Name: absolute quantification of cell-free protein synthesis metabolism by reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry
Uploaded: 2019-10-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry at JoVE.com

Die beschriebene Arbeit wurde vom Center on the Physics of Cancer Metabolism durch den Award Nummer 1U54CA210184-01 des National Cancer Institute ( https://www.cancer.gov/ ) unterstützt. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Meinung des National Cancer Institute oder der National Institutes of Health dar. Die Geldgeber spielten keine Rolle bei der Studiengestaltung, Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.

1. Herstellung von Reagenzien zur Aniline-Kennzeichnung
<ol><li>Bereiten Sie eine 6 M Anilinelösung bei pH 4,5 vor. In einer Haube arbeiten, kombinieren Sie 550 l Aniin mit 337,5 l LCMS-Wasser und 112,5 l 12 M Salzsäure (HCl) in einem Zentrifugenrohr. Vortex gut und lagern bei 4 °C. HINWEIS: Aniline kann 2 Monate lang bei 4 °C gelagert werden. VORSICHT: Aniline ist hochgiftig und sollte mit einer Dunstabzugshaube bearbeitet werden. Salzsäure ist hochkorrosiv</li>
	<li>Bereiten Sie eine 6 M 13C Ani...

<ol>
	<li>Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthetic+biology:+thinking+outside+the+cell.">Cell-free synthetic biology: thinking outside the cell.</a> Metabolic Engineering. 14, 261-269 (2012).</li><li>Vilkhovoy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+specific+modeling+of+E.+coli+cell-free+protein+synthesis.">Sequence specific modeling of E. coli cell-free protein synthesis.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (8), 1844-1857 (2018).</li><li>Vilkhovoy, M., Minot, M., Varner, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+dynamic+models+of+metabolic+networks.">Effective dynamic models of metabolic networks.</a> IEEE Life Sciences Letters. 2 (4), 51-54 (2016).</li><li>Horvath, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+genome+scale+sequence+specific+dynamic+model+of+cell-free+protein+synthesis+in+Escherichia+coli.">Toward a genome scale sequence specific dynamic model of cell-free protein synthesis in Escherichia coli.</a> bioRxiv. , 215012 (2017).</li><li>Dettmer, K., Aronov, P. A., Hammock, B. 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G., Visser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+intermediary+metabolites+in+Aspergillus+niger.">Determination of intermediary metabolites in Aspergillus niger.</a> Journal of Microbiological Methods. 25 (3), 295-302 (1996).</li><li>Mailinger, W., Baltes, M., Theobald, U., Reuss, M., Rizzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+metabolic+dynamics+in+Saccharomyces+cerevisiae:+I.+Experimental+observations.">In vivo analysis of metabolic dynamics in Saccharomyces cerevisiae: I. Experimental observations.</a> Biotechnology and Bioengineering. 55 (2), 305-316 (1997).</li><li>Dunn, W. 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R., Coulton, J. B., Edwards, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+Tagging+in+Mass+Spectrometry+for+Systems+Biology.">Chemical Tagging in Mass Spectrometry for Systems Biology.</a> Analytical Chemistry. 91 (1), 109-125 (2019).</li><li>Yang, W. C., Sedlak, M., Regnier, F. E., Mosier, N., Ho, N., Adamec, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+quantification+of+metabolites+involved+in+central+carbon+and+energy+metabolism+using+reversed-phase+liquid+chromatography-mass+spectrometry+and+in+vitro+13C+labeling.">Simultaneous quantification of metabolites involved in central carbon and energy metabolism using reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry and in vitro 13C labeling.</a> Analytical Chemistry. 80 (24), 9508-9516 (2008).</li><li>Jannasch, A., Sedlak, M., Adamec, J., Metz, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Pentose+Phosphate+Pathway+(PPP)+Metabolites+by+Liquid+Chromatography-Mass+Spectrometry+(LC-MS).">Quantification of Pentose Phosphate Pathway (PPP) Metabolites by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS).</a> Metabolic Profiling. Methods in Molecular Biology 708 (Methods and Protocols). , 159-171 (2011).</li><li>Luo, B., Groenke, K., Takors, R., Wandrey, C., Oldiges, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+multiple+intracellular+metabolites+in+glycolysis,+pentose+phosphate+pathway,+and+tricarboxylic+acid+cycle+by+liquid+chromatography-mass+spectrometry.">Simultaneous determination of multiple intracellular metabolites in glycolysis, pentose phosphate pathway, and tricarboxylic acid cycle by liquid chromatography-mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography A. 1147 (2), 153-164 (2007).</li></ol>

