Name: absolute quantification of cell-free protein synthesis metabolism by reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry
Uploaded: 2019-10-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry at JoVE.com

Het beschreven werk werd gesteund door het centrum op de fysica van kanker metabolisme door middel van Award nummer 1U54CA210184-01 van het National Cancer Institute (https://www.cancer.gov/). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van het National Cancer Institute of de National Institutes of Health. De financiers hadden geen rol in studie ontwerp, gegevensverzameling en-analyse, besluit om te publiceren of voorbereiding van het manuscript.

1. bereiding van reagentia voor aniline-tagging
<ol><li>Bereid een aniline oplossing van 6 M bij pH 4,5. Werk in een afzuigkap, combineer 550 μL aniline met 337,5 μL LCMS water en 112,5 μL van 12 M zoutzuur (HCl) in een centrifugebuis. Vortex goed en bewaren bij 4 °C. Opmerking: aniline kan gedurende 2 maanden bij 4 °C worden bewaard. Let op: aniline is zeer giftig en moet in een rook afzuigkap worden bewerkt. Zoutzuur is zeer corrosief</li>
	<li>Bereid een aniline oplossing van 6 M 13C bij pH 4,5...

<ol>
	<li>Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthetic+biology:+thinking+outside+the+cell.">Cell-free synthetic biology: thinking outside the cell.</a> Metabolic Engineering. 14, 261-269 (2012).</li><li>Vilkhovoy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+specific+modeling+of+E.+coli+cell-free+protein+synthesis.">Sequence specific modeling of E. coli cell-free protein synthesis.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (8), 1844-1857 (2018).</li><li>Vilkhovoy, M., Minot, M., Varner, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+dynamic+models+of+metabolic+networks.">Effective dynamic models of metabolic networks.</a> IEEE Life Sciences Letters. 2 (4), 51-54 (2016).</li><li>Horvath, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+genome+scale+sequence+specific+dynamic+model+of+cell-free+protein+synthesis+in+Escherichia+coli.">Toward a genome scale sequence specific dynamic model of cell-free protein synthesis in Escherichia coli.</a> bioRxiv. , 215012 (2017).</li><li>Dettmer, K., Aronov, P. A., Hammock, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+metabolomics.">Mass spectrometry-based metabolomics.</a> Mass spectrometry reviews. 26 (1), 51-78 (2007).</li><li>Hajjaj, H., Blanc, P. J., Goma, G., Fran&#231;ois, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sampling+techniques+and+comparative+extraction+procedures+for+quantitative+determination+of+intra-+and+extracellular+metabolites+in+filamentous+fungi.">Sampling techniques and comparative extraction procedures for quantitative determination of intra- and extracellular metabolites in filamentous fungi.</a> FEMS Microbiology Letters. 164 (1), 195-200 (1998).</li><li>Ruijter, G. J. G., Visser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+intermediary+metabolites+in+Aspergillus+niger.">Determination of intermediary metabolites in Aspergillus niger.</a> Journal of Microbiological Methods. 25 (3), 295-302 (1996).</li><li>Mailinger, W., Baltes, M., Theobald, U., Reuss, M., Rizzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+metabolic+dynamics+in+Saccharomyces+cerevisiae:+I.+Experimental+observations.">In vivo analysis of metabolic dynamics in Saccharomyces cerevisiae: I. Experimental observations.</a> Biotechnology and Bioengineering. 55 (2), 305-316 (1997).</li><li>Dunn, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+appeal:+metabolite+identification+in+mass+spectrometry-focused+untargeted+metabolomics.">Mass appeal: metabolite identification in mass spectrometry-focused untargeted metabolomics.</a> Metabolomics. 9 (1), 44-66 (2013).</li><li>Huang, T., Toro, M., Lee, R., Hui, D. S., Edwards, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-functional+derivatization+of+amine,+hydroxyl,+and+carboxylate+groups+for+metabolomic+investigations+of+human+tissue+by+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Multi-functional derivatization of amine, hydroxyl, and carboxylate groups for metabolomic investigations of human tissue by electrospray ionization mass spectrometry.</a> Analyst. 143 (14), 3408-3414 (2018).</li><li>Huang, T., Armbruster, M. R., Coulton, J. B., Edwards, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+Tagging+in+Mass+Spectrometry+for+Systems+Biology.">Chemical Tagging in Mass Spectrometry for Systems Biology.</a> Analytical Chemistry. 91 (1), 109-125 (2019).</li><li>Yang, W. C., Sedlak, M., Regnier, F. E., Mosier, N., Ho, N., Adamec, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+quantification+of+metabolites+involved+in+central+carbon+and+energy+metabolism+using+reversed-phase+liquid+chromatography-mass+spectrometry+and+in+vitro+13C+labeling.">Simultaneous quantification of metabolites involved in central carbon and energy metabolism using reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry and in vitro 13C labeling.</a> Analytical Chemistry. 80 (24), 9508-9516 (2008).</li><li>Jannasch, A., Sedlak, M., Adamec, J., Metz, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Pentose+Phosphate+Pathway+(PPP)+Metabolites+by+Liquid+Chromatography-Mass+Spectrometry+(LC-MS).">Quantification of Pentose Phosphate Pathway (PPP) Metabolites by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS).</a> Metabolic Profiling. Methods in Molecular Biology 708 (Methods and Protocols). , 159-171 (2011).</li><li>Luo, B., Groenke, K., Takors, R., Wandrey, C., Oldiges, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+multiple+intracellular+metabolites+in+glycolysis,+pentose+phosphate+pathway,+and+tricarboxylic+acid+cycle+by+liquid+chromatography-mass+spectrometry.">Simultaneous determination of multiple intracellular metabolites in glycolysis, pentose phosphate pathway, and tricarboxylic acid cycle by liquid chromatography-mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography A. 1147 (2), 153-164 (2007).</li></ol>

