Name: absolute quantification of cell-free protein synthesis metabolism by reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry
Uploaded: 2019-10-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry at JoVE.com

기술된 일은 국립 암 학회 (https://www.cancer.gov/)에서 수상 번호 1U54CA210184-01을 통해 암 물질 대사의 물리학에 센터에 의해 지원되었습니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 암 연구소 또는 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. 기금 모금자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할을 하지 않았습니다.

1. 항리 선 태그시약 준비
<ol><li>pH 4.5에서 6M 아니라인 용액을 준비합니다. 후드에서 작업하여 550 μL의 애실린과 337.5 μL의 LCMS 등급의 물과 12M 염산(HCl)의 112.5 μL을 원심분리기 튜브에 결합합니다. 소용돌이잘 4 °C에서 저장합니다. 참고: 아닐린은 2개월 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다. 주의: 아닐린은 독성이 매우 높으며 연기 후드에서 작업해야 합니다. 염산은 매우 부식성이 높습니다.</li>...

<ol>
	<li>Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthetic+biology:+thinking+outside+the+cell.">Cell-free synthetic biology: thinking outside the cell.</a> Metabolic Engineering. 14, 261-269 (2012).</li><li>Vilkhovoy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+specific+modeling+of+E.+coli+cell-free+protein+synthesis.">Sequence specific modeling of E. coli cell-free protein synthesis.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (8), 1844-1857 (2018).</li><li>Vilkhovoy, M., Minot, M., Varner, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+dynamic+models+of+metabolic+networks.">Effective dynamic models of metabolic networks.</a> IEEE Life Sciences Letters. 2 (4), 51-54 (2016).</li><li>Horvath, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+genome+scale+sequence+specific+dynamic+model+of+cell-free+protein+synthesis+in+Escherichia+coli.">Toward a genome scale sequence specific dynamic model of cell-free protein synthesis in Escherichia coli.</a> bioRxiv. , 215012 (2017).</li><li>Dettmer, K., Aronov, P. A., Hammock, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+metabolomics.">Mass spectrometry-based metabolomics.</a> Mass spectrometry reviews. 26 (1), 51-78 (2007).</li><li>Hajjaj, H., Blanc, P. J., Goma, G., Fran&#231;ois, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sampling+techniques+and+comparative+extraction+procedures+for+quantitative+determination+of+intra-+and+extracellular+metabolites+in+filamentous+fungi.">Sampling techniques and comparative extraction procedures for quantitative determination of intra- and extracellular metabolites in filamentous fungi.</a> FEMS Microbiology Letters. 164 (1), 195-200 (1998).</li><li>Ruijter, G. J. G., Visser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+intermediary+metabolites+in+Aspergillus+niger.">Determination of intermediary metabolites in Aspergillus niger.</a> Journal of Microbiological Methods. 25 (3), 295-302 (1996).</li><li>Mailinger, W., Baltes, M., Theobald, U., Reuss, M., Rizzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+metabolic+dynamics+in+Saccharomyces+cerevisiae:+I.+Experimental+observations.">In vivo analysis of metabolic dynamics in Saccharomyces cerevisiae: I. Experimental observations.</a> Biotechnology and Bioengineering. 55 (2), 305-316 (1997).</li><li>Dunn, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+appeal:+metabolite+identification+in+mass+spectrometry-focused+untargeted+metabolomics.">Mass appeal: metabolite identification in mass spectrometry-focused untargeted metabolomics.</a> Metabolomics. 9 (1), 44-66 (2013).</li><li>Huang, T., Toro, M., Lee, R., Hui, D. S., Edwards, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-functional+derivatization+of+amine,+hydroxyl,+and+carboxylate+groups+for+metabolomic+investigations+of+human+tissue+by+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Multi-functional derivatization of amine, hydroxyl, and carboxylate groups for metabolomic investigations of human tissue by electrospray ionization mass spectrometry.</a> Analyst. 143 (14), 3408-3414 (2018).</li><li>Huang, T., Armbruster, M. R., Coulton, J. B., Edwards, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+Tagging+in+Mass+Spectrometry+for+Systems+Biology.">Chemical Tagging in Mass Spectrometry for Systems Biology.</a> Analytical Chemistry. 91 (1), 109-125 (2019).</li><li>Yang, W. C., Sedlak, M., Regnier, F. E., Mosier, N., Ho, N., Adamec, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+quantification+of+metabolites+involved+in+central+carbon+and+energy+metabolism+using+reversed-phase+liquid+chromatography-mass+spectrometry+and+in+vitro+13C+labeling.">Simultaneous quantification of metabolites involved in central carbon and energy metabolism using reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry and in vitro 13C labeling.</a> Analytical Chemistry. 80 (24), 9508-9516 (2008).</li><li>Jannasch, A., Sedlak, M., Adamec, J., Metz, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Pentose+Phosphate+Pathway+(PPP)+Metabolites+by+Liquid+Chromatography-Mass+Spectrometry+(LC-MS).">Quantification of Pentose Phosphate Pathway (PPP) Metabolites by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS).</a> Metabolic Profiling. Methods in Molecular Biology 708 (Methods and Protocols). , 159-171 (2011).</li><li>Luo, B., Groenke, K., Takors, R., Wandrey, C., Oldiges, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+multiple+intracellular+metabolites+in+glycolysis,+pentose+phosphate+pathway,+and+tricarboxylic+acid+cycle+by+liquid+chromatography-mass+spectrometry.">Simultaneous determination of multiple intracellular metabolites in glycolysis, pentose phosphate pathway, and tricarboxylic acid cycle by liquid chromatography-mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography A. 1147 (2), 153-164 (2007).</li></ol>