Zellfreie Systeme haben keine Zellwand, so dass es direkten Zugang zu Metaboliten und den biosynthetischen Maschinen ohne komplexe Probenvorbereitung gibt. Es wurde jedoch nur sehr wenig an der Entwicklung gründlicher und robuster Protokolle zur quantitativen Abhörung zellfreier Reaktionssysteme gearbeitet. In dieser Studie haben wir eine schnelle, robuste Methode zur Quantifizierung von Metaboliten in zellfreien Reaktionsgemischen und potenziell in Ganzzellextrakten entwickelt. Die individuelle Quantifizierung von Met...

Die zellfreie Proteinsynthese (CFPS) ist eine vielversprechende Plattform für die Herstellung von Proteinen und Chemikalien, eine Anwendung, die traditionell lebenden Zellen vorbehalten ist. Zellfreie Systeme werden aus rohen Zellextrakten abgeleitet und eliminieren die Komplikationen im Zusammenhang mit dem Zellwachstum1. Darüber hinaus ermöglicht CFPS den direkten Zugang zu Metaboliten und biosynthetischen Maschinen ohne Die Interferenz einer Zellwand. Es fehlt jedoch an einem grundlegenden Verständnis der Leistungsgrenzen zellfreier Prozesse. Hochdurchsatzmethoden zur Metabolitenquantifizierung sind wertvoll für die Charakterisierung des Stoffwechsels und entscheidend für den Aufbau metabolischer Rechenmodelle2,3,4. Häufige Methoden zur Bestimmung der Metabolitenkonzentrationen sind Kernspinresonanz (NMR), Fourier-Transformations-Infrarot-Spektroskopie (FT-IR), enzymbasierte Assays und Massenspektrometrie (MS)5,6,7 ,8. Diese Methoden sind jedoch oft durch ihre Unfähigkeit, mehrere Verbindungen gleichzeitig effizient zu messen, begrenzt und erfordern oft eine Probengröße, die größer ist als typische zellfreie Reaktionen. Beispielsweise können enzymbasierte Assays oft nur zur Quantifizierung einer einzelnen Verbindung in einem Lauf verwendet werden und sind begrenzt, wenn die Stichprobengröße klein ist, z. B. bei zellfreien Proteinsynthesereaktionen (in der Regel auf einer Skala von 10-15 L). In der Zwischenzeit erfordert NMR eine hohe Fülle von Metaboliten für die Detektion und Quantifizierung5.  Angesichts dieser Unzulänglichkeiten bieten Chromatographiemethoden in Verbindung mit der Massenspektrometrie (LC/MS) mehrere Vorteile, darunter eine hohe Empfindlichkeit und die Fähigkeit, mehrere Arten gleichzeitig zu messen9; Die analytische Komplexität nimmt jedoch erheblich zu, da die Anzahl und Vielfalt der Arten gemessen wird. Daher ist es wichtig, Methoden zu entwickeln, die das Hohe Durchsatzpotenzial von LC/MS-Systemen voll ausschöpfen. Verbindungen in einer Probe werden durch flüssige Chromatographie getrennt und durch Massenspektrometrie identifiziert. Das Signal der Verbindung hängt von seiner Konzentration und Ionisationseffizienz ab, wobei die Ionisation zwischen Verbindungen variieren kann und auch von der Probenmatrix abhängen kann.
Die gleiche Ionisationseffizienz zwischen der Probe und den Standards zu erreichen, ist eine Herausforderung, wenn LC/MS zur Quantifizierung von Analyten verwendet wird. Darüber hinaus wird die Quantifizierung mit der Metabolitenvielfalt aufgrund der Signalspaltung und Heterogenität in Protonenaffinität und Polarität10schwieriger. Schließlich kann die Co-Eluing-Matrix der Probe auch die Ionisierungseffizienz der Verbindungen beeinflussen. Um diese Probleme zu lösen, können Metaboliten chemisch ableitungsiert werden, wodurch die Trennungsauflösung und Empfindlichkeit durch LC/MS-Systeme erhöht wird, während gleichzeitig die Signalspaltung in einigen Fällen10,11verringert wird. Chemische Derivatisierung funktioniert durch Tagging bestimmte funktionelle Gruppen von Metaboliten, um ihre physikalischen Eigenschaften wie Ladung oder Hydrophobizität anzupassen, um die Ionisationseffizienz zu erhöhen11. Verschiedene Tagging-Mittel können verwendet werden, um verschiedene funktionelle Gruppen (z.B. Aumine, Hydroxyle, Phosphate, Carbonsäuren usw.) anzusprechen. Aniline, ein solches Derivatisierungsmittel, zielt auf mehrere funktionelle Gruppen gleichzeitig ab und fügt eine hydrophobe Komponente in hydrophile Moleküle ein, wodurch ihre Trennungsauflösung und das Signal12erhöht werden. Um den Co-Eluing-Matrix-Ionenunterdrückungseffekt zu beheben, entwickelten Yang und seine Mitarbeiter eine Technik, die auf der Group Specific Internal Standard Technology (GSIST)-Kennzeichnung basiert, bei der Standards mit 13C-Aniline-Isotopen markiert und mit der Probe gemischt werden. 12,13. Der Metabolit und der entsprechende interne Standard haben die gleiche Ionisationseffizienz, da sie ko-elute, und ihr Intensitätsverhältnis kann verwendet werden, um die Konzentration in der experimentellen Probe zu quantifizieren.
In dieser Studie haben wir ein Protokoll entwickelt, um 40 Verbindungen zu detektieren und zu quantifizieren, die an der Glykolyse, dem Pentosephosphatweg, dem Tricarbonsäurezyklus, dem Energiestoffwechsel und der Kofaktorregeneration in CFPS-Reaktionen beteiligt sind. Die Methode basiert auf dem GSIST-Ansatz, bei dem wir 12C-Aniline und 13C-Aniline verwendet haben, um Metaboliten mit umgekehrter Phase LC/MS zu markieren, zu erkennen und zu quantifizieren. Der lineare Bereich aller Verbindungen umfasste 2-3 Größenordnungen mit einem durchschnittlichen Korrelationskoeffizienten von 0,988. Somit ist die Methode ein robuster und genauer Ansatz, um den zellfreien Stoffwechsel und möglicherweise Vollzellextrakte abzuhören.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:665px;" width="665">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">12C Aniline</td>
			<td style="width:121px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">242284</td>
			<td style="width:167px;">Aniline 12C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">13C labeled aniline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>485797</td>
			<td>Aniline 13C6</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">3-Phosphoglyceric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8877</td>
			<td>3PG</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetic Acid</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>AC222140010</td>
			<td>ACE</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile, LCMS</td>
			<td>JT BAKER</td>
			<td>9829-03</td>
			<td>ACN</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetyl-coenzyme A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2056</td>
			<td>ACA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acquity UPLC BEH C18 1.7 &#956;M, 2.1 x 150 mm Column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186002353</td>
			<td>Column</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adenosine diphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2754</td>
			<td>ADP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adenosine monophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1752</td>
