.">Simultaneous determination of multiple intracellular metabolites in glycolysis, pentose phosphate pathway, and tricarboxylic acid cycle by liquid chromatography-mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography A. 1147 (2), 153-164 (2007).</li></ol>

Celle frie systemer har ingen cellevæg, og der er således direkte adgang til metabolitter og de biosyntetiske maskiner uden behov for kompleks prøveforberedelse. Men meget lidt arbejde er blevet gjort for at udvikle grundige og robuste protokoller til kvantitativt afhøre celle-fri reaktionssystemer. I denne undersøgelse udviklede vi en hurtig, robust metode til at kvantificere metabolitter i celle frie reaktionsblandinger og potentielt i helcelle ekstrakter. Individuel kvantificering af metabolitter i komplekse blan...

Celle-fri Proteinsyntese (CFP'ER) er en lovende platform for fremstilling af proteiner og kemikalier, en applikation, der traditionelt har været forbeholdt levende celler. Celle frie systemer er afledt af rå celleekstrakter og eliminere komplikationer forbundet med cellevækst1. Derudover giver CFP'ER mulighed for direkte adgang til metabolitter og de biosyntetiske maskiner uden indblanding fra en cellevæg. Der har imidlertid manglet en grundlæggende forståelse af præstations grænserne for celle frie processer. High-gennemløb metoder til metabolisering kvantificering er værdifulde for karakterisering af stofskiftet og er afgørende for opførelsen af metaboliske beregningsmæssige modeller2,3,4. Fælles metoder, der anvendes til bestemmelse af metabolitten koncentrationer omfatter nuklear magnetisk resonans (NMR), Fourier transformation-infrarød spektroskopi (ft-IR), enzym-baserede assays, og massespektrometri (MS)5,6,7 ,8. Men, disse metoder er ofte begrænset af deres manglende evne til effektivt at måle flere forbindelser på én gang og ofte kræver en prøvestørrelse større end typiske celle-fri reaktioner. For eksempel kan enzym baserede assays ofte kun bruges til at kvantificere en enkelt forbindelse i en løbetur og er begrænset, når Prøvestørrelsen er lille, såsom i celle frie proteinsyntese reaktioner (typisk på en 10-15 μL skala). I mellemtiden kræver NMR en høj forekomst af metabolitter til påvisning og kvantificering5.  Mod disse mangler, kromatografi metoder i tandem med massespektrometri (LC/MS) giver flere fordele, herunder høj følsomhed og evnen til at måle flere arter samtidigt9; den analytiske kompleksitet stiger imidlertid betydeligt med antallet og mangfoldigheden af de arter, der måles. Det er derfor vigtigt at udvikle metoder, der fuldt ud realisere de høje gennemløb potentiale LC/MS-systemer. Forbindelser i en prøve adskilles ved hjælp af væskekromatografi og identificeres gennem massespektrometri. Signalet af forbindelsen afhænger af dets koncentration og ioniserings effektivitet, hvor ioniseringen kan variere mellem forbindelser og kan også afhænge af prøve matrixen.
Opnåelse af samme ioniserings effektivitet mellem prøven og standarderne er en udfordring, når LC/MS bruges til at kvantificere analytter. Yderligere, kvantificering bliver mere udfordrende med metabolitten mangfoldighed på grund af signal opdeling og heterogenitet i proton affinitet og polaritet10. Endelig kan Co-eluting matrix af prøven også påvirke ioniserings effektiviteten af forbindelserne. For at løse disse problemer, metabolitter kan være kemisk derivatized, øge separation opløsning og følsomhed ved LC/MS-systemer, mens samtidig faldende signal opdeling i nogle tilfælde10,11. Kemisk derivatisering virker ved at tagge specifikke funktionelle grupper af metabolitter til at justere deres fysiske egenskaber som ladning eller hydrofobicitet for at øge ioniserings effektivitet11. Forskellige mærknings agenter kan anvendes til at målrette mod forskellige funktionelle grupper (f. eks. aminer, hydroxyls, phosphater, carboxylsyrer osv.). Aniline, en sådan forædling agent, mål flere funktionelle grupper på én gang, og tilføjer en hydrofobe komponent i hydrofile molekyler, og dermed øge deres separation opløsning og signal12. For at imødegå den Co-eluting matrix ion suppression effekt, Yang og kollegaer udviklet en teknik baseret på gruppe specifik intern standard teknologi (gsist) mærkning, hvor standarder er mærket med 13C anilin isotoper og blandes med prøven 12,13. Metabolitten og den tilsvarende interne standard har samme ioniserings effektivitet, da de er co-elute, og deres intensitets forhold kan anvendes til at kvantificere koncentrationen i den eksperimentelle prøve.
I denne undersøgelse udviklede vi en protokol til påvisning og kvantificering af 40-forbindelser, der er involveret i glykolyse, pentose-fosfat vejen, tricarboxylsyrecyklussen, energimetabolisme og cofaktor regenerering i CFPS-reaktioner. Metoden er baseret på GSIST tilgang, hvor vi brugte 12c-aniline og 13c-anilin til at mærke, opdage og kvantificere metabolitter ved hjælp af omvendt fase LC/MS. Det lineære område af alle forbindelser strakte 2-3 størrelsesordener med en gennemsnitlig korrelationskoefficient på 0,988. Således, metoden er en robust og præcis tilgang til afhøre celle-fri metabolisme, og muligvis helcelle ekstrakter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:665px;" width="665">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">12C Aniline</td>
			<td style="width:121px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">242284</td>
			<td style="width:167px;">Aniline 12C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">13C labeled aniline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>485797</td>
			<td>Aniline 13C6</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">3-Phosphoglyceric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8877</td>
			<td>3PG</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetic Acid</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>AC222140010</td>
			<td>ACE</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile, LCMS</td>
			<td>JT BAKER</td>
			<td>9829-03</td>
			<td>ACN</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetyl-coenzyme A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2056</td>
			<td>ACA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acquity UPLC BEH C18 1.7 &#956;M, 2.1 x 150 mm Column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186002353</td>
			<td>Column</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adenosine diphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2754</td>
			<td>ADP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adenosine monophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1752</td>