무세포 시스템에는 세포벽이 없으므로 복잡한 시료 전처리없이 대사산물과 생합성 기계에 직접 접근할 수 있습니다. 그러나 세포 없는 반응 시스템을 정량적으로 심문하기 위한 철저하고 견고한 프로토콜을 개발하기 위한 작업은 거의 이루어지지 않았습니다. 이 연구에서는 무세포 반응 혼합물과 잠재적으로 전세포 추출물에서 대사 산물을 정량화하는 빠르고 강력한 방법을 개발했습니다. 세포...

무세포 단백질 합성(CFPS)은 단백질과 화학 물질의 제조를 위한 유망한 플랫폼으로, 전통적으로 살아있는 세포를 위해 예약되어 있는 응용 프로그램입니다. 무세포 시스템은 조세포 추출물에서 유래하고 세포 성장과 관련된 합병증을제거1. 또한 CFPS는 세포벽의 간섭 없이 대사산물 및 생합성 기계에 직접 접근할 수 있도록 합니다. 그러나, 무세포 프로세스의 성능 한계에 대한 근본적인 이해는 부족했습니다. 대사 산물 정량화를위한 높은 처리량 방법은 신진 대사의 특성화에 유용하며 대사 전산 모델2,3,4의구성에 중요합니다. 대사 산물 농도를 결정하는 데 사용되는 일반적인 방법은 핵 자기 공명 (NMR), 푸리에 변환 적외선 분광법 (FT-IR), 효소 기반 분석 및 질량 분광법 (MS)5,6,7을포함합니다 ,8. 그러나, 이러한 방법은 종종 한 번에 여러 화합물을 효율적으로 측정할 수 없기 때문에 제한되며 종종 일반적인 무세포 반응보다 더 큰 샘플 크기를 필요로 합니다. 예를 들어, 효소 기반 세포는 종종 실행에서 단일 화합물을 정량화하는 데만 사용될 수 있으며, 세포없는 단백질 합성 반응과 같이 샘플 크기가 작을 때 제한됩니다 (전형적으로 10-15 μL 척도에서 실행). 한편, NMR검출 및 정량화를 위해 대사산물의 풍부도가 요구된다5.  이러한 단점을 향해, 질량 분석법 (LC / MS)와 함께 크로마토그래피 방법은 높은 감도 및 동시에 여러 종을 측정하는 기능을 포함하여 여러 장점을 제공합니다9; 그러나 분석 복잡성은 측정되는 종의 수와 다양성에 따라 상당히 증가합니다. 따라서 LC/MS 시스템의 높은 처리량 잠재력을 완전히 실현하는 방법을 개발하는 것이 중요합니다. 견본에 있는 화합물은 액체 크로마토그래피에 의해 분리되고 질량 분석법을 통해 확인됩니다. 화합물의 신호는 이온화가 화합물 마다 다를 수 있고 또한 견본 매트릭스에 따라 달라질 수 있는 그것의 집중 그리고 이온화 효율성에 달려 있습니다.
LC/MS를 사용하여 시료와 표준 간에 동일한 이온화 효율을 달성하는 것은 어려운 과제입니다. 또한, 양성자 친화성 및극성(10)에서신호 분할 및 이질성으로 인한 대사 산물 다양성으로 정량화는 더욱 어려워진다. 마지막으로, 샘플의 공동 용출 매트릭스는 또한 화합물의 이온화 효율에 영향을 미칠 수 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 대사 산물은 화학적으로 유도 될 수있다, LC / MS 시스템에 의해 분리 분해 및 감도를 증가, 동시에 어떤 경우에는 신호 분할을 감소하면서10,11. 화학적 유도체화는 대사산물의 특정 작용기를 태그하여 전하 또는 소수성 등의 물성을 조절하여 이온화 효율을 증가시킴으로써 작동한다11. 다양한 태깅 제제는 상이한 작용기(예를 들어, 아민, 하이드록실, 인산염, 카르복실산 등)를 표적으로 하는데 사용될 수 있다. 이러한 파생화 제중 하나인 Aniline은 한 번에 여러 작용체를 대상으로 하고 소수성 성분을 친수성 분자에 추가하여 분리 분해능 및신호(12)를증가시다. 공동 용출 매트릭스 이온 억제 효과를 해결하기 위해 Yang과 동료들은 표준에 13C이실린 동위원소와 태그를 지정하고 샘플과 혼합하는 그룹 별 내부 표준 기술(GSIST) 라벨링에 기반한 기술을 개발했습니다. 12,13. 대사 산물 및 해당 내부 표준은 공동 용해되기 때문에 동일한 이온화 효율을 가지며, 그들의 강도 비는 실험 샘플의 농도를 정량화하는 데 사용될 수 있습니다.
이 연구에서는, 우리는 CFPS 반응에 있는 glycolysis, 펜토오스 인산 통로, tricarboxylic 산 주기, 에너지 물질 대사 및 동료 회생에 관련시킨 40의 화합물을 검출하고 정량화하는 프로토콜을 개발했습니다. 이 방법은 역위상 LC/MS를 사용하여 대사 산물에 태그, 감지 및 정량화하기 위해 12C-aniline 및 13C-aniline을 사용한 GSIST 접근 방식을 기반으로 합니다. 모든 화합물의 선형 범위는 평균 상관 계수 0.988을 가진 크기의 2-3 순서에 걸쳐 있습니다. 따라서, 이 방법은 무세포 대사, 그리고 아마도 전체 세포 추출물을 심문하는 강력하고 정확한 접근법이다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:665px;" width="665">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">12C Aniline</td>
			<td style="width:121px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">242284</td>
			<td style="width:167px;">Aniline 12C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">13C labeled aniline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>485797</td>
			<td>Aniline 13C6</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">3-Phosphoglyceric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8877</td>
			<td>3PG</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetic Acid</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>AC222140010</td>
			<td>ACE</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile, LCMS</td>
			<td>JT BAKER</td>
			<td>9829-03</td>
			<td>ACN</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetyl-coenzyme A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2056</td>
			<td>ACA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acquity UPLC BEH C18 1.7 &#956;M, 2.1 x 150 mm Column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186002353</td>
			<td>Column</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adenosine diphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2754</td>
			<td>ADP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adenosine monophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1752</td>
			<td>AMP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adenosine triphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td>ATP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alpha-ketoglutarate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1128</td>
			<td>aKG</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>251275</td>
			<td>CIT</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytidine diphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9755</td>
			<td>CDP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytidine monophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1006</td>
			<td>CMP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytidine triphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9274</td>
			<td>CTP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">D-glyceraldehyde 3-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>39705</td>
			<td>GAP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Erythrose 4-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E0377</td>
			<td>E4P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EX0276</td>
			<td>EtOH</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fisher Scientific accuSpin Micro 17 Centrifuge</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td></td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Flavin adenine dinucleotide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6625</td>
