Name: absolute quantification of cell-free protein synthesis metabolism by reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry
Uploaded: 2019-10-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry at JoVE.com

העבודה שתוארה נתמכת על ידי המרכז על הפיסיקה של מטבוליזם הסרטן באמצעות הפרס מספר 1U54CA210184-01 מהמכון הלאומי לסרטן (https://www.cancer.gov/). התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים ואינו מייצג בהכרח את ההשקפות הרשמיות של המכון הלאומי לסרטן או המכונים הלאומיים לבריאות. לתורמים לא היה כל תפקיד בתכנון לימוד, איסוף נתונים וניתוח, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד.

1. הכנת ריאגנטים לתיוג אנילין
<ol><li>הכינו תמיסה של 6 מטרים ב-pH 4.5. עבודה בשכונה, לשלב 550 μL של אנילין עם 337.5 μL של מים LCMS כיתה ו 112.5 μL של 12 M חומצה הידרוכלורית (HCl) בשפופרת צנטריפוגה. הבאר מערבולת ולחנות ב 4 ° c. הערה: אנילין יכול להיות מאוחסן ב -4 ° c במשך חודשיים. התראה: אנילין הוא רעיל מאוד ויש לעבוד...

<ol>
	<li>Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthetic+biology:+thinking+outside+the+cell.">Cell-free synthetic biology: thinking outside the cell.</a> Metabolic Engineering. 14, 261-269 (2012).</li><li>Vilkhovoy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+specific+modeling+of+E.+coli+cell-free+protein+synthesis.">Sequence specific modeling of E. coli cell-free protein synthesis.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (8), 1844-1857 (2018).</li><li>Vilkhovoy, M., Minot, M., Varner, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+dynamic+models+of+metabolic+networks.">Effective dynamic models of metabolic networks.</a> IEEE Life Sciences Letters. 2 (4), 51-54 (2016).</li><li>Horvath, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+genome+scale+sequence+specific+dynamic+model+of+cell-free+protein+synthesis+in+Escherichia+coli.">Toward a genome scale sequence specific dynamic model of cell-free protein synthesis in Escherichia coli.</a> bioRxiv. , 215012 (2017).</li><li>Dettmer, K., Aronov, P. A., Hammock, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+metabolomics.">Mass spectrometry-based metabolomics.</a> Mass spectrometry reviews. 26 (1), 51-78 (2007).</li><li>Hajjaj, H., Blanc, P. J., Goma, G., Fran&#231;ois, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sampling+techniques+and+comparative+extraction+procedures+for+quantitative+determination+of+intra-+and+extracellular+metabolites+in+filamentous+fungi.">Sampling techniques and comparative extraction procedures for quantitative determination of intra- and extracellular metabolites in filamentous fungi.</a> FEMS Microbiology Letters. 164 (1), 195-200 (1998).</li><li>Ruijter, G. J. G., Visser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+intermediary+metabolites+in+Aspergillus+niger.">Determination of intermediary metabolites in Aspergillus niger.</a> Journal of Microbiological Methods. 25 (3), 295-302 (1996).</li><li>Mailinger, W., Baltes, M., Theobald, U., Reuss, M., Rizzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+metabolic+dynamics+in+Saccharomyces+cerevisiae:+I.+Experimental+observations.">In vivo analysis of metabolic dynamics in Saccharomyces cerevisiae: I. Experimental observations.</a> Biotechnology and Bioengineering. 55 (2), 305-316 (1997).</li><li>Dunn, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+appeal:+metabolite+identification+in+mass+spectrometry-focused+untargeted+metabolomics.">Mass appeal: metabolite identification in mass spectrometry-focused untargeted metabolomics.</a> Metabolomics. 9 (1), 44-66 (2013).</li><li>Huang, T., Toro, M., Lee, R., Hui, D. S., Edwards, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-functional+derivatization+of+amine,+hydroxyl,+and+carboxylate+groups+for+metabolomic+investigations+of+human+tissue+by+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Multi-functional derivatization of amine, hydroxyl, and carboxylate groups for metabolomic investigations of human tissue by electrospray ionization mass spectrometry.</a> Analyst. 143 (14), 3408-3414 (2018).</li><li>Huang, T., Armbruster, M. R., Coulton, J. B., Edwards, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+Tagging+in+Mass+Spectrometry+for+Systems+Biology.">Chemical Tagging in Mass Spectrometry for Systems Biology.</a> Analytical Chemistry. 91 (1), 109-125 (2019).</li><li>Yang, W. C., Sedlak, M., Regnier, F. E., Mosier, N., Ho, N., Adamec, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+quantification+of+metabolites+involved+in+central+carbon+and+energy+metabolism+using+reversed-phase+liquid+chromatography-mass+spectrometry+and+in+vitro+13C+labeling.">Simultaneous quantification of metabolites involved in central carbon and energy metabolism using reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry and in vitro 13C labeling.</a> Analytical Chemistry. 80 (24), 9508-9516 (2008).</li><li>Jannasch, A., Sedlak, M., Adamec, J., Metz, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Pentose+Phosphate+Pathway+(PPP)+Metabolites+by+Liquid+Chromatography-Mass+Spectrometry+(LC-MS).">Quantification of Pentose Phosphate Pathway (PPP) Metabolites by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS).</a> Metabolic Profiling. Methods in Molecular Biology 708 (Methods and Protocols). , 159-171 (2011).</li><li>Luo, B., Groenke, K., Takors, R., Wandrey, C., Oldiges, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+multiple+intracellular+metabolites+in+glycolysis,+pentose+phosphate+pathway,+and+tricarboxylic+acid+cycle+by+liquid+chromatography-mass+spectrometry.">Simultaneous determination of multiple intracellular metabolites in glycolysis, pentose phosphate pathway, and tricarboxylic acid cycle by liquid chromatography-mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography A. 1147 (2), 153-164 (2007).</li></ol>