Cel-vrije systemen hebben geen celwand, dus er is directe toegang tot metabolieten en de biosynthetische machines zonder dat complexe monstervoorbereiding nodig is. Er is echter heel weinig werk verzet om grondige en robuuste protocollen te ontwikkelen voor het meten van de celvrije reactie systemen. In deze studie ontwikkelden we een snelle, robuuste methode om metabolieten te kwantificeren in celvrije reactie mengsels en mogelijk in hele celextracten. Individuele kwantificering van metabolieten in complexe mengsels, zo...

Cel-vrije eiwitsynthese (CFPS) is een veelbelovend platform voor de vervaardiging van eiwitten en chemicaliën, een toepassing die traditioneel is gereserveerd voor levende cellen. Cel-vrije systemen zijn afgeleid van ruwe celextracten en elimineren de complicaties geassocieerd met celgroei1. Bovendien biedt CFPS directe toegang tot metabolieten en de biosynthetische machines zonder interferentie van een celwand. Een fundamenteel begrip van de prestatiegrenzen van de cel-vrije processen ontbreekt echter. High-throughput methoden voor de kwantificering van metaboliet zijn waardevol voor de karakterisering van het metabolisme en zijn van cruciaal belang voor de bouw van metabole computationele modellen2,3,4. Veelgebruikte methoden voor het bepalen van de metaboliet concentraties zijn nucleaire magnetische resonantie (NMR), Fourier-transformatie-infraroodspectroscopie (FT-IR), enzym gebaseerde testen en massaspectrometrie (MS)5,6,7 ,8. Echter, deze methoden worden vaak beperkt door hun onvermogen om efficiënt te meten van meerdere verbindingen tegelijk en vereisen vaak een steekproefgrootte groter is dan de typische cel-vrije reacties. Bijvoorbeeld, enzym gebaseerde assays kunnen vaak alleen worden gebruikt voor het kwantificeren van één samengestelde in een run, en zijn beperkt wanneer de grootte van het monster klein is, zoals in de cel-vrije eiwitsynthese Reacties (meestal uitgevoerd op een schaal van 10-15 μL). Ondertussen vereist NMR een grote overvloed aan metabolieten voor detectie en kwantificering5.  In de richting van deze tekortkomingen bieden chromatografie methoden in combinatie met massaspectrometrie (LC/MS) verschillende voordelen, waaronder hoge gevoeligheid en de mogelijkheid om meerdere soorten gelijktijdig te meten9; de analytische complexiteit neemt echter aanzienlijk toe met het aantal en de diversiteit van de soorten die worden gemeten. Het is daarom belangrijk om methoden te ontwikkelen die het hoge doorvoer potentieel van LC/MS-systemen volledig realiseren. Verbindingen in een monster worden gescheiden door vloeistofchromatografie en geïdentificeerd door middel van massaspectrometrie. Het signaal van de verbinding hangt af van de concentratie en de ionisatie-efficiëntie, waarbij de ionisatie kan variëren tussen verbindingen en kan ook afhangen van de monstermatrix.
Het bereiken van dezelfde ionisatie-efficiëntie tussen het monster en de normen is een uitdaging bij het gebruik van LC/MS om analyten te kwantificeren. Verder wordt kwantificering uitdagender met de diversiteit van de metaboliet als gevolg van signaal splitsing en heterogeniteit in Proton affiniteit en polariteit10. Ten slotte kan de co-eluting-matrix van het monster ook invloed hebben op de ionisatie-efficiëntie van de verbindingen. Om deze problemen aan te pakken, kunnen metabolieten chemisch worden afgeleid, waardoor de scheidings resolutie en gevoeligheid door LC/MS-systemen worden vergroot, terwijl tegelijkertijd de signaal splitsing in sommige gevallen10,11wordt verlaagd. Chemische derivatisatie werkt door specifieke functionele groepen van metabolieten te taggen om hun fysische eigenschappen zoals charge of hydrofobiciteit aan te passen om de ionisatie-efficiëntie te verhogen11. Verschillende tagstoffen kunnen worden gebruikt om verschillende functionele groepen te targeten (bijv. amines, hydroxyls, fosfaten, carbonzuren, enz.). Aniline, een dergelijke derivatisatie-agent, richt zich op meerdere functionele groepen tegelijk, en voegt een hydrofobe component toe aan hydrofiele moleculen, waardoor hun scheidings resolutie en signaal12toenemen. Om het co-eluting-matrix-ionen onderdrukkings effect aan te pakken, ontwikkelden Yang en collega's een techniek op basis van groepsspecifieke interne standaard technologie (GSIST)-labeling waarbij normen zijn gelabeld met 13C aniline-isotopen en vermengd met het monster 12,13. De metaboliet en de corresponderende interne standaard hebben dezelfde ionisatie-efficiëntie omdat ze co-elute, en hun intensiteit ratio kan worden gebruikt om de concentratie in het experimentele monster te kwantificeren.
In deze studie ontwikkelden we een protocol voor het opsporen en kwantificeren van 40 verbindingen die betrokken zijn bij de glycolyse, de pentose fosfaat pathway, de tricarboxylzuurcyclus, het energiemetabolisme en de cofactor-regeneratie bij CFPS-reacties. De methode is gebaseerd op de GSIST-benadering, waarbij we 12c-aniline en 13c-aniline gebruikten om metabolieten te taggen, te detecteren en te kwantificeren met behulp van omgekeerde fase LC/MS. Het lineaire bereik van alle verbindingen omspannen 2-3 ordes van grootte met een gemiddelde correlatiecoëfficiënt van 0,988. Dus, de methode is een robuuste en nauwkeurige benadering van interrogaat cel-vrije metabolisme, en eventueel hele-celextracten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:665px;" width="665">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">12C Aniline</td>
			<td style="width:121px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">242284</td>
			<td style="width:167px;">Aniline 12C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">13C labeled aniline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>485797</td>
			<td>Aniline 13C6</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">3-Phosphoglyceric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8877</td>
			<td>3PG</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetic Acid</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>AC222140010</td>
			<td>ACE</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile, LCMS</td>
			<td>JT BAKER</td>
			<td>9829-03</td>
			<td>ACN</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetyl-coenzyme A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2056</td>
			<td>ACA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acquity UPLC BEH C18 1.7 &#956;M, 2.1 x 150 mm Column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186002353</td>
			<td>Column</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adenosine diphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2754</td>
			<td>ADP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adenosine monophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1752</td>