			<td>FAD</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fructose 1,6-bisphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6803</td>
			<td>F16P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fructose 6-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3627</td>
			<td>F6P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fumarate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8509</td>
			<td>FUM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gluconate 6-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7877</td>
			<td>6PG</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>GLC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose 6-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7879</td>
			<td>G6P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol 3-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7886</td>
			<td>Gly3P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Guanosine diphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7127</td>
			<td>GDP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Guanosine monophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8377</td>
			<td>GMP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Guanosine triphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td>GTP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258148</td>
			<td>HCl</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isocitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1252</td>
			<td>ICIT</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L1750</td>
			<td>LAC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Malate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>02288</td>
			<td>MAL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">myTXTL - Sigma 70 Master Mix Kit</td>
			<td>ArborBiosciences</td>
			<td>507024</td>
			<td>Cell-free protein synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N-(3-dimethylaminopropyl)-N&#8242;-ethylcarbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03449</td>
			<td>EDC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nicotinamide adenine dinucleotide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43410</td>
			<td>NAD</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N5755</td>
			<td>NADP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>481973</td>
			<td>NADPH</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nicotinamide adenine dinucleotide reduced</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N8129</td>
			<td>NADH</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Oxalacetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O4126</td>
			<td>OAA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphoenolpyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0564</td>
			<td>PEP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280</td>
			<td>PYR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ribose 5-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R7750</td>
			<td>R5P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ribulose 5-phosphate</td>
			<td>CarboSynth</td>
			<td>MR45852</td>
			<td>RL5P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sedoheptulose 7-phosphate</td>
			<td>CarboSynth</td>
			<td>MS07457</td>
			<td>S7P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Succinate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3674</td>
			<td>SUCC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tributylamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90780</td>
			<td>TBA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triethylamine</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>O4884</td>
			<td>TEA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ultrapure water</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>10977-015</td>
			<td>water</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Uridine diphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U4125</td>
			<td>UDP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Uridine monophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6375</td>
			<td>UMP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Uridine triphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6625</td>
			<td>UTP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">VWR Heavy Duty Vortex</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>Vortex</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Water, LCMS</td>
			<td>JT BAKER</td>
			<td>9831-03</td>
			<td>WATER</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters Acquity H UPLC Class Quaternary Solvent Manager</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>LCMS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters Acquity H UPLC Class Sample Manager FTN</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>LCMS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters Acquity Qda detector</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>LCMS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters Empower 3</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters LCMS Total Recovery Vial</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186000384c</td>
			<td>LCMS Vial</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