מערכות ללא תא יש קיר תא, ולכן יש גישה ישירה מטבוליטים ומכונות ביו סינתטי ללא צורך הכנה לדוגמה מורכבת. עם זאת, מעט מאוד עבודה נעשתה כדי לפתח פרוטוקולים יסודיים וחזקים כדי כימות לחקור מערכות התגובה של התא ללא. במחקר זה, פיתחנו מהיר, שיטה איתנה כדי לכמת מטבוליטים בתערובות התגובה של התא חינם, פו?...

סינתזה של חלבון תא (CFPS) היא פלטפורמה מבטיחה עבור ייצור של חלבונים וכימיקלים, יישום שהיה שמור באופן מסורתי עבור תאים חיים. מערכות ללא תא נגזרות מתמציות תאים גולמי ומבטלות את הסיבוכים המשויכים לצמיחת התאים1. בנוסף, CFPS מאפשר גישה ישירה מטבוליטים ומכונות ביו סינתטי ללא הפרעה של קיר התא. עם זאת, חסרה הבנה בסיסית של מגבלות הביצועים של תהליכים ללא תא. שיטות תפוקה גבוהה עבור הקוונט מטבוליזם הם יקרי ערך לאפיון של חילוף החומרים והם קריטיים לבניית מודלים מטבולית חישובית2,3,4. שיטות נפוצות המשמשות לקביעת ריכוזי מטבוליט כוללות תהודה מגנטית גרעינית (nmr), התמרת פורייה-ספקטרוסקופיית אינפרא אדום (FT-IR), assays מבוסס אנזימים, וספקטרומטר המסה (MS)5,6,7 ,8. עם זאת, שיטות אלה מוגבלות לעתים קרובות על ידי חוסר היכולת שלהם למדוד ביעילות תרכובות מרובות בבת אחת ולעתים קרובות דורשים גודל מדגם גדול יותר מאשר התגובות הרגילות ללא תא. לדוגמה, בחני המבוססת על אנזימים יכולים לעתים קרובות לשמש רק כדי לכמת מתחם אחד בהפעלה, ומוגבלים כאשר גודל המדגם קטן, כגון תגובות סינתזה של חלבון תא (בדרך כלל הפעלה בקנה מידה של 10-15 μl). בינתיים, NMR דורש שפע רב של מטבוליטים לאיתור וכימות הכמת5.  לגבי חסרונות אלה, שיטות כרומטוגרפיה במשולב עם ספקטרומטר מסה (LC/MS) מספקות מספר יתרונות, כולל רגישות גבוהה ויכולת למדוד מינים מרובים בו9; עם זאת, המורכבות האנליטית גדלה במידה ניכרת עם המספר והמגוון של המינים הנמדדים. לפיכך, חשוב לפתח שיטות הממש את פוטנציאל התפוקה הגבוהה של מערכות LC/MS. תרכובות במדגם מופרדים על ידי כרומטוגרפיה נוזלית מזוהה באמצעות ספקטרומטר מסה. האות של המתחם תלוי הריכוז שלה ויעילות האינון, שבו האינון יכול להשתנות בין תרכובות יכול להיות גם תלוי במטריצה לדוגמה.
השגת אותו יעילות אינון בין המדגם והתקנים הוא אתגר בעת שימוש LC/MS לכמת מנתחי. עוד, הקוונפיקציה הופכת מאתגרת יותר עם גיוון מטבוליט בשל פיצול האות ו טרוגניות באהדה פרוטון וקוטביות10. לבסוף, מטריצת שיתוף הפעולה של המדגם יכול גם להשפיע על היעילות יינון של תרכובות. כדי לטפל בנושאים אלה, מטבוליטים יכול להיות לריקי כימית, להגדיל את הרזולוציה ואת הרגישות של מערכות LC/MS, ובמקביל להקטין את האות פיצול במקרים מסוימים10,11. העבודה הכימית עובד על ידי תיוג קבוצות פונקציונליות ספציפיות של מטבוליטים כדי לכוונן את המאפיינים הפיזיים שלהם כמו תשלום או hydrophobicity כדי להגדיל את יעילות יינון11. סוכני תיוג שונים יכולים לשמש כדי למקד קבוצות פונקציונליות שונות (למשל, amines, הידרוקסילס, פוספטים, חומצות קרבוקסילית וכו '). אנילין, אחד הסוכנים האלה ללעג, מטרות קבוצות פונקציונליות מרובות בבת אחת, ומוסיף רכיב הידרופובי למולקולות הידרופילית, ובכך מגדיל את רזולוציית ההפרדה שלהם ואת האות12. כדי לטפל באפקט הדיכוי המיני-מטריצות של המטריצה, יאנג ועמיתים פיתחו טכניקה המבוססת על התווית הפנימית של התקן הפנימי (GSIST) לתיוג שבו התקנים מתויגים עם 13ג אנילין איזוטופים ומעורבב עם המדגם 12,13. החומרים הפנימיים של המטאווליט והתקן הפנימי הם בעלי היעילות האינון מאז שהם שותפים, ויחס האינטנסיביות שלהם יכול לשמש לכמת את הריכוז במדגם הניסיוני.
במחקר זה, פיתחנו פרוטוקול לזהות ולכמת 40 תרכובות מעורבים גליקוליזיס, מסלול פוספט פנטוז מחזור חומצה tricarboxylic מטבוליזם אנרגיה התחדשות קופקטור ב-cfps תגובות. השיטה מבוססת על הגישה GSIST, שבו השתמשנו 12ג-אנילין ו -13ג-אנילין לתייג, לזהות, ולכמת מטבוליטים באמצעות היפוך-שלב LC/MS. הטווח הליניארי של כל התרכובות המקיפות 2-3 הזמנות של סדר גודל עם מקדם מתאם ממוצע של 0.988. לכן, השיטה היא גישה איתנה ומדויקת לחקור חילוף חומרים ללא תא, ואולי תמציות תאים שלמים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:665px;" width="665">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">12C Aniline</td>
			<td style="width:121px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">242284</td>
			<td style="width:167px;">Aniline 12C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">13C labeled aniline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>485797</td>