			<td>AMP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adenosine triphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td>ATP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alpha-ketoglutarate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1128</td>
			<td>aKG</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>251275</td>
			<td>CIT</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytidine diphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9755</td>
			<td>CDP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytidine monophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1006</td>
			<td>CMP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytidine triphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9274</td>
			<td>CTP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">D-glyceraldehyde 3-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>39705</td>
			<td>GAP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Erythrose 4-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E0377</td>
			<td>E4P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EX0276</td>
			<td>EtOH</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fisher Scientific accuSpin Micro 17 Centrifuge</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td></td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Flavin adenine dinucleotide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6625</td>
			<td>FAD</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fructose 1,6-bisphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6803</td>
			<td>F16P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fructose 6-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3627</td>
			<td>F6P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fumarate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8509</td>
			<td>FUM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gluconate 6-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7877</td>
			<td>6PG</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>GLC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose 6-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7879</td>
			<td>G6P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol 3-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7886</td>
			<td>Gly3P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Guanosine diphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7127</td>
			<td>GDP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Guanosine monophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8377</td>
			<td>GMP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Guanosine triphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td>GTP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258148</td>
			<td>HCl</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isocitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1252</td>
			<td>ICIT</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L1750</td>
			<td>LAC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Malate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>02288</td>
			<td>MAL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">myTXTL - Sigma 70 Master Mix Kit</td>
			<td>ArborBiosciences</td>
			<td>507024</td>
			<td>Cell-free protein synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N-(3-dimethylaminopropyl)-N&#8242;-ethylcarbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03449</td>
			<td>EDC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nicotinamide adenine dinucleotide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43410</td>
			<td>NAD</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N5755</td>
			<td>NADP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>481973</td>
			<td>NADPH</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nicotinamide adenine dinucleotide reduced</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N8129</td>
			<td>NADH</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Oxalacetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O4126</td>
			<td>OAA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphoenolpyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0564</td>
			<td>PEP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280</td>
			<td>PYR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ribose 5-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R7750</td>
			<td>R5P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ribulose 5-phosphate</td>
			<td>CarboSynth</td>
			<td>MR45852</td>
			<td>RL5P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sedoheptulose 7-phosphate</td>
			<td>CarboSynth</td>
			<td>MS07457</td>
			<td>S7P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Succinate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3674</td>
			<td>SUCC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tributylamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90780</td>
			<td>TBA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triethylamine</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>O4884</td>
			<td>TEA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ultrapure water</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>10977-015</td>
			<td>water</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Uridine diphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U4125</td>
			<td>UDP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Uridine monophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6375</td>
			<td>UMP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Uridine triphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6625</td>
			<td>UTP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">VWR Heavy Duty Vortex</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>Vortex</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Water, LCMS</td>
			<td>JT BAKER</td>
			<td>9831-03</td>
			<td>WATER</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters Acquity H UPLC Class Quaternary Solvent Manager</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>LCMS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters Acquity H UPLC Class Sample Manager FTN</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>LCMS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters Acquity Qda detector</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>LCMS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters Empower 3</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters LCMS Total Recovery Vial</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186000384c</td>
			<td>LCMS Vial</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