absolute quantification of cell-free protein synthesis metabolism by reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry

무세포 단백질 합성(CFPS)은 체외 단백질 생산을 위한 시스템 및 합성 생물학의 새로운 기술입니다. 그러나 CFPS가 실험실을 넘어 제때 제조 기술에 대한 광범위하고 표준이 될 경우 이러한 시스템의 성능 한계를 이해해야 합니다. 이 질문으로, 우리는 GLYCOlysis, 펜토오스 인산 통로, 삼차 질산 주기, 에너지 대사 및 CFPS 반응에 있는 동료 회생에 관련시킨 40의 화합물을 정량화하는 강력한 프로토콜을 개발했습니다. 이 방법은 13C-aniline으로 태그가 지정된 내부 표준을 사용하는 반면 샘플의 화합물은 12C-aniline으로파생됩니다. 내부 표준 및 샘플을 역상 액체 크로마토그래피 질량 분석법(LC/MS)에 의해 혼합 및 분석하였다. 화합물의 공동 용출은 이온 억제를 제거하여 평균 상관 계수가 0.988인 2-3배 이상의 대사산물 농도를 정확하게 정량화할 수 있습니다. 40개의 화합물 중 5개는 아니라인으로 태그가 지정되지 않았지만, CFPS 샘플에서 여전히 검출되고 표준 곡선 방법으로 정량화되었습니다. 크로마토그래피 실행을 완료하는 데 약 10분이 걸립니다. 종합하면, 우리는 단일 LC/MS 실행에서 CFPS에 관련된 40개의 화합물을 분리하고 정확하게 정량화하는 빠르고 견고한 방법을 개발했습니다. 이 방법은 무세포 신진 대사를 특성화하는 포괄적이고 정확한 접근법으로 궁극적으로 무세포 시스템의 수율, 생산성 및 에너지 효율을 이해하고 향상시킬 수 있습니다.

개념 증명으로, 우리는 녹색 형광 단백질 (GFP)를 표현하는 대장균 기반 CFPS 시스템에서 대사 산물을 정량화하기 위해 프로토콜을 사용했습니다.  CFPS 반응(14 μL)을 담금질하고 에탄올로 탈단백질화하였다. CFPS 샘플은 12C-aniline으로 태그된 다음 표준은 13C-aniline으로태그가 지정되었습니다. 태그가 지정된 샘플 및 표준을 결합하여 LC/MS(그림1)에주입하였...

