Name: absolute quantification of cell-free protein synthesis metabolism by reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry
Uploaded: 2019-10-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry at JoVE.com

Arbeidet beskrevet ble støttet av Center på Physics of Cancer metabolisme gjennom Award Number 1U54CA210184-01 fra National Cancer Institute (https://www.cancer.gov/). Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synspunktene til National Cancer Institute eller National Institutes of Health. Oppdragsgivers hadde ingen rolle i studien design, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.

1. forberedelse av reagenser for anilin merking
<ol><li>Forbered en 6 M anilin løsning på pH 4,5. Ved å arbeide i hette, kombinerer 550 μL av anilin med 337,5 μL av LCMS-grade vann og 112,5 μL av 12 M saltsyre (HCl) i et sentrifugerør. Vortex godt og oppbevares ved 4 ° c. Merk: anilin kan oppbevares ved 4 ° c i 2 måneder. FORSIKTIG: anilin er svært giftig og bør strikkes med en avtrekksvifte. Saltsyre er svært etsende</li>
	<li>Forbered en 6 M 13C anilin-løsning ved pH 4,5. Kombiner 250 m...

<ol>
	<li>Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthetic+biology:+thinking+outside+the+cell.">Cell-free synthetic biology: thinking outside the cell.</a> Metabolic Engineering. 14, 261-269 (2012).</li><li>Vilkhovoy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+specific+modeling+of+E.+coli+cell-free+protein+synthesis.">Sequence specific modeling of E. coli cell-free protein synthesis.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (8), 1844-1857 (2018).</li><li>Vilkhovoy, M., Minot, M., Varner, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+dynamic+models+of+metabolic+networks.">Effective dynamic models of metabolic networks.</a> IEEE Life Sciences Letters. 2 (4), 51-54 (2016).</li><li>Horvath, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+genome+scale+sequence+specific+dynamic+model+of+cell-free+protein+synthesis+in+Escherichia+coli.">Toward a genome scale sequence specific dynamic model of cell-free protein synthesis in Escherichia coli.</a> bioRxiv. , 215012 (2017).</li><li>Dettmer, K., Aronov, P. A., Hammock, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+metabolomics.">Mass spectrometry-based metabolomics.</a> Mass spectrometry reviews. 26 (1), 51-78 (2007).</li><li>Hajjaj, H., Blanc, P. J., Goma, G., Fran&#231;ois, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sampling+techniques+and+comparative+extraction+procedures+for+quantitative+determination+of+intra-+and+extracellular+metabolites+in+filamentous+fungi.">Sampling techniques and comparative extraction procedures for quantitative determination of intra- and extracellular metabolites in filamentous fungi.</a> FEMS Microbiology Letters. 164 (1), 195-200 (1998).</li><li>Ruijter, G. J. G., Visser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+intermediary+metabolites+in+Aspergillus+niger.">Determination of intermediary metabolites in Aspergillus niger.</a> Journal of Microbiological Methods. 25 (3), 295-302 (1996).</li><li>Mailinger, W., Baltes, M., Theobald, U., Reuss, M., Rizzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+metabolic+dynamics+in+Saccharomyces+cerevisiae:+I.+Experimental+observations.">In vivo analysis of metabolic dynamics in Saccharomyces cerevisiae: I. Experimental observations.</a> Biotechnology and Bioengineering. 55 (2), 305-316 (1997).</li><li>Dunn, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+appeal:+metabolite+identification+in+mass+spectrometry-focused+untargeted+metabolomics.">Mass appeal: metabolite identification in mass spectrometry-focused untargeted metabolomics.</a> Metabolomics. 9 (1), 44-66 (2013).</li><li>Huang, T., Toro, M., Lee, R., Hui, D. S., Edwards, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-functional+derivatization+of+amine,+hydroxyl,+and+carboxylate+groups+for+metabolomic+investigations+of+human+tissue+by+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Multi-functional derivatization of amine, hydroxyl, and carboxylate groups for metabolomic investigations of human tissue by electrospray ionization mass spectrometry.</a> Analyst. 143 (14), 3408-3414 (2018).</li><li>Huang, T., Armbruster, M. R., Coulton, J. B., Edwards, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+Tagging+in+Mass+Spectrometry+for+Systems+Biology.">Chemical Tagging in Mass Spectrometry for Systems Biology.</a> Analytical Chemistry. 91 (1), 109-125 (2019).</li><li>Yang, W. C., Sedlak, M., Regnier, F. E., Mosier, N., Ho, N., Adamec, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+quantification+of+metabolites+involved+in+central+carbon+and+energy+metabolism+using+reversed-phase+liquid+chromatography-mass+spectrometry+and+in+vitro+13C+labeling.">Simultaneous quantification of metabolites involved in central carbon and energy metabolism using reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry and in vitro 13C labeling.</a> Analytical Chemistry. 80 (24), 9508-9516 (2008).</li><li>Jannasch, A., Sedlak, M., Adamec, J., Metz, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Pentose+Phosphate+Pathway+(PPP)+Metabolites+by+Liquid+Chromatography-Mass+Spectrometry+(LC-MS).">Quantification of Pentose Phosphate Pathway (PPP) Metabolites by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS).</a> Metabolic Profiling. Methods in Molecular Biology 708 (Methods and Protocols). , 159-171 (2011).</li><li>Luo, B., Groenke, K., Takors, R., Wandrey, C., Oldiges, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+multiple+intracellular+metabolites+in+glycolysis,+pentose+phosphate+pathway,+and+tricarboxylic+acid+cycle+by+liquid+chromatography-mass+spectrometry.">Simultaneous determination of multiple intracellular metabolites in glycolysis, pentose phosphate pathway, and tricarboxylic acid cycle by liquid chromatography-mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography A. 1147 (2), 153-164 (2007).</li></ol>