			<td>Aniline 13C6</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">3-Phosphoglyceric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8877</td>
			<td>3PG</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetic Acid</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>AC222140010</td>
			<td>ACE</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile, LCMS</td>
			<td>JT BAKER</td>
			<td>9829-03</td>
			<td>ACN</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetyl-coenzyme A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2056</td>
			<td>ACA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acquity UPLC BEH C18 1.7 &#956;M, 2.1 x 150 mm Column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186002353</td>
			<td>Column</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adenosine diphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2754</td>
			<td>ADP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adenosine monophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1752</td>
			<td>AMP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adenosine triphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td>ATP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alpha-ketoglutarate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1128</td>
			<td>aKG</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>251275</td>
			<td>CIT</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytidine diphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9755</td>
			<td>CDP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytidine monophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1006</td>
			<td>CMP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytidine triphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9274</td>
			<td>CTP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">D-glyceraldehyde 3-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>39705</td>
			<td>GAP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Erythrose 4-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E0377</td>
			<td>E4P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EX0276</td>
			<td>EtOH</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fisher Scientific accuSpin Micro 17 Centrifuge</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td></td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Flavin adenine dinucleotide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6625</td>
			<td>FAD</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fructose 1,6-bisphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6803</td>
			<td>F16P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fructose 6-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3627</td>
			<td>F6P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fumarate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8509</td>
			<td>FUM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gluconate 6-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7877</td>
			<td>6PG</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>GLC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose 6-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7879</td>
			<td>G6P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol 3-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7886</td>
			<td>Gly3P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Guanosine diphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7127</td>
			<td>GDP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Guanosine monophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8377</td>
			<td>GMP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Guanosine triphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td>GTP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258148</td>
