Name: absolute quantification of cell-free protein synthesis metabolism by reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry
Uploaded: 2019-10-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry at JoVE.com

記載された研究は、国立がん研究所(https://www.cancer.gov/)から1U54CA210184-01賞を通じてがん代謝物理学センターによって支援されました。コンテンツは著者のみ責任であり、必ずしも国立がん研究所や国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、出版の決定、原稿の作成に何の役割も持っていませんでした。

1. アニリンタグ付け用試薬の調製
<ol><li>pH 4.5で6Mアニリン溶液を調製します。フードで働き、550 μLのアニリンとLCMS等級水の337.5°L、12M塩酸(HCl)の112.5°Lを遠心管に組み合わせます。ボルテックスウェルと4°で保存します。 注:アニリンは4°Cで2ヶ月間保存することができます。 注意:アニリンは非常に有毒であり、ヒュームフードで作業する必要があります。塩酸は腐食性が高い</li>
	<li>pH...

<ol>
	<li>Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthetic+biology:+thinking+outside+the+cell.">Cell-free synthetic biology: thinking outside the cell.</a> Metabolic Engineering. 14, 261-269 (2012).</li><li>Vilkhovoy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+specific+modeling+of+E.+coli+cell-free+protein+synthesis.">Sequence specific modeling of E. coli cell-free protein synthesis.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (8), 1844-1857 (2018).</li><li>Vilkhovoy, M., Minot, M., Varner, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+dynamic+models+of+metabolic+networks.">Effective dynamic models of metabolic networks.</a> IEEE Life Sciences Letters. 2 (4), 51-54 (2016).</li><li>Horvath, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+genome+scale+sequence+specific+dynamic+model+of+cell-free+protein+synthesis+in+Escherichia+coli.">Toward a genome scale sequence specific dynamic model of cell-free protein synthesis in Escherichia coli.</a> bioRxiv. , 215012 (2017).</li><li>Dettmer, K., Aronov, P. A., Hammock, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+metabolomics.">Mass spectrometry-based metabolomics.</a> Mass spectrometry reviews. 26 (1), 51-78 (2007).</li><li>Hajjaj, H., Blanc, P. J., Goma, G., Fran&#231;ois, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sampling+techniques+and+comparative+extraction+procedures+for+quantitative+determination+of+intra-+and+extracellular+metabolites+in+filamentous+fungi.">Sampling techniques and comparative extraction procedures for quantitative determination of intra- and extracellular metabolites in filamentous fungi.</a> FEMS Microbiology Letters. 164 (1), 195-200 (1998).</li><li>Ruijter, G. J. G., Visser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+intermediary+metabolites+in+Aspergillus+niger.">Determination of intermediary metabolites in Aspergillus niger.</a> Journal of Microbiological Methods. 25 (3), 295-302 (1996).</li><li>Mailinger, W., Baltes, M., Theobald, U., Reuss, M., Rizzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+metabolic+dynamics+in+Saccharomyces+cerevisiae:+I.+Experimental+observations.">In vivo analysis of metabolic dynamics in Saccharomyces cerevisiae: I. Experimental observations.</a> Biotechnology and Bioengineering. 55 (2), 305-316 (1997).</li><li>Dunn, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+appeal:+metabolite+identification+in+mass+spectrometry-focused+untargeted+metabolomics.">Mass appeal: metabolite identification in mass spectrometry-focused untargeted metabolomics.</a> Metabolomics. 9 (1), 44-66 (2013).</li><li>Huang, T., Toro, M., Lee, R., Hui, D. S., Edwards, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-functional+derivatization+of+amine,+hydroxyl,+and+carboxylate+groups+for+metabolomic+investigations+of+human+tissue+by+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Multi-functional derivatization of amine, hydroxyl, and carboxylate groups for metabolomic investigations of human tissue by electrospray ionization mass spectrometry.</a> Analyst. 143 (14), 3408-3414 (2018).</li><li>Huang, T., Armbruster, M. R., Coulton, J. B., Edwards, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+Tagging+in+Mass+Spectrometry+for+Systems+Biology.">Chemical Tagging in Mass Spectrometry for Systems Biology.</a> Analytical Chemistry. 91 (1), 109-125 (2019).</li><li>Yang, W. C., Sedlak, M., Regnier, F. E., Mosier, N., Ho, N., Adamec, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+quantification+of+metabolites+involved+in+central+carbon+and+energy+metabolism+using+reversed-phase+liquid+chromatography-mass+spectrometry+and+in+vitro+13C+labeling.">Simultaneous quantification of metabolites involved in central carbon and energy metabolism using reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry and in vitro 13C labeling.</a> Analytical Chemistry. 80 (24), 9508-9516 (2008).</li><li>Jannasch, A., Sedlak, M., Adamec, J., Metz, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Pentose+Phosphate+Pathway+(PPP)+Metabolites+by+Liquid+Chromatography-Mass+Spectrometry+(LC-MS).">Quantification of Pentose Phosphate Pathway (PPP) Metabolites by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS).</a> Metabolic Profiling. Methods in Molecular Biology 708 (Methods and Protocols). , 159-171 (2011).</li><li>Luo, B., Groenke, K., Takors, R., Wandrey, C., Oldiges, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+multiple+intracellular+metabolites+in+glycolysis,+pentose+phosphate+pathway,+and+tricarboxylic+acid+cycle+by+liquid+chromatography-mass+spectrometry.">Simultaneous determination of multiple intracellular metabolites in glycolysis, pentose phosphate pathway, and tricarboxylic acid cycle by liquid chromatography-mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography A. 1147 (2), 153-164 (2007).</li></ol>