Celle frie systemer har ingen cellevegg, og dermed er det direkte tilgang til metabolitter og biosyntetiske maskiner uten behov for komplekse prøve forberedelser. Men svært lite arbeid har blitt gjort for å utvikle grundige og robuste protokoller for å kvantitativt avhøre celle-fri reaksjons systemer. I denne studien utviklet vi en rask og robust metode for å kvantifisere metabolitter i celle frie reaksjonsblandinger og potensielt i hel celle ekstrakter. Individuell kvantifisering av metabolitter i komplekse blandi...

Cell-fri proteinsyntese (CFPS) er en lovende plattform for produksjon av proteiner og kjemikalier, et program som tradisjonelt har vært forbeholdt levende celler. Cell-frie systemer er avledet fra rå celle ekstrakter og eliminere komplikasjoner forbundet med cellevekst1. I tillegg gir CFPS for direkte tilgang til metabolitter og biosyntetiske maskiner uten innblanding av en cellevegg. Imidlertid har en fundamental forståelse av ytelsen grensene for celle-fri prosesser manglet. Høy gjennomstrømming metoder for metabolitten kvantifisering er verdifulle for karakterisering av metabolisme og er avgjørende for bygging av metabolske beregningsorientert modeller2,3,4. Vanlige metoder som brukes til å bestemme metabolitten konsentrasjoner inkluderer kjernefysisk magnetisk resonans (NMR), Fourier Transform-infrarød spektroskopi (FT-IR), enzym-baserte analyser, og Mass massespektrometri (MS)5,6,7 ,8. Men disse metodene er ofte begrenset av deres manglende evne til å effektivt måle flere forbindelser samtidig og ofte krever en utvalgsstørrelse større enn typiske celle-frie reaksjoner. Enzymbasert analyser kan for eksempel ofte bare brukes til å kvantifisere en enkelt forbindelse i en løpetur, og er begrenset når utvalgsstørrelsen er liten, for eksempel i celle frie protein syntese reaksjoner (vanligvis kjøres på en 10-15-skala på μL). I mellomtiden krever NMR en høy overflod av metabolitter for deteksjon og kvantifisering5.  Mot disse svakhetene, kromatografi metoder i tandem med masse massespektrometri (LC/MS) gir flere fordeler, inkludert høy følsomhet og evnen til å måle flere arter samtidig9; imidlertid øker den analytiske kompleksiteten betraktelig med antallet og mangfoldet av arter som måles. Det er derfor viktig å utvikle metoder som fullt ut realiserer potensialet i LC/MS-systemer med høy gjennomstrømming. Sammensetninger i en prøve er adskilt av flytende kromatografi og identifisert gjennom masse massespektrometri. Signalet av det sammensatte avhenger av konsentrasjonen og ionisering effektivitet, hvor ionisering kan variere mellom forbindelser og kan også avhenge av utvalget matrise.
Å oppnå samme ionisering effektivitet mellom prøven og standardene er en utfordring ved bruk av LC/MS for å kvantifisere analytter. Videre blir kvantifisering mer utfordrende med metabolitten mangfold på grunn av signal splitting og heterogenitet i Proton affinitet og polaritet10. Til slutt, den co-tent matrise av prøven kan også påvirke ionisering effektiviteten av forbindelsene. For å løse disse problemene, kan metabolitter være kjemisk derivatized, øke separasjon oppløsning og følsomhet av LC/MS systemer, samtidig redusere signal splitting i noen tilfeller10,11. Kjemisk derivatization fungerer ved å tagge spesifikke funksjonsgrupper av metabolitter for å justere sine fysiske egenskaper som ladning eller hydrofobisiteten for å øke ionisering effektivitet11. Ulike merking agenter kan brukes til å målrette ulike funksjonelle grupper (f. eks aminer, hydroksyler, fosfater, kar bok syls syrer, etc.). Anilin, en slik derivatization agent, mål flere funksjonelle grupper samtidig, og legger en hydrofobe komponent i hydrofile molekyler, og dermed øke deres separasjon oppløsning og signal12. For å håndtere co-tent Matrix ion undertrykkelse effekt, Yang og kolleger utviklet en teknikk basert på Group Specific intern standard Technology (GSIST) merking der standarder er merket med 13C anilin isotoper og blandes med prøven 12,13. Metabolitten og tilsvarende interne standarden har samme ionisering effektivitet siden de co-eluere, og deres intensitet ratio kan brukes til å kvantifisere konsentrasjonen i den eksperimentelle prøven.
I denne studien, utviklet vi en protokoll for å oppdage og kvantifisere 40 forbindelser involvert i Glykolysen, den pentose fosfat veien, tricarboxylic syre syklus, energi metabolisme og kofaktor regenerering i CFPS reaksjoner. Metoden er basert på GSIST tilnærming, der vi brukte 12c-anilin og 13c-anilin å merke, oppdage og kvantifisere metabolitter bruker reversert-fase LC/MS. Den lineære rekkevidden av alle forbindelser spredte 2-3 størrelsesordener med en gjennomsnittlig korrelasjonskoeffisient på 0,988. Således er metoden en robust og nøyaktig tilnærming til å forhøre celle-fri metabolisme, og muligens hel celle ekstrakter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:665px;" width="665">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">12C Aniline</td>