			<td>AMP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adenosine triphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td>ATP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alpha-ketoglutarate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1128</td>
			<td>aKG</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>251275</td>
			<td>CIT</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytidine diphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9755</td>
			<td>CDP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytidine monophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1006</td>
			<td>CMP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytidine triphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9274</td>
			<td>CTP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">D-glyceraldehyde 3-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>39705</td>
			<td>GAP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Erythrose 4-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E0377</td>
			<td>E4P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EX0276</td>
			<td>EtOH</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fisher Scientific accuSpin Micro 17 Centrifuge</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td></td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Flavin adenine dinucleotide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6625</td>
			<td>FAD</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fructose 1,6-bisphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6803</td>
			<td>F16P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fructose 6-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3627</td>
			<td>F6P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fumarate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8509</td>
			<td>FUM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gluconate 6-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7877</td>
			<td>6PG</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>GLC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose 6-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7879</td>
			<td>G6P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol 3-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7886</td>
			<td>Gly3P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Guanosine diphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7127</td>
			<td>GDP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Guanosine monophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8377</td>
			<td>GMP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Guanosine triphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td>GTP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258148</td>
			<td>HCl</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isocitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1252</td>
			<td>ICIT</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L1750</td>
			<td>LAC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Malate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>02288</td>
			<td>MAL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">myTXTL - Sigma 70 Master Mix Kit</td>
			<td>ArborBiosciences</td>
			<td>507024</td>
			<td>Cell-free protein synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N-(3-dimethylaminopropyl)-N&#8242;-ethylcarbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03449</td>
			<td>EDC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nicotinamide adenine dinucleotide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43410</td>
			<td>NAD</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N5755</td>
			<td>NADP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>481973</td>
			<td>NADPH</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nicotinamide adenine dinucleotide reduced</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N8129</td>
			<td>NADH</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Oxalacetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O4126</td>
			<td>OAA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphoenolpyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0564</td>
			<td>PEP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280</td>
			<td>PYR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ribose 5-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R7750</td>
			<td>R5P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ribulose 5-phosphate</td>
			<td>CarboSynth</td>
			<td>MR45852</td>
			<td>RL5P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sedoheptulose 7-phosphate</td>
			<td>CarboSynth</td>
			<td>MS07457</td>
			<td>S7P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Succinate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3674</td>
			<td>SUCC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tributylamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90780</td>
			<td>TBA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triethylamine</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>O4884</td>
			<td>TEA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ultrapure water</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>10977-015</td>
			<td>water</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Uridine diphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U4125</td>
			<td>UDP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Uridine monophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6375</td>
			<td>UMP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Uridine triphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6625</td>
			<td>UTP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">VWR Heavy Duty Vortex</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>Vortex</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Water, LCMS</td>
			<td>JT BAKER</td>
			<td>9831-03</td>
			<td>WATER</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters Acquity H UPLC Class Quaternary Solvent Manager</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>LCMS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters Acquity H UPLC Class Sample Manager FTN</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>LCMS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters Acquity Qda detector</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>LCMS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters Empower 3</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters LCMS Total Recovery Vial</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186000384c</td>
			<td>LCMS Vial</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