無細胞システムは細胞壁を持たないため、複雑なサンプル調製を必要とせずに代謝産物や生合成機械に直接アクセスできます。しかし、細胞のない反応系を定量的に調べるための徹底的で堅牢なプロトコルを開発する作業はほとんど行われていない。本研究では、無細胞反応混合物および全細胞抽出物中の代謝産物を定量する高速で堅牢な方法を開発した。細胞を含まない反応や全細胞抽出?...

無細胞タンパク質合成(CFPS)は、タンパク質や化学物質の製造に有望なプラットフォームであり、従来は生きている細胞のために予約されてきました。無細胞系は、粗細胞抽出物に由来し、細胞増殖1に関連する合併症を排除する。さらに、CFPSは細胞壁の干渉なしで代謝産物および生合成機械への直接アクセスを可能にする。しかし、無細胞プロセスの性能限界に関する根本的な理解が欠けている。代謝物定量のための高スループット法は、代謝の特性評価に貴重であり、代謝計算モデル2、3、4の構築に不可欠である。代謝産物濃度を決定するために使用される一般的な方法には、核磁気共鳴(NMR)、フーリエ形質転換赤外分光法(FT-IR)、酵素系アッセイ、質量分析(MS)5、6、7などがあります。 、8.しかし、これらの方法は、多くの場合、一度に複数の化合物を効率的に測定できないことによって制限され、多くの場合、典型的な無細胞反応よりも大きいサンプルサイズを必要とします。例えば、酵素ベースのアッセイは、多くの場合、実行で単一の化合物を定量するためにのみ使用することができ、無細胞タンパク質合成反応(通常は10〜15°Lスケールで実行される)のように、サンプルサイズが小さい場合に制限されます。一方、NMRは、検出および定量のための代謝産物の高い量を必要とします5. これらの欠点に対して、質量分析法(LC/MS)と連像のクロマトグラフィー法は、高感度および複数の種を同時に測定する能力を含むいくつかの利点を提供する9;しかし、測定される種の数と多様性に伴い、分析の複雑さが大幅に増加します。したがって、LC/MSシステムの高スループットポテンシャルを十分に実現する方法を開発することが重要です。試料中の化合物は液体クロマトグラフィーで分離され、質量分析によって同定される。化合物のシグナルは、その濃度およびイオン化効率に依存し、そこでイオン化は化合物間で変化し得るし、また、サンプルマトリックスに依存し得る。
LC/MSを使用して分析物を定量する場合、サンプルと規格の間で同じイオン化効率を達成することは課題です。また、プロトン親和性および極性10におけるシグナル分割および不均一性による代謝産物多様性に伴う定量化がより困難となる。最後に、試料の共溶出マトリックスは、化合物のイオン化効率にも影響を与え得る。これらの問題に対処するために、代謝産物を化学的に誘導体化し、LC/MSシステムによる分離分解分解分解と感度を高め、場合によっては信号分割を10、11に減少させることができる。化学誘導体化は、代謝産物の特定の官能基をタグ付けして、電荷や疎水性などの物理的性質を調整してイオン化効率を11上げることによって機能する。種々のタグ付け剤は、異なる官能基(例えば、アミン、ヒドロキシル、リン酸塩、カルボン酸など)を標的とするために使用することができる。アニリンは、そのような誘導体化剤の1つが、一度に複数の官能基を標的とし、親水性分子に疎水性成分を加え、それによってその分離分解能およびシグナル12を増加させる。共溶出マトリックスイオン抑制効果に対処するために、ヤンと同僚は、標準が13Cアニリン同位体でタグ付けされ、サンプルと混合されるグループ固有の内部標準技術(GSIST)ラベリングに基づく技術を開発しました。12、13.代謝産物および対応する内部標準は、共溶成以来同じイオン化効率を有し、その強度比を使用して実験試料中の濃度を定量することができます。
本研究では、CFPS反応における糖分解、ペントースリン酸経路、トリカルボン酸サイクル、エネルギー代謝および補因子再生に関与する40の化合物を検出し、定量するプロトコルを開発した。この方法はGSISTアプローチに基づいており、12のC-アニリンと13のC-アニリンを使用して、逆相LC/MSを使用して代謝産物をタグ付け、検出、定量しました。すべての化合物の線形範囲は、平均相関係数0.988の2〜3桁に及んだ。したがって、この方法は、無細胞代謝、および場合によっては全細胞抽出物を問い合わせるための堅牢で正確なアプローチです。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:665px;" width="665">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">12C Aniline</td>
			<td style="width:121px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">242284</td>
			<td style="width:167px;">Aniline 12C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">13C labeled aniline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>485797</td>
			<td>Aniline 13C6</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">3-Phosphoglyceric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8877</td>
			<td>3PG</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetic Acid</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>AC222140010</td>
			<td>ACE</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile, LCMS</td>
			<td>JT BAKER</td>
			<td>9829-03</td>
			<td>ACN</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetyl-coenzyme A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2056</td>
			<td>ACA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acquity UPLC BEH C18 1.7 &#956;M, 2.1 x 150 mm Column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186002353</td>
			<td>Column</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adenosine diphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2754</td>
			<td>ADP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adenosine monophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1752</td>
			<td>AMP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adenosine triphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td>ATP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alpha-ketoglutarate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1128</td>
			<td>aKG</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>251275</td>
			<td>CIT</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytidine diphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9755</td>
			<td>CDP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytidine monophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1006</td>
			<td>CMP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytidine triphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9274</td>
			<td>CTP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">D-glyceraldehyde 3-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>39705</td>
			<td>GAP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Erythrose 4-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E0377</td>
			<td>E4P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EX0276</td>
			<td>EtOH</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fisher Scientific accuSpin Micro 17 Centrifuge</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td></td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Flavin adenine dinucleotide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6625</td>
			<td>FAD</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fructose 1,6-bisphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6803</td>
			<td>F16P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fructose 6-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3627</td>