			<td style="width:121px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">242284</td>
			<td style="width:167px;">Aniline 12C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">13C labeled aniline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>485797</td>
			<td>Aniline 13C6</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">3-Phosphoglyceric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8877</td>
			<td>3PG</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetic Acid</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>AC222140010</td>
			<td>ACE</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile, LCMS</td>
			<td>JT BAKER</td>
			<td>9829-03</td>
			<td>ACN</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetyl-coenzyme A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2056</td>
			<td>ACA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acquity UPLC BEH C18 1.7 &#956;M, 2.1 x 150 mm Column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186002353</td>
			<td>Column</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adenosine diphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2754</td>
			<td>ADP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adenosine monophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1752</td>
			<td>AMP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adenosine triphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td>ATP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alpha-ketoglutarate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1128</td>
			<td>aKG</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>251275</td>
			<td>CIT</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytidine diphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9755</td>
			<td>CDP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytidine monophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1006</td>
			<td>CMP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytidine triphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9274</td>
			<td>CTP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">D-glyceraldehyde 3-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>39705</td>
			<td>GAP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Erythrose 4-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E0377</td>
			<td>E4P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EX0276</td>
			<td>EtOH</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fisher Scientific accuSpin Micro 17 Centrifuge</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td></td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Flavin adenine dinucleotide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6625</td>
			<td>FAD</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fructose 1,6-bisphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6803</td>
			<td>F16P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fructose 6-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3627</td>
			<td>F6P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fumarate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8509</td>
			<td>FUM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gluconate 6-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7877</td>
			<td>6PG</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>GLC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose 6-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7879</td>
			<td>G6P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol 3-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7886</td>
			<td>Gly3P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Guanosine diphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7127</td>
			<td>GDP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Guanosine monophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8377</td>
			<td>GMP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Guanosine triphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td>GTP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258148</td>
			<td>HCl</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isocitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1252</td>