absolute quantification of cell-free protein synthesis metabolism by reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry

Cel-vrije eiwitsynthese (CFPS) is een opkomende technologie in systemen en synthetische biologie voor de in vitro productie van eiwitten. Als CFP'S echter verder gaan dan het laboratorium en een wijdverspreide en standaard just-in-time productietechnologie worden, moeten we de prestatielimieten van deze systemen begrijpen. In de richting van deze vraag, ontwikkelden we een robuust protocol om te kwantificeren 40 verbindingen die betrokken zijn bij glycolyse, de pentose fosfaat pathway, de tricarboxylzuurcyclus, energiemetabolisme en cofactor regeneratie in CFPS reacties. De methode maakt gebruik van interne normen gelabeld met 13c-aniline, terwijl verbindingen in het monster zijn guarderivaten met 12c-aniline. De interne normen en het monster werden gemengd en geanalyseerd met reversed-phase vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC/MS). De co-elutie van verbindingen geëlimineerd ionen onderdrukking, waardoor de nauwkeurige kwantificering van metaboliet concentraties over 2-3 ordes van grootte, waar de gemiddelde correlatiecoëfficiënt 0,988 was. Vijf van de 40-verbindingen waren niet gelabeld met aniline, maar ze werden nog steeds gedetecteerd in het CFPS-monster en gekwantificeerd met een standaard curve methode. De chromatografische uitvoering duurt ongeveer 10 minuten om te voltooien. Samen hebben we een snelle, robuuste methode ontwikkeld voor het scheiden en nauwkeurig kwantificeren van 40-verbindingen die betrokken zijn bij CFP'S in één LC/MS-run. De methode is een uitgebreide en nauwkeurige benadering om het celvrije metabolisme te karakteriseren, zodat we uiteindelijk de opbrengst, productiviteit en energie-efficiëntie van cel-vrije systemen kunnen begrijpen en verbeteren.