			<td>HCl</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isocitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1252</td>
			<td>ICIT</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L1750</td>
			<td>LAC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Malate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>02288</td>
			<td>MAL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">myTXTL - Sigma 70 Master Mix Kit</td>
			<td>ArborBiosciences</td>
			<td>507024</td>
			<td>Cell-free protein synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N-(3-dimethylaminopropyl)-N&#8242;-ethylcarbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03449</td>
			<td>EDC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nicotinamide adenine dinucleotide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43410</td>
			<td>NAD</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N5755</td>
			<td>NADP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>481973</td>
			<td>NADPH</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nicotinamide adenine dinucleotide reduced</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N8129</td>
			<td>NADH</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Oxalacetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O4126</td>
			<td>OAA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphoenolpyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0564</td>
			<td>PEP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280</td>
			<td>PYR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ribose 5-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R7750</td>
			<td>R5P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ribulose 5-phosphate</td>
			<td>CarboSynth</td>
			<td>MR45852</td>
			<td>RL5P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sedoheptulose 7-phosphate</td>
			<td>CarboSynth</td>
			<td>MS07457</td>
			<td>S7P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Succinate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3674</td>
			<td>SUCC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tributylamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90780</td>
			<td>TBA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triethylamine</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>O4884</td>
			<td>TEA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ultrapure water</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>10977-015</td>
			<td>water</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Uridine diphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U4125</td>
			<td>UDP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Uridine monophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6375</td>
			<td>UMP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Uridine triphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6625</td>
			<td>UTP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">VWR Heavy Duty Vortex</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>Vortex</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Water, LCMS</td>
			<td>JT BAKER</td>
			<td>9831-03</td>
			<td>WATER</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters Acquity H UPLC Class Quaternary Solvent Manager</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>LCMS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters Acquity H UPLC Class Sample Manager FTN</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>LCMS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters Acquity Qda detector</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>LCMS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters Empower 3</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters LCMS Total Recovery Vial</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186000384c</td>
			<td>LCMS Vial</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