absolute quantification of cell-free protein synthesis metabolism by reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry

Die zellfreie Proteinsynthese (CFPS) ist eine neue Technologie in Systemen und synthetischer Biologie zur In-vitro-Produktion von Proteinen. Wenn CFPS jedoch über das Labor hinausgehen und zu einem weit verbreiteten und standardgerechten Fertigungstechnologie werden, müssen wir die Leistungsgrenzen dieser Systeme verstehen. Zu dieser Frage haben wir ein robustes Protokoll entwickelt, um 40 Verbindungen zu quantifizieren, die an der Glykolyse, dem Pentosephosphatweg, dem Tricarbonsäurezyklus, dem Energiestoffwechsel und der Kofaktorregeneration in CFPS-Reaktionen beteiligt sind. Die Methode verwendet interne Standards mit 13C-Aniline markiert, während Verbindungen in der Probe mit 12C-Aniline derivatisiert werden. Die internen Standards und Proben wurden durch die umgekehrte Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC/MS) gemischt und analysiert. Die Ko-Elution von Verbindungen eliminierte die Ionenunterdrückung, was eine genaue Quantifizierung der Metabolitenkonzentrationen über 2-3 Größenordnungen ermöglichte, wobei der durchschnittliche Korrelationskoeffizient 0,988 betrug. Fünf der vierzig Verbindungen wurden mit Aniline nicht markiert, wurden jedoch noch in der CFPS-Probe nachgewiesen und mit einer Standardkurvenmethode quantifiziert. Der chromatographische Lauf dauert ca. 10 min. Zusammen genommen haben wir eine schnelle, robuste Methode entwickelt, um 40 Verbindungen, die an CFPS beteiligt sind, in einem einzigen LC/MS-Lauf zu trennen und genau zu quantifizieren. Die Methode ist ein umfassender und genauer Ansatz zur Charakterisierung des zellfreien Stoffwechsels, so dass wir letztendlich die Ausbeute, Produktivität und Energieeffizienz zellfreier Systeme verstehen und verbessern können.

Als Proof-of-Concept haben wir das Protokoll verwendet, um Metaboliten in einem E. coli-basierten CFPS-System zu quantifizieren, das grünes fluoreszierendes Protein (GFP) exemittiert.  Die CFPS-Reaktion (14 l) wurde abgeschreckt und mit Ethanol deproteinisiert. Die CFPS-Probe wurde dann mit 12C-Aniline markiert, während Standards mit 13C-Aniline markiert wurden. Die markierte Probe und die Standards wurden dann kombiniert und in das LC/MS injiziert (Abbildung 1</stro...

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Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Hier präsentieren wir ein robustes Protokoll zur Quantifizierung von 40 Verbindungen, die am zentralen Kohlenstoff- und Energiestoffwechsel in zellfreien Proteinsynthesereaktionen beteiligt sind. Das zellfreie Synthesegemisch wird mit Anilin zur effektiven Trennung mittels umgekehrter Flüssigchromatographie abgeführt und dann durch Massenspektrometrie unter isotopisch gekennzeichneten internen Standards quantifiziert.