Als proof-of-concept gebruikten we het protocol om metabolieten te kwantificeren in een E. coli gebaseerd CFPS systeem dat groen fluorescerende eiwitten (GFP) uitdrukt.  De CFPS-reactie (14 μL) werd uitgeblust en gedeproteïniseerd met ethanol. De CFPS sample werd vervolgens getagd met 12c-aniline, terwijl de normen werden getagd met 13c-aniline. Het gelabelde monster en de normen werden vervolgens gecombineerd en geïnjecteerd in de LC/MS (Figuur 1). Het pro...

Watch this Scientific Journal Video about Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry at JoVE.com

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Hier presenteren we een robuust protocol voor het kwantificeren van 40 verbindingen die betrokken zijn bij het centrale koolstof-en energiemetabolisme in celvrije eiwitsynthese reacties. Het celvrije synthese mengsel wordt met aniline gekwantificeerd voor effectieve scheiding met behulp van omgekeerde-fase vloeistofchromatografie en vervolgens door massaspectrometrie met behulp van isotopisch gelabelde interne normen.

Absolute kwantificering van de Celvrije eiwitsynthese metabolisme door omgekeerde fase vloeistofchromatografie-massaspectrometrie

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Celvrije eiwitsynthese is een opkomende technologie in systemen en synthetische biologie voor de in vitro productie van eiwitten. Celvrije eiwitsynthesesystemen hebben geen celwand, dus we hebben directe toegang tot metabolieten. In dit protocol kwantificeren we de absolute metingen van 40 metabolieten die betrokken zijn bij het centrale koolstof- en energiemetabolisme, waardoor we het celvrije metabolisme kunnen karakteriseren.Het protocol is gebaseerd op het uitzaaien van de verbindingen met aniline, die zorgt voor een betere scheiding en een hogere massa spectrometrie resolutie. Daarnaast gebruiken we interne standaarden met een isotopen die we aniline labelen, voor absolute kwantificering van de metabolieten. De getagde metabolieten coelute, die de effecten van ijzeronderdrukking elimineert.Rekening laten met de nauwkeurige kwantificering van de verbindingen. Werken in een kap, combineren 550 microliter van de aniline, met 337,5 microliter van LC-MS grade water. En 112,5 microliter van 12 molair zoutzuur in een centrifugebuis.Vortex goed, en bewaar de zes kies aniline oplossing op pH 4,5 en vier graden Celsius. Voor de bereiding van een zes molaire koolstof-13 aniline oplossing, bij pH 4.5, combineren 250 milligram koolstof-13 aniline met 132 microliter water, en 44 microliter van 12 molaire zoutzuur. Vortex goed, en bewaar op vier graden Celsius.Om 200 milligram per milliliter EDC-oplossing voor te bereiden, los twee milligram EDC op in 10 microliter water voor elk te labelen monster. En vortex goed. Om monsters voor te bereiden, de eiwitten te doven en neerslaan in een celvrije eiwitsynthesereactie, door een gelijk volume ijskoude 100% ethanol toe te voegen aan de celvrije synthesereactie.Centrifugeren het monster op 12.000 keer g, gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius. Breng de supernatant van het monster over naar een nieuwe centrifugebuis. Als u het monster wilt labelen met koolstof-12-aniline-oplossing, brengt u zes microliter van het monster over in een nieuwe centrifugebuis en brengt u het volume op 50 microliter met water.Voeg 5 microliter van 200 milligram per milliliter EDC-oplossing toe, meng de koolstof-12 aniline-oplossing goed en breng 5 microliter in de buis. Vortex de reactie met zachte schudden voor twee uur bij kamertemperatuur. Na twee uur, verwijder de buizen uit de shaker en breng ze in een rookkap.Voeg 1,5 microliter triethylamine toe aan elke reactie om de aniline tagging reactie te stoppen en de verbindingen te stabiliseren. Centrifuge op 13, 500 keer g gedurende drie minuten. En red de supernatant.Om de interne normen te labelen met koolstof-13 aniline-oplossing, verdun de interne voorraadoplossing tot 80 micromolar met een eindvolume van 50 microliter. Voeg vijf microliter van de 200 milligram per milliliter EDC-oplossing, en vijf microliters van de goed gemengde koolstof-13 aniline oplossing. Vortex de reactie met zachte schudden voor twee uur bij kamertemperatuur.Na twee uur, verwijder de buizen uit de shaker, en voeg 1,5 microliter triethylamine aan de reactie in een rookkap. Centrifuge op 13, 500 keer g gedurende drie minuten en sla de supernatant. Om de gelabelde interne standaard