absolute quantification of cell-free protein synthesis metabolism by reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry

סינתזה של חלבון תא (CFPS) היא טכנולוגיה מתפתחים במערכות ובביולוגיה סינתטית לייצור מתורבת של חלבונים. עם זאת, אם CFPS הולך לנוע מעבר למעבדה ולהיות מקובל וסטנדרטי רק בטכנולוגיית ייצור הזמן, אנחנו חייבים להבין את גבולות הביצועים של מערכות אלה. לקראת שאלה זו, פיתחנו פרוטוקול חזק כדי לכמת 40 תרכובות מעורבים גליקוליזיס, מסלול פוספט פנטוז מחזור חומצה tricarboxylic מטבוליזם אנרגיה התחדשות קופקטור ב-cfps תגובות. השיטה משתמשת בתקנים פנימיים המתויגים עם 13ג-אנילין, ואילו תרכובות במדגם הן ללעג עם 12ג-אנילין. הסטנדרטים הפנימיים והמדגם היו מעורבים ונותחו על-ידי כרומטוגרפיה ברמה הפוכה-ספקטרומטריה (LC/MS). שיתוף של תרכובות הדיכוי יון מסולק, המאפשר כימות מדויקת של ריכוזי מטבוליט מעל 2-3 הזמנות של גודל שבו מקדם המתאם הממוצע היה 0.988. חמישה מתוך 40 תרכובות לא היו מתוייגות עם אנילין, עם זאת, הם עדיין זוהו במדגם CFPS וכימות עם שיטת עקומה סטנדרטית. לרוץ כרומטוגרפי לוקח בערך 10 דקות להשלים. יחד, פיתחנו מהיר, שיטה איתנה כדי להפריד ומדויק לכמת 40 תרכובות מעורבות CFPS בריצה LC/MS אחת. השיטה היא גישה מקיפה ומדויקת לאפיון חילוף חומרים ללא תא, כך שבסופו של דבר, אנו יכולים להבין ולשפר את התשואה, הפרודוקטיביות ויעילות האנרגיה של מערכות ללא תא.

כהוכחה-of-קונספט, השתמשנו בפרוטוקול כדי לכמת מטבוליטים ב -E. coli מבוסס cfps מערכת המבטא חלבון פלורסנט ירוק (gfp).  התגובה CFPS (14 μL) היה מוכן ומלא עם אתנול. דגימת CFPS הייתה מתויגת עם 12ג-אנילין, ואילו התקנים תויגו עם 13ג-אנילין. המדגם והתקנים המתויגים שולבו והוזריקו לתוך ה-LC/MS (<strong class="xfig"...

Watch this Scientific Journal Video about Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry at JoVE.com

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

כאן, אנו מציגים פרוטוקול יציב כדי לכמת 40 תרכובות מעורב מטבוליזם פחמן מרכזי ואנרגיה בתגובות סינתזה של חלבון-ללא תא. תערובת הסינתזה התאית היא ללעג עם אנילין להפרדה אפקטיבית באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשלב היפוך, ולאחר מכן כימות על-ידי ספקטרומטר מסה באמצעות מisotopically מתויג בתקנים פנימיים.

קוונפיקציה מוחלטת של מטבוליזם החלבון ללא שימוש בפרוטאין על-ידי היפוך-שלב נוזלי כרומטוגרפיה המסה-ספקטרומטריה