Absolute Quantifizierung des zellfreien Proteinsynthesestoffwechsels durch Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Die zellfreie Proteinsynthese ist eine neue Technologie in Systemen und synthetischer Biologie für die In-vitro-Produktion von Proteinen. Zellfreie Proteinsynthesesysteme haben keine Zellwand, so dass wir direkten Zugang zu Metaboliten haben. In diesem Protokoll quantifizieren wir die absoluten Messungen von 40 Metaboliten, die am zentralen Kohlenstoff- und Energiestoffwechsel beteiligt sind, was es uns ermöglicht, den zellfreien Stoffwechsel zu charakterisieren.Das Protokoll beruht auf der Metastasierung der Verbindungen mit Aniline, was eine bessere Trennung und eine höhere Massenspektrometrieauflösung ermöglicht. Darüber hinaus verwenden wir interne Standards mit einem Isotop, das wir aniline kennzeichnen, für die absolute Quantifizierung der Metaboliten. Die markierten Metaboliten coelute, die die Auswirkungen der Eisenunterdrückung eliminiert.Ermöglicht die genaue Quantifizierung der Verbindungen. In einer Haube arbeiten, kombinieren 550 Mikroliter der Aniline, mit 337,5 Mikroliter LC-MS-Grade Wasser. Und 112,5 Mikroliter 12 Molsalzsäure in einem Zentrifugenrohr.Vortex gut, und speichern Sie die sechs Mol aniline Lösung bei pH 4,5 und vier Grad Celsius. Zur Herstellung einer sechs mollaren Carbon-13-Aniinlösung bei pH 4,5 werden 250 Milligramm Kohlenstoff-13-Aniin mit 132 Mikroliter Wasser und 44 Mikroliter 12 Molsalzsäure kombiniert. Vortex gut, und lagern bei vier Grad Celsius.Um 200 Milligramm pro Milliliter EDC-Lösung vorzubereiten, lösen Sie zwei Milligramm EDC in 10 Mikroliter Wasser für jede Probe, die getaggt werden soll. Und Wirbel gut. Um Proben zuzubereiten, löschen und fällen Sie die Proteine in einer zellfreien Proteinsynthesereaktion, indem Sie der zellfreien Synthesereaktion ein gleiches Volumen eiskaltes 100%Ethanol hinzufügen.Zentrifugieren Sie die Probe bei 12 000 mal g, für 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie den Überstand der Probe in ein neues Zentrifugenrohr. Um die Probe mit Carbon-12-Anilinelösung zu kennzeichnen, übertragen Sie sechs Mikroliter der Probe in ein neues Zentrifugenrohr und bringen Sie das Volumen mit Wasser auf 50 Mikroliter.Fügen Sie 5 Mikroliter von 200 Milligramm pro Milliliter EDC-Lösung hinzu, mischen Sie die Carbon-12-Aniinlösung gut und übertragen Sie 5 Mikroliter in die Röhre. Wirbeln Sie die Reaktion mit sanftem Schütteln für zwei Stunden bei Raumtemperatur. Nach zwei Stunden die Rohre vom Shaker entfernen und in eine Dunstabzugshaube geben.Fügen Sie 1,5 Mikroliter Triethylamin zu jeder Reaktion hinzu, um die Aniline-Tagging-Reaktion zu stoppen und die Verbindungen zu stabilisieren. Zentrifuge bei 13, 500 mal g für drei Minuten. Und den Überstand retten.Um die internen Standards mit Carbon-13-Aniline-Lösung zu kennzeichnen, verdünnen Sie die interne Lagerlösung auf 80 Mikromolar mit einem Endvolumen von 50 Mikrolitern. Fügen Sie fünf Mikroliter der 200 Milligramm pro Milliliter EDC-Lösung und fünf Mikroliter der gut gemischten Carbon-13-Aniinlösung hinzu. Wirbeln Sie die Reaktion mit sanftem Schütteln für zwei Stunden bei Raumtemperatur.Nach zwei Stunden, entfernen Sie die Rohre aus dem Shaker, und fügen Sie 1,5 Mikroliter Triethylamin zur Reaktion in einer Rauchhaube. Zentrifuge bei 13, 500 mal g für drei Minuten und den Überstand speichern. Um den getaggten internen Standard und die getaggte Probe zu göttlich zu machen, mischen Sie jeweils 25 Mikroliter in einer Autosampler-Durchstechflasche.Und analysieren Sie nach dem LC-MS-Verfahren. Um dann eine Standardkurve für nicht getaggte Metaboliten zu erstellen, verdünnen Sie zunächst die Stammlösung von nicht markierten Metaboliten auf verschiedene Konzentrationen mit einem Volumen von 50 Mikrolitern. Fügen Sie fünf Mikroliter der 200 Milligramm pro Milliliter EDC-Lösung und fünf Mikroliter Kohlenstoff-12-Aniinlösung zu jeder Konzentration hinzu.Wirbeln Sie die Reaktion mit sanftem Schütteln für