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Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

여기에서, 우리는 무세포 단백질 합성 반응에 있는 중앙 탄소 및 에너지 물질 대사에 관련시킨 40의 화합물을 정량화하는 강력한 프로토콜을 제시합니다. 무세포 합성 혼합물은 역상 액체 크로마토그래피를 사용하여 효과적인 분리를 위해 아일린으로 유도한 다음 동위원소로 표시된 내부 표준을 사용하여 질량 분석법에 의해 정량화됩니다.

역상 액체 크로마토그래피-질량 분광법에 의한 무세포 단백질 합성 대사의 절대 정량화

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

세포 없는 단백질 합성은 단백질의 체외 생산을 위한 시스템 및 합성 생물학에서 새로운 기술입니다. 세포없는 단백질 합성 시스템은 세포벽이 없으므로 대사 산물에 직접 접근할 수 있습니다. 이 프로토콜에서, 우리는 우리가 세포 없는 신진 대사를 특징지을 수 있는 중앙 탄소 및 에너지 물질 대사에 관련시키는 40개의 대사 산물의 절대 측정을 정량화합니다.프로토콜은 더 나은 분리 및 더 높은 질량 분광법 해상도를 허용하는 애니라인으로 화합물을 전이에 의존합니다. 또한, 대사 산물의 절대적인 정량화를 위해, 우리는 애니라인을 라벨을 붙이는 등소와 내부 표준을 사용합니다. 태그된 대사산물은 철 분억제효과를 제거하는 코엘루테를 제거합니다.화합물의 정확한 정량화를 허용합니다. 후드에서 작업, 결합 550 애니라인의 마이크로 리터, LC-MS 등급 물의 337.5 마이크로 리터와 결합. 그리고 원심분리기 튜브에 12개의 어금다 염산의 112.5 마이크로리터.소용돌이 잘, 그리고 pH 4.5 및 섭씨 4도에 6 개의 어니라인 용액을 저장합니다. 6개의 어금니 카본-13 애니라인 용액을 pH 4.5에서 250밀리그램의 탄소-13 애니라인을 132마이크로리터의 물과 결합하고, 12개의 어금니 염산의 44마이크로리터를 결합합니다. 소용돌이 잘, 4 섭씨에 저장합니다.밀리리터 EDC 용액당 200밀리그램을 준비하려면 모든 샘플에 태그를 지정할 수 있도록 10마이크로리터의 물에 EDC 2밀리그램을 녹입니다. 그리고 소용돌이 잘. 시료를 준비하려면, 담금질과 세포없는 단백질 합성 반응에서 단백질을 침전, 세포없는 합성 반응에 얼음 차가운 100% 에탄올의 동등한 양을 추가하여.원심 분리는 섭씨 4도에서 15 분 동안 12, 000 배 g에서 샘플을 원심 분리합니다. 샘플의 상체를 새로운 원심분리기 튜브로 옮는다. 카본-12 애니라인 용액으로 시료에 라벨을 부착하려면 샘플의 6마이크로리터를 새로운 원심분리기 튜브로 옮기고 물로 50마이크로리터에 부피를 전달합니다.밀리리터 EDC 솔루션당 5마이크로리터를 200밀리그램 으로 추가하고, 탄소-12 애니라인 용액을 잘 혼합하고, 5마이크로리터를 튜브로 옮킨다. 실온에서 2 시간 동안 부드러운 흔들림으로 반응을 소용돌이. 2시간 후 셰이커에서 튜브를 제거하고 연기 후드로 옮킨다.각 반응에 트리에틸라민 1.5 마이크로리터를 추가하여 애니라인 태깅 반응을 중지하고 화합물을 안정화시하십시오. 원심분리기는 13, 500배 3분간. 그리고 상체를 저장합니다.탄소-13 애니라인 솔루션으로 내부 표준을 레이블을 지정하려면 내부 스톡 솔루션을 50마이크로리터의 최종 부피로 80 마이크로몰러로 희석하십시오. 밀리리터 EDC 솔루션당 200밀리그램의 마이크로리터 5개, 잘 혼합된 탄소-13 애니라인 용액5개에 추가합니다. 실온에서 2 시간 동안 부드러운 흔들림으로 반응을 소용돌이.2 시간 후, 셰이커에서 튜브를 제거하고, 연기 후드의 반응에 트리에틸라민의 1.5 마이크로 리터를 추가합니다. 원심분리기는 13, 500배 g에서 3분간, 상수체를 저장합니다. 태그가 지정된 내부 표준과 태그가 지정된 샘플을 신성하게 하기 위해 각 마이크로리터를 자동 샘플러 바이알에 혼합합니다.그리고 LC-MS 절차에 의해 분석. 그런 다음, 태그가 지정되지 않은 대사 산물에 대한 표준 곡선을 생성하기 위해 먼저, 50 마이크로리터의 부피와 함께 태그가 지정되지 않은 대사 산물의 스톡 용액을 다른 농도로 희석한다. 밀리리터 EDC 솔루션당 200밀리그램의 마이크로리터 5개, 각 농도에 탄소-12 애니라인 용액 5개를 추가합니다.