			<td>AMP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adenosine triphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td>ATP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alpha-ketoglutarate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1128</td>
			<td>aKG</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>251275</td>
			<td>CIT</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytidine diphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9755</td>
			<td>CDP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytidine monophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1006</td>
			<td>CMP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytidine triphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9274</td>
			<td>CTP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">D-glyceraldehyde 3-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>39705</td>
			<td>GAP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Erythrose 4-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E0377</td>
			<td>E4P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EX0276</td>
			<td>EtOH</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fisher Scientific accuSpin Micro 17 Centrifuge</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td></td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Flavin adenine dinucleotide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6625</td>
			<td>FAD</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fructose 1,6-bisphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6803</td>
			<td>F16P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fructose 6-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3627</td>
			<td>F6P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fumarate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8509</td>
			<td>FUM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gluconate 6-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7877</td>
			<td>6PG</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>GLC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose 6-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7879</td>
			<td>G6P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol 3-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7886</td>
			<td>Gly3P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Guanosine diphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7127</td>
			<td>GDP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Guanosine monophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8377</td>
			<td>GMP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Guanosine triphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td>GTP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258148</td>
			<td>HCl</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isocitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1252</td>
			<td>ICIT</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L1750</td>
			<td>LAC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Malate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>02288</td>
			<td>MAL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">myTXTL - Sigma 70 Master Mix Kit</td>
			<td>ArborBiosciences</td>
			<td>507024</td>
			<td>Cell-free protein synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N-(3-dimethylaminopropyl)-N&#8242;-ethylcarbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03449</td>
			<td>EDC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nicotinamide adenine dinucleotide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43410</td>
			<td>NAD</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N5755</td>
			<td>NADP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>481973</td>
			<td>NADPH</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nicotinamide adenine dinucleotide reduced</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N8129</td>
			<td>NADH</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Oxalacetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O4126</td>
			<td>OAA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphoenolpyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0564</td>
			<td>PEP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280</td>
			<td>PYR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ribose 5-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R7750</td>
			<td>R5P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ribulose 5-phosphate</td>
			<td>CarboSynth</td>
			<td>MR45852</td>
			<td>RL5P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sedoheptulose 7-phosphate</td>
			<td>CarboSynth</td>
			<td>MS07457</td>
			<td>S7P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Succinate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3674</td>
			<td>SUCC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tributylamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90780</td>
			<td>TBA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triethylamine</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>O4884</td>
			<td>TEA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ultrapure water</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>10977-015</td>
			<td>water</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Uridine diphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U4125</td>
			<td>UDP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Uridine monophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6375</td>
			<td>UMP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Uridine triphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6625</td>
			<td>UTP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">VWR Heavy Duty Vortex</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>Vortex</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Water, LCMS</td>
			<td>JT BAKER</td>
			<td>9831-03</td>
			<td>WATER</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters Acquity H UPLC Class Quaternary Solvent Manager</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>LCMS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters Acquity H UPLC Class Sample Manager FTN</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>LCMS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters Acquity Qda detector</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>LCMS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters Empower 3</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters LCMS Total Recovery Vial</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186000384c</td>
			<td>LCMS Vial</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