			<td>ICIT</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L1750</td>
			<td>LAC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Malate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>02288</td>
			<td>MAL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">myTXTL - Sigma 70 Master Mix Kit</td>
			<td>ArborBiosciences</td>
			<td>507024</td>
			<td>Cell-free protein synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N-(3-dimethylaminopropyl)-N&#8242;-ethylcarbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03449</td>
			<td>EDC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nicotinamide adenine dinucleotide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43410</td>
			<td>NAD</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N5755</td>
			<td>NADP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>481973</td>
			<td>NADPH</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nicotinamide adenine dinucleotide reduced</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N8129</td>
			<td>NADH</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Oxalacetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O4126</td>
			<td>OAA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphoenolpyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0564</td>
			<td>PEP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280</td>
			<td>PYR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ribose 5-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R7750</td>
			<td>R5P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ribulose 5-phosphate</td>
			<td>CarboSynth</td>
			<td>MR45852</td>
			<td>RL5P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sedoheptulose 7-phosphate</td>
			<td>CarboSynth</td>
			<td>MS07457</td>
			<td>S7P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Succinate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3674</td>
			<td>SUCC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tributylamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90780</td>
			<td>TBA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triethylamine</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>O4884</td>
			<td>TEA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ultrapure water</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>10977-015</td>
			<td>water</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Uridine diphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U4125</td>
			<td>UDP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Uridine monophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6375</td>
			<td>UMP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Uridine triphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6625</td>
			<td>UTP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">VWR Heavy Duty Vortex</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>Vortex</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Water, LCMS</td>
			<td>JT BAKER</td>
			<td>9831-03</td>
			<td>WATER</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters Acquity H UPLC Class Quaternary Solvent Manager</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>LCMS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters Acquity H UPLC Class Sample Manager FTN</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>LCMS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters Acquity Qda detector</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>LCMS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters Empower 3</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters LCMS Total Recovery Vial</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186000384c</td>
			<td>LCMS Vial</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

absolute quantification of cell-free protein synthesis metabolism by reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry

Celle-fri proteinsyntese (CFPS) er en ny teknologi i systemer og syntetisk biologi for in vitro produksjon av proteiner. Men hvis CFPS kommer til å gå utover laboratoriet og bli en utbredt og standard akkurat i tide produksjon teknologi, må vi forstå ytelsen grensene for disse systemene. Mot dette spørsmålet, utviklet vi en robust protokoll for å kvantifisere 40 forbindelser involvert i Glykolysen, den pentose fosfat veien, tricarboxylic syre syklus, energi metabolisme og kofaktor regenerering i CFPS reaksjoner. Metoden bruker interne standarder merket med 13c-anilin, mens forbindelser i utvalget er derivatized med 