실온에서 2 시간 동안 부드러운 흔들림으로 반응을 소용돌이. 그리고 트리에틸라민 치료를 진행한다. 그리고 과거와 같이 LC-MS에 의해 분석하기 전에 원심화.제조업체의 지침에 따라 LC-MS를 초기화한 후 샘플의 마이크로리터 5기를 컬럼에 주입합니다. 그리고 탄소-12 애니라인 태그 시료에 대한 z 이온 강도에 대한 적절한 m을 획득한다. 그런 다음 동일한 샘플의 5 개의 마이크로 리터를 다시 주입하십시오.그리고 탄소-13 애니라인 태그 표준에 대한 m over z 이온 강도를 획득한다. 본 프로토콜에서, 대장균 계 세포 없는 단백질 합성에서 녹색 형광 단백질을 발현하는 대사산물이 정량화되었다. 중앙 탄소 및 에너지 대사에 관여하는 40개의 대사산물은 내부 표준을 사용하여 검출및 정량화되었다.애니라인으로 태그되지 않은 대사 산물 5개에 대한 표준 곡선도 개발되었다. 이 통로에 관련되었던 각종 대사산물은 인광성 설탕, 인계 카복실산, 카복실산, 뉴클레오티드 및 공동 인자의 부류였습니다. 또한, 이 방법은 단일 LC-MS 런에서 포도당-6인산염 및 과당-6인산염과 같은 구조적 이소성 쌍의 분리를 가능하게 하였다.가장 중요한 단계는 단백질분해된 샘플을 애니라인으로 라벨링하는 것입니다. 애니라인 솔루션이 분리되기 때문에 우수한 안전 관행을 유지하면서 신속하고 효과적으로 작업하는 것이 중요합니다. 이 방법은 40 대사 산물의 정량화와 세포없는 신진 대사를 특성화하는 데 도움이됩니다.그러나, 추가 화합물은 정량화될 수 있는 아미노산과 같은 세포없는 혼합물에 있다. 이 세포 없는 신진 대사에 더 포괄적인 모양을 제공에 도움이 될 것 이다. 이 방법은 세포 없는 시스템이 복잡한 신진 대사를 가지고 있으며, 여전히 더 나은 에너지 효율과 탄소 수율을 위해 잠재적으로 악용될 수 있는 작동을 가지고 있음을 밝혔습니다.프로토콜은 EDC를 촉매로 사용하여 애니라인으로 화합물을 태그하는 데 의존합니다. 이 시약은 모두 위험하며 주의해서 사용해야 합니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

시간 해결 전기 분무 이온화 수소 - 중수소 교환 질량 분석 단백질 구조와 역학 연구를위한

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

연구

생화학

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

블루 기본 페이지와 단백질 상관 관계 프로파일 링에 의한 선호도 정제 단백질 복합체 해결

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

의 대사 산물 분석을위한 탠덤 액체 크로마토 그래피 - 질량 분석 기반 접근<em&gt; 포도상 구균</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

깊은 프로테옴 Isobaric 라벨, 광범위 한 액체 크로마토그래피, 질량 분석 및 소프트웨어 기반 정량화 하 여 프로 파일링

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

경쟁 적정 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 녹음 방송 요인 DNA 바인딩 선호도의 높은 감도 측정

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

펩타이드 농축 및 질량 분광법에 의한 단백질 유비퀴틴화 부위 검출

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

탠덤 질량 분석과 결합 된 액체 크로마토그래피를 사용하여 사카로 미세화세세비시아의 세포 지질의 정량분석

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

결합 단일 도메인 항체 라이브러리의 단계별 파지 선택에 의해 고도로 특이적 화학적으로 유도된 단백질 이분화 시스템 생성

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

밀 곡물의 비표적 액체 크로마토그래피 질량 분광계 기반 대사체학 분석

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...