			<td>F6P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fumarate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8509</td>
			<td>FUM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gluconate 6-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7877</td>
			<td>6PG</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>GLC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose 6-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7879</td>
			<td>G6P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol 3-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7886</td>
			<td>Gly3P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Guanosine diphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7127</td>
			<td>GDP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Guanosine monophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8377</td>
			<td>GMP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Guanosine triphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td>GTP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258148</td>
			<td>HCl</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isocitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1252</td>
			<td>ICIT</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L1750</td>
			<td>LAC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Malate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>02288</td>
			<td>MAL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">myTXTL - Sigma 70 Master Mix Kit</td>
			<td>ArborBiosciences</td>
			<td>507024</td>
			<td>Cell-free protein synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N-(3-dimethylaminopropyl)-N&#8242;-ethylcarbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03449</td>
			<td>EDC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nicotinamide adenine dinucleotide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43410</td>
			<td>NAD</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N5755</td>
			<td>NADP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>481973</td>
			<td>NADPH</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nicotinamide adenine dinucleotide reduced</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N8129</td>
			<td>NADH</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Oxalacetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O4126</td>
			<td>OAA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphoenolpyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0564</td>
			<td>PEP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280</td>
			<td>PYR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ribose 5-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R7750</td>
			<td>R5P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ribulose 5-phosphate</td>
			<td>CarboSynth</td>
			<td>MR45852</td>
			<td>RL5P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sedoheptulose 7-phosphate</td>
			<td>CarboSynth</td>
			<td>MS07457</td>
			<td>S7P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Succinate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3674</td>
			<td>SUCC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tributylamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90780</td>
			<td>TBA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triethylamine</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>O4884</td>
			<td>TEA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ultrapure water</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>10977-015</td>
			<td>water</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Uridine diphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U4125</td>
			<td>UDP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Uridine monophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6375</td>
			<td>UMP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Uridine triphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6625</td>
			<td>UTP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">VWR Heavy Duty Vortex</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>Vortex</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Water, LCMS</td>
			<td>JT BAKER</td>
			<td>9831-03</td>
			<td>WATER</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters Acquity H UPLC Class Quaternary Solvent Manager</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>LCMS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters Acquity H UPLC Class Sample Manager FTN</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>LCMS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters Acquity Qda detector</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>LCMS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters Empower 3</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters LCMS Total Recovery Vial</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186000384c</td>
			<td>LCMS Vial</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

absolute quantification of cell-free protein synthesis metabolism by reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry

無細胞タンパク質合成(CFPS)は、タンパク質のインビトロ産生のためのシステムおよび合成生物学における新しい技術です。しかし、CFPSが研究室を超えて、時間の製造技術の中で普及し、標準になる場合は、これらのシステムの性能限界を理解する必要があります。この問題に対して、CFPS反応における糖分解、ペントースリン酸経路、トリカルボン酸サイクル、エネルギー代謝および補因子再生に関与する40の化合物を定量する堅牢なプロトコルを開発しました。この方法では、13個の C-アニリンでタグ付けされた内部標準を使用し、サンプル内の化合物は12個の C-アニリンで誘導体化されます。内部標準および試料を混合し、逆相液体クロマトグラフィー質量分析(LC/MS)によって分析した。化合物の共溶出によりイオン抑制が排除され、平均相関係数が0.988であった2~3桁以上の代謝物濃度の正確な定量が可能となった。40個の化合物のうち5種はアニリンでタグ付けされていないが、CFPSサンプルで検出され、標準的な曲線法で定量された。クロマトグラフィーの実行は、完了するまでに約 10 分かかります。まとめると、CFPSに関与する40の化合物を単一のLC/MSランで分離し、正確に定量する高速で堅牢な方法を開発しました。この方法は、無細胞代謝を特徴付ける包括的かつ正確なアプローチであり、最終的には、無細胞システムの歩留まり、生産性、エネルギー効率を理解し、改善することができます。

概念実証として、緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現する大腸菌系CFPS系の代謝産物を定量化するプロトコルを用いた。 CFPS反応(14μL)をエタノールで急行し、脱タンパク質化した。その後、CFPSサンプルは12C-アニリンでタグ付けされ、標準は13C-アニリンでタグ付けされました。タグ付けされたサンプルと標準を組み合わせて LC/MS に注入しました (図 1)?...

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Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

ここでは、無細胞タンパク質合成反応において中枢炭素およびエネルギー代謝に関与する40種類の化合物を定量するための堅牢なプロトコルを提示する。無細胞合成混合物は、逆相液体クロマトグラフィーを用いて効果的な分離のためにアニリンで誘導体化され、同位体標識内部標準を用いて質量分析法によって定量される。