absolute quantification of cell-free protein synthesis metabolism by reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry

Celle-fri Proteinsyntese (CFP'ER) er en ny teknologi i systemer og syntetisk biologi til in vitro-produktion af proteiner. Men hvis CFP'ER kommer til at bevæge sig ud over laboratoriet og blive en udbredt og standard lige i tiden fremstillingsteknologi, skal vi forstå de præstationsgrænser for disse systemer. Mod dette spørgsmål, vi udviklet en robust protokol til kvantificere 40 forbindelser involveret i glycolyse, pentose fosfat pathway, tricarboxylsyre cyklus, energimetabolisme og cofaktor regenerering i CFPS reaktioner. Metoden bruger interne standarder Tagged med 13c-Anilin, mens forbindelser i prøven er derivatized med 12c-anilin. De interne standarder og prøven blev blandet og analyseret ved omvendt fase væskekromatografi-massespektrometri (LC/MS). Co-eluering af forbindelser eliminerede ionsuppression, hvilket gjorde det muligt nøjagtigt at kvantificere metabolitten koncentrationer over 2-3 størrelsesordener, hvor den gennemsnitlige korrelationskoefficient var 0,988. Fem af de 40 forbindelser blev ukodet med Anilin, men de blev stadig påvist i CFPS-prøven og kvantificerede med en standardkurve metode. Kromatografi kørslen tager ca. 10 min. for at fuldføre. Tilsammen udviklede vi en hurtig og robust metode til at adskille og præcist kvantificere 40-forbindelser, der er involveret i CFP'ER, i en enkelt LC/MS-løbetur. Metoden er en omfattende og præcis tilgang til at karakterisere cellefri metabolisme, så vi i sidste ende kan forstå og forbedre udbyttet, produktiviteten og energieffektiviteten af celle frie systemer.

Som et proof-of-koncept brugte vi protokollen til at kvantificere metabolitter i et E. coli -baseret CFPS-system, der udtrykker grønt fluorescerende protein (gfp).  CFPS-reaktionen (14 μL) blev standset og deproteiniseret med ethanol. CFPS-prøven blev derefter mærket med 12c-Anilin, mens standarderne blev mærket med 13c-anilin. Den mærkede prøve og standarderne blev derefter kombineret og injiceret i LC/MS (figur 1). Protokollen afslørede og kvantifice...