en het getagde monster te goddelijk, meng je 25 microliters van elk in een autosampler flacon.En analyseren door de LC-MS procedure. Vervolgens, om een standaardcurve voor niet-getagged metabolieten te maken, verdun eerst de voorraadoplossing van niet-getagged metabolieten tot verschillende concentraties, met een volume van 50 microliter. Voeg vijf microliter van de 200 milligram per milliliter EDC-oplossing, en vijf microliters van koolstof-12 aniline oplossing aan elke concentratie.Vortex de reactie met zachte schudden voor twee uur bij kamertemperatuur. En ga verder met de triethylamine behandeling. En centrifugalisatie voordat het wordt geanalyseerd door de LC-MS zoals voorheen.Na het initialiseren van LC-MS, volgens de instructies van de fabrikant, injecteren vijf microliter van het monster in de kolom. En het verwerven van de juiste m over z ion intensiteiten voor de koolstof-12 aniline gelabeld monster. Injecteer vervolgens opnieuw vijf microliter van hetzelfde monster.En het verwerven van de m over z ion intensiteiten voor de carbon-13 aniline gelabelde normen. In dit protocol werden metabolieten die groene fluorescerende eiwitten uitdrukken in een celvrije eiwitsynthese op basis van E.coli gekwantificeerd. 40 metabolieten die betrokken zijn bij het centrale koolstof- en energiemetabolisme, werden gedetecteerd en gekwantificeerd met behulp van interne normen.Terwijl een standaardcurve voor vijf van de metabolieten die niet werden gelabeld met aniline werd ook ontwikkeld. De diverse metabolieten die betrokken zijn bij deze trajecten waren een klasse van fosforyleerde suikers, fosfor-carboxylzuren, carboxylzuren, nucleotiden, en co-factoren. Bovendien maakte de methode de scheiding van structurele isomerparen mogelijk, zoals glucose-zes fosfaat, en fructose-zes fosfaat in één LC-MS-run.De belangrijkste stap is het labelen van de gedeïtiediseerde monster met aniline. Aangezien de aniline-oplossing scheidt, is het belangrijk om snel en effectief te werken, met behoud van goede veiligheidspraktijken. Deze methode helpt om cel-vrij metabolisme te karakteriseren met de kwantificering van 40 metabolieten.Maar, extra verbindingen zijn in de cel-vrije mengsel, zoals aminozuren die kunnen worden gekwantificeerd. Dit zou helpen bij het verstrekken van een meer uitgebreide kijk op cel-vrije stofwisseling. Deze methode bleek dat cel-vrije systemen hebben complexe stofwisselingen, nog steeds actief die potentieel kunnen worden benut voor een betere energie-efficiëntie en koolstofopbrengst.Het protocol is gebaseerd op het taggen van de verbindingen met aniline met het gebruik van EDC als katalysator. Beide reagentia zijn gevaarlijk en moeten met de nodige voorzichtigheid worden gebruikt.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tijdsgeresolveerde elektrosprayionisatie waterstof-deuterium Exchange Massaspectrometrie voor het bestuderen van Protein Structure en Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Het oplossen van Affiniteit gezuiverde eiwit complexen door Blue inheemse PAGE en Protein Correlatie Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

Een vloeistofchromatografie tandem-massaspectrometrie gebaseerde benadering voor metabolietanalyse van<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Diepe Proteoom profilering door isobaar Labeling, uitgebreide vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en Software-bijgewoonde kwantificering

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Hoge gevoeligheid meten van transcriptie Factor-DNA-bindende affiniteiten concurrerende getitreerd wordt met behulp van fluorescentie microscopie

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Detectie van eiwitubiquitinatiesites door peptideverrijking en massaspectrometrie

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kwantitatieve analyse van de cellulaire lipidoom van Saccharomyces Cerevisiae met behulp van vloeibare chromatografie in combinatie met tandem massaspectrometrie

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Het creëren van zeer specifieke chemisch geïnduceerde eiwit Dimerization systemen door stepwise Phage selectie van een Combinatoriale één-domein antilichamen bibliotheek

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Ongerichte vloeibare chromatografie-massaspectrometrie-gebaseerde metabolomics analyse van tarwekorrel

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...