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

סינתזת חלבונים נטולת תאים היא טכנולוגיה מתפתחת במערכות וביולוגיה סינתטית לייצור במבחנה של חלבונים. למערכות סינתזת חלבונים נטולות תאים אין קיר תאים, ולכן יש לנו גישה ישירה למטבוליטים. בפרוטוקול זה, אנו מכמתים את המדידות המוחלטות של 40 מטבוליטים המעורבים בחילוף חומרים מרכזי של פחמן ואנרגיה, המאפשר לנו לאפיין את חילוף החומרים ללא תאים.הפרוטוקול מסתמך על גרורות של התרכובות עם אנילין, המאפשר הפרדה טובה יותר ורזולוציית ספקטרומטריית מסה גבוהה יותר. בנוסף, אנו משתמשים בתקנים פנימיים עם אנילין תווית isotopic, לכמות מוחלט של מטבוליטים. מטבוליטים מתויגים coelute, אשר מבטל את ההשפעות של דיכוי ברזל.המאפשר כימות מדויק של התרכובות. עבודה במכסה המנוע, לשלב 550 microliters של אנילין, עם 337.5 microliters של מים LC-MS כיתה. ו-112.5 מיקרוליטרים של 12 חומצה הידרוכלורית טוחנת בצינור צנטריפוגה.מערבולת היטב, ולאחסן את פתרון aniline שש טוחן ב pH 4.5 וארבע מעלות צלזיוס. כדי להכין פתרון אנילין פחמן-13 טוחן, ב pH 4.5, לשלב 250 מיליגרם של פחמן-13 אנילין עם 132 microliters של מים, ו 44 microliters של 12 חומצה הידרוכלורית טוחנת. מערבולת היטב, ולאחסן בארבע מעלות צלזיוס.כדי להכין 200 מיליגרם לכל פתרון EDC מיליליטר, להמיס שני מיליגרם של EDC ב 10 microliters של מים עבור כל מדגם להיות מתויג. ומערבולת היטב. כדי להכין דגימות, מרווה ומזרז את החלבונים בתגובת סינתזת חלבונים נטולת תאים, על ידי הוספת נפח שווה של 100% אתנול קר כקרח לתגובת הסינתזה נטולת התאים.צנטריפוגה המדגם ב 12, 000 פעמים גרם, במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. מעבירים את העל-טבעי של הדגימה לצינור צנטריפוגה חדש. כדי לתייג את המדגם בתווית אנילין פחמן-12, העבר שישה מיקרוליטרים של המדגם לתוך צינור צנטריפוגה חדש, ולהביא את הנפח ל 50 microliters עם מים.הוסיפו 5 מיקרוליטרים של 200 מיליגרם לתסרון EDC מיליליטר, ערבבו היטב את תווי האנילין פחמן-12 והעברו 5 מיקרוליטרים לצינור. מערבולת התגובה עם רעידות עדינות במשך שעתיים בטמפרטורת החדר. לאחר שעתיים, מוציאים את הצינורות מהשייקר ומעבירים אותם למכסה המנוע.הוסף 1.5 microliters של טריאתילאמין לכל תגובה כדי לעצור את תגובת תיוג אנילין ולייצב את התרכובות. צנטריפוגה ב 13, 500 פעמים g במשך שלוש דקות. ולהציל את העל-טבעי.כדי לתייג את הסטנדרטים הפנימיים בתווית אנילין פחמן-13, לדלל את פתרון המלאי הפנימי ל-80 מיקרומולרים בנפח סופי של 50 מיקרוליטרים. הוסף חמישה מיקרוליטרים של 200 מיליגרם לכל פתרון EDC מיליליטר, וחמישה microliters של פתרון אנילין פחמן-13 מעורב היטב. מערבולת התגובה עם רעידות עדינות במשך שעתיים בטמפרטורת החדר.לאחר שעתיים, להסיר את הצינורות מן השייקר, ולהוסיף 1.5 microliters של טריאתילאמין לתגובה ברדס אדים. צנטריפוגה ב 13, 500 פעמים g במשך שלוש דקות ולשמור על טבעי. כדי לגלות את התקן הפנימי המתויג ואת המדגם המתויג, ערבבו 25 מיקרוליטרים של כל אחד מהם בבקבוקון מדגם אוטומטי.