逆相液体クロマトグラフィー-質量分析法による無細胞タンパク質合成代謝の絶対定量

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

無細胞タンパク質合成は、タンパク質のインビトロ生産のためのシステムおよび合成生物学における新しい技術です。無細胞タンパク質合成システムは細胞壁を持たないため、代謝産物に直接アクセスできます。このプロトコルでは、中枢炭素およびエネルギー代謝に関与する40の代謝産物の絶対測定を定量化し、無細胞代謝を特徴付けることを可能にする。このプロトコルは、アニリンを使用した化合物の転移に依存するため、より良い分離と質量分析の分解能が向上します。さらに、代謝物の絶対定量化のために、アニリンにラベルを付ける同位体を持つ内部標準を使用します。タグ付き代謝物は、鉄の抑制の効果を排除するコエルテを、します。化合物の正確な定量化を可能にする。フードで作業し、550マイクロリットルのアニリンと337.5マイクロリットルのLC-MSグレードの水を組み合わせます。遠心分離管に12モル塩酸の112.5マイクロリットル。ボルテックスウェル、およびpH 4.5と摂氏4度で6モルアニリン溶液を保存します。6モル炭素-13アニリン溶液を調製するには、pH 4.5で、炭素-13アニリンの250ミリグラムと132マイクロリットルの水と、12モル塩酸の44マイクロリットルを組み合わせます。ボルテックス井戸、摂氏4度で保管してください。1 ミリリットル EDC 溶液あたり 200 ミリグラムを準備するには、 EDC の 2 ミリグラムを 10 マイクロリットルの水に溶解して、サンプルごとにタグ付けします。そして、よく渦。サンプルを調製するために、無細胞タンパク質合成反応でタンパク質をクエンチおよび沈殿させ、無細胞合成反応に等量の氷冷100%エタノールを添加することによって。サンプルを12,000倍gで遠心し、摂氏4度で15分間遠心する。サンプルの上清を新しい遠心管に移します。炭素12アニリン溶液でサンプルをラベル付けするには、サンプルの6マイクロリットルを新しい遠心管に移し、水で体積を50マイクロリットルにします。1ミリリットルのEDC溶液に200ミリグラムの5マイクロリットルを加え、炭素-12アニリン溶液をよく混ぜ、チューブに5マイクロリットルを移す。室温で2時間穏やかな揺れで反応を渦。2時間後、シェーカーからチューブを取り外し、ヒュームフードに移します。各反応に1.5マイクロリットルのトリエチルアミンを加え、アニリンタグ付け反応を停止し、化合物を安定化させる。遠心分離機を13で、500回gで3分間行う。そして上清を保存します。カーボン13アニリン溶液で内部標準をラベル付けするには、内部ストック溶液を50マイクロリットルの最終体積で80マイクロモルに希釈します。1ミリリットルEDC溶液あたり200ミリグラムの5マイクロリットル、およびよく混合された炭素13アニリン溶液の5マイクロリットルを加える。室温で2時間穏やかな揺れで反応を渦。2時間後、シェーカーからチューブを取り出し、フュームフードの反応に1.5マイクロリットルのトリエチルアミンを加えます。遠心分離機で13、500回g3分間、上清を保存します。タグ付けされた内部標準とタグ付きサンプルを占うために、オートサンプラーバイアルにそれぞれ25マイクロリットルを混ぜます。LC-MS手順で分析します。次に、タグなし代謝物の標準曲線を作成し、まず、50マイクロリットルの体積で、タグなし代謝物のストック溶液を異なる濃度に希釈する。1ミリリットルのEDC溶液に200ミリグラムの5マイクロリットルを加え、各濃度に炭素-12アニリン溶液を5マイクロリットル加えます。室温で2時間穏やかな揺れで反応を渦。そしてトリエチルアミン処理を進める。以前のようにLC-MSで分析する前に遠心化。LC-MSを初期化した後、メーカーの指示に従って、5マイクロリットルのサンプルをカラムに注入します。カーボン-12アニリンタグ付きサンプルに対する適切なmoverzイオン強度を取得する。次に、同じサンプルの5マイクロリットルを再び注入します。カーボン-13アニリンタグ付き規格のmオーバーzイオン強度を取得します。このプロトコルでは、大腸菌系無細胞タンパク質合成において緑色蛍光タンパク質を発現する代謝産物を定量化した。中枢炭素およびエネルギー代謝に関与する40の代謝産物を、内部標準を用いて検出・定量した。アニリンでタグ付けされなかった5つの代謝産物の標準曲線も開発されました。これらの経路に関与する多様な代謝産物は、リン酸化糖、ホスホカルボン酸、カルボン酸、ヌクレオチド、および共因子のクラスであった。さらに、この方法により、グルコース-6リン酸、フルクトース-6リン酸などの構造異性体対の分離が1回のLC-MSランで可能になった。最も重要なステップは、非タンパク質化サンプルをアニリンで標識することです。アニリン溶液は分離するので、安全の良い慣行を維持しながら、迅速かつ効果的に作業することが重要です。この方法は、40の代謝産物の定量化と無細胞代謝を特徴付けるのに役立ちます。しかし、その他の化合物は、定量化できるアミノ酸などの無細胞混合物中にある。これは、無細胞代謝のより包括的な外観を提供するのに役立ちます.この方法は、無細胞系は複雑な代謝を有することを明らかにした, まだより良いエネルギー効率と炭素収量のために利用することができる潜在的に利用することができる動作.このプロトコルは、触媒としてEDCを使用してアニリンで化合物をタグ付けすることに依存しています。これらの試薬は危険であり、注意して使用する必要があります。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

時間分解エレクトロスプレーイオン化水素 - 重水素交換質量分析タンパク質の構造とダイナミクスを学ぶために

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

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ブルーネイティブPAGEおよびタンパク質相関プロファイリングによってアフィニティー精製タンパク質複合体の解決

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A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

代謝産物分析のためのタンデム液体クロマトグラフィー - 質量分析に基づくアプローチ<em&gt;黄色ブドウ球菌</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

定圧ラベリング、豊富な液体クロマトグラフィー、質量分析法、およびソフトウェアによる定量化して深いプロテオームをプロファイリング

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High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

蛍光顕微鏡を使用して競争力のある滴定による転写因子の DNA 結合親和性の高感度測定

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Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

ペプチド濃縮と質量分析によるタンパク質ユビキチン化部位の検出

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

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液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析法を用いたサッカロミセス・セレビシエ細胞リピドームの定量的解析

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

組み合わせ単一ドメイン抗体ライブラリーの段階的ファージ選択による高特異的化学的誘起タンパク質二量体化システムの作成

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

無標的液体クロマトグラフィー-質量分析法ベースの小麦粒のメタボロミクス分析

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...