zwei Stunden bei Raumtemperatur. Und fahren Sie mit der Triethylamin-Behandlung fort. Und Zentrifugalisierung vor der Analyse durch die LC-MS wie bisher.Nach der Initialisierung von LC-MS, gemäß den Anweisungen des Herstellers, injizieren Sie fünf Mikroliter der Probe in die Säule. Und erwerben Sie die entsprechenden m über z Ionenintensitäten für die Carbon-12-Aniin-getaggte Probe. Dann injizieren Sie fünf Mikroliter der gleichen Probe erneut.Und erwerben Sie die m over z Ionenintensitäten für die Carbon-13 Aniline-markierten Standards. In diesem Protokoll wurden Metaboliten, die grünes fluoreszierendes Protein in einer E.coli-basierten zellfreien Proteinsynthese exdrücken, quantifiziert. 40 Metaboliten, die am zentralen Kohlenstoff- und Energiestoffwechsel beteiligt waren, wurden anhand interner Standards nachgewiesen und quantifiziert.Während eine Standardkurve für fünf der Metaboliten, die nicht mit Aniline markiert wurden, ebenfalls entwickelt wurde. Die verschiedenen Metaboliten, die an diesen Bahnen beteiligt waren, waren eine Klasse von phosphorylierten Zuckern, Phospho-Carbonsäuren, Carbonsäuren, Nukleotiden und Co-Faktoren. Darüber hinaus ermöglichte das Verfahren die Trennung von strukturellen Isomerpaaren wie Glucose-Sechsphosphat und Fructose-sechs Phosphat in einem einzigen LC-MS-Lauf.Der wichtigste Schritt ist die Kennzeichnung der entproteinisierten Probe mit Aniline. Da sich die aniline Lösung trennt, ist es wichtig, schnell und effektiv zu arbeiten und dabei gute Sicherheitspraktiken beizubehalten. Diese Methode hilft, den zellfreien Stoffwechsel mit der Quantifizierung von 40 Metaboliten zu charakterisieren.Aber, zusätzliche Verbindungen sind in der zellfreien Mischung, wie Aminosäuren, die quantifiziert werden können. Dies würde helfen, einen umfassenderen Blick in den zellfreien Stoffwechsel zu bieten. Diese Methode zeigte, dass zellfreie Systeme komplexe Stoffwechselhaben haben, die immer noch in Betrieb sind und potenziell für eine bessere Energieeffizienz und Kohlenstoffausbeute genutzt werden können.Das Protokoll beruht auf der Kennzeichnung der Verbindungen mit Aniin mit der Verwendung von EDC als Katalysator. Beide Reagenzien sind gefährlich und sollten mit Vorsicht angewendet werden.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Struktur Protein Studium und Dynamik

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Forschung

Biochemie

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Auflösen von Affinity Purified Protein-Komplexen von Blue native PAGE und Protein Correlation Profilieren

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

Ein Tandem-Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-basierter Ansatz zur Analyse von Metabolit<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Tiefen Proteom Profilierung durch isobare Kennzeichnung, umfangreiche Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie und softwaregestützte Quantifizierung

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Hohe Empfindlichkeit Messung der Transkription Faktor-DNA verbindlichen Affinitäten durch wettbewerbsfähige Titration mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Nachweis von Protein-Ubiquitinationsstellen durch Peptidanreicherung und Massenspektrometrie

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

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Quantitative Analyse des Zelllipidoms von Saccharomyces Cerevisiae mit Flüssigchromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie

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Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Erstellen hochspezifischer chemisch induzierter Proteindimerisierungssysteme durch schrittweise Phage-Auswahl einer kombinatorischen Single-Domain-Antikörperbibliothek

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Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

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Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...