וניתוח על ידי הליך LC-MS. לאחר מכן, כדי ליצור עקומה סטנדרטית עבור מטבוליטים untagged, הראשון, לדלל את פתרון המלאי של מטבוליטים untagged לריכוזים שונים, עם נפח של 50 microliters. הוסף חמישה microliters של 200 מיליגרם לכל פתרון EDC מיליליטר, וחמישה microliters של פתרון אנילין פחמן 12 לכל ריכוז.מערבולת התגובה עם רעידות עדינות במשך שעתיים בטמפרטורת החדר. ולהמשיך עם הטיפול טריאתילאמין. וצנטריפוגליזציה לפני ניתוח על ידי LC-MS כבעבר.לאחר אתחול LC-MS, על פי הוראות היצרן, להזריק חמישה microliters של המדגם לתוך העמודה. ולרכוש את ההתעצמויות המתאימות m מעל z יון עבור פחמן-12 אנילין מתויג מדגם. לאחר מכן, להזריק חמישה microliters של אותה דגימה שוב.ולרכוש את m מעל z יון התעצמויות עבור פחמן-13 אנילין מתויג סטנדרטים. בפרוטוקול זה, מטבוליטים המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק בסינתזת חלבון נטולת תאים המבוססת על E.coli כומתו. 40 מטבוליטים המעורבים בחילוף חומרים מרכזי של פחמן ואנרגיה, זוהו וכמתו באמצעות סטנדרטים פנימיים.בעוד עקומה סטנדרטית עבור חמישה מטבוליטים שלא תויגו עם אנילין פותחה גם. המטבוליטים המגוונים המעורבים במסלולים אלה היו סוג של סוכרים זרחניים, חומצות פוספו-קרבוקסיליות, חומצות קרבוקסיליות, נוקלאוטידים וגורמים שותף. בנוסף, השיטה אפשרה הפרדת זוגות isomer מבניים, כגון גלוקוז-שש פוספט, פרוקטוז-שש פוספט בהפעלת LC-MS אחת.הצעד החשוב ביותר הוא תיוג המדגם דה חלבון עם אנילין. מכיוון שהפתרון aniline נפרד, חשוב לעבוד במהירות וביעילות, תוך שמירה על נוהלי בטיחות טובים. שיטה זו מסייעת לאפיין את חילוף החומרים ללא תאים עם כימות של 40 מטבוליטים.אבל, תרכובות נוספות נמצאות בתערובת ללא תאים, כגון חומצות אמינו שניתן לכמת. זה יעזור במתן מבט מקיף יותר לתוך חילוף החומרים ללא תאים. שיטה זו גילתה כי מערכות ללא תאים יש מטבוליזם מורכב, עדיין פועל כי ניתן לנצל פוטנציאל עבור יעילות אנרגיה טובה יותר ותפוקת פחמן.הפרוטוקול מסתמך על תיוג התרכובות עם אנילין עם השימוש EDC כזרז. שני רייגנטים אלה מסוכנים ויש להשתמש בהם בזהירות.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

גישת טנדם נוזלת כרומטוגרפיה-ספקטרומטריית מסה מבוססת עבור ניתוח המטבוליט<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

פרוטאום עמוק פרופיל על ידי תיוג Isobaric, מקיף כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטר מסה תוכנה בסיוע כמת

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

רגישות גבוהה מדידה של שעתוק הזיקות איגוד מקדם-DNA על ידי טיטור תחרותי באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

איתור מקומות לגילוי החלבון על ידי העשרה מפפטיד וספקטרומטר מסה

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

ניתוח כמותי של הליפידום הסלולר באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית משולב עם טנדם מסה ספקטרומטריה

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

יצירת חלבון מאוד ספציפי הנגרמת כימית מערכות דימריזציה על ידי בחירת בחירה באמצעות מבחר של קומבינטורית מתחם יחיד בספריית הנוגדן

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

בדיקות מבוססות-כרומטוגרפיה של נוזלים מבוססי-המסה של טבולומיקס חיטה

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...