Watch this Scientific Journal Video about Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry at JoVE.com

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Her præsenterer vi en robust protokol for at kvantificere 40 forbindelser involveret i Central Carbon og energimetabolisme i celle-fri proteinsyntese reaktioner. Den celle frie syntese blanding er derivatized med anilin for effektiv adskillelse ved hjælp af omvendt fase væskekromatografi og derefter kvantificeret ved massespektrometri ved hjælp af isotopisk mærkede interne standarder.

Absolut kvantificering af celle frit protein syntese metabolisme ved omvendt fase-væskekromatografi-massespektrometri

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Cellefri proteinsyntese er en ny teknologi i systemer og syntetisk biologi til in vitro produktion af proteiner. Cellefrie proteinsyntesesystemer har ingen cellevæg, og derfor har vi direkte adgang til metabolitter. I denne protokol kvantificerer vi de absolutte målinger af 40 metabolitter, der er involveret i det centrale kulstof- og energimetabolisme, hvilket giver os mulighed for at karakterisere cellefri metabolisme.Protokollen bygger på metastaseringen af forbindelserne med anilin, hvilket giver mulighed for bedre adskillelse og højere massespektrometriopløsning. Derudover bruger vi interne standarder med en isotop vi mærke anilin, for absolut kvantificering af metabolitter. De mærkede metabolitter coelute, som eliminerer virkningerne af jern undertrykkelse.Giver mulighed for nøjagtig kvantificering af forbindelserne. Arbejde i en hætte, kombinere 550 mikroliter af anilin, med 337,5 mikroliter af LC-MS grade vand. Og 112,5 mikroliter af 12 molar saltsyre i et centrifugerør.Vortex godt, og gemme de seks molar anilin løsning på pH 4,5 og fire grader Celsius. For at forberede en seks molar carbon-13 anilin opløsning, på pH 4,5, kombinere 250 milligram kulstof-13 anilin med 132 mikrostitter vand, og 44 mikroslitere af 12 molar saltsyre. Vortex godt, og gemme på fire grader Celsius.For at forberede 200 mg pr. milliliter EDC-opløsning opløses to milligram EDC i 10 mikroliter vand for hver prøve, der skal mærkes. Og vortex godt. At forberede prøver, slukke og bundfælde proteinerne i en cellefri proteinsyntese reaktion, ved at tilføje en lige volumen af iskold 100% ethanol til celle-fri syntese reaktion.Centrifuge prøven ved 12,000 gange g, i 15 minutter ved fire grader Celsius. Prøvens supernatant overføres til et nyt centrifugerør. For at mærke prøven med carbon-12 anilinopløsning overføres seks mikroliter af prøven til et nyt centrifugerør, og volumen bringes til 50 mikroliter med vand.Tilsæt 5 mikroliter på 200 mg pr. milliliter EDC-opløsning, bland carbon-12 anilinopløsningen godt, og overfør 5 mikroliter ind i røret. Vortex reaktionen med blid omrystning i to timer ved stuetemperatur. Efter to timer fjernes rørene fra rysteren, og de overføres til en røghætte.Der tilsættes 1,5 mikroliter triethylamin til hver reaktion for at stoppe anilinmærkningen og stabilisere forbindelserne. Centrifuge ved 13,500 gange g i tre minutter. Og gem supernatanten.For at mærke de interne standarder med carbon-13 anilinopløsning skal den interne stamopløsning fortyndes til 80 mikromolar med et endeligt volumen på 50 mikroliter. Tilføj fem mikroliter af 200 milligram per milliliter EDC-opløsning, og fem mikroliter af den godt blandet kulstof-13 anilin opløsning. Vortex reaktionen med blid omrystning i to timer ved stuetemperatur.Efter to timer fjernes rørene fra shakeren, og der tilsættes 1,5 mikroliter triethylamin til reaktionen i en røghætte. Centrifuge ved 13, 500 gange g i tre minutter og gem supernatanten. At guddommelige den mærkede interne standard, og den mærkede prøve, bland 25 mikroliter af hver i en autosampler hætteglas.Og analysere ved LC-MS procedure. Derefter, at skabe en standard kurve for ukodede metabolitter, først, fortynde bestanden opløsning af ukodede metabolitter til forskellige koncentrationer, med volumen på 50 mikroliter. Tilføj fem mikroliter af 200 milligram per milliliter EDC-opløsning, og fem mikroliter af carbon-12 anilin opløsning til hver koncentration.Vortex reaktionen med blid omrystning i to timer ved stuetemperatur. Og fortsæt med triethylaminbehandlingen. Og centrifugalisering før analyse af LC-MS som tidligere.Efter initialisering af LC-MS indsprøjtes fem mikroliter af prøven i kolonnen efter initialiseringen. Og erhverve de relevante m over z ion intensiteter for kulstof-12 anilin mærkede prøve. Derefter injiceres fem mikroliter af samme prøve igen.Og erhverve m over z ion intensiteter for kulstof-13 anilin mærkede standarder. I denne protokol blev metabolitter, der udtrykker grønt fluorescerende protein i en E.coli-baseret cellefri proteinsyntese, kvantificeret. 40 metabolitter involveret i centrale kulstof og energi metabolisme, blev opdaget og kvantificeret ved hjælp af interne standarder.Mens en standard kurve for fem af de metabolitter, der ikke var mærket med anilin blev også udviklet. De forskellige metabolitter, der var involveret i disse veje, var en klasse af fosforyleret sukker, fosfor-carboxylsyrer, carboxylsyrer, nukleotider og co-faktorer. Desuden gjorde metoden det muligt at udskille strukturelle isomerpar, såsom glucose-seks fosfat, og fruktose-seks fosfat i en enkelt LC-MS-kørsel.Det vigtigste skridt er mærkning af de-proteiniseret prøve med anilin. Da anilinløsningen adskilles, er det vigtigt at arbejde hurtigt og effektivt, samtidig med at god sikkerhedspraksis opretholdes. Denne metode hjælper med at karakterisere cellefri metabolisme med kvantificeringen af 40 metabolitter.Men, yderligere forbindelser er i celle-fri blanding, såsom aminosyrer, der kan kvantificeres. Dette ville bidrage til at give et mere omfattende kig ind i celle-fri metabolisme. Denne metode viste, at cellefrie systemer har komplekse stofskifter, der stadig fungerer, som potentielt kan udnyttes til bedre energieffektivitet og kulstofudbytte.Protokollen bygger på mærkning af forbindelser med anilin med brug af EDC som katalysator. Begge disse reagenser er farlige og bør anvendes med forsigtighed.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrosprayioniserings Brint-deuterium Exchange-massespektrometri til at studere proteiners struktur og Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Løsning affinitetsrensede proteinkomplekser ved Blå Native PAGE og protein Korrelation Profilering

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

En Tandem væskekromatografi-massespektrometri-baseret tilgang til Metabolit Analyse af<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Dyb proteomet profilering af Isobar mærkning, omfattende væskekromatografi, massespektrometri og Software-assisteret kvantificering

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Høj følsomhed måling af transskription faktor-DNA bindende tilhørsforhold ved konkurrencedygtige titrering med Fluorescens mikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Påvisning af proteinubiquitinationssteder ved peptidberigelse og massespektrometri

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ analyse af cellulære lipidom af Saccharomyces Cerevisiae Ved hjælp af flydende kromatografi kombineret med tandem massespektrometri

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Oprettelse af meget specifikke kemisk induceret protein Dimerization systemer ved trinvis Phage udvælgelse af en kombinatorisk enkelt domæne antistof bibliotek

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Umålrettet flydende kromatografi-massespektrometri-baserede metabolomiske analyse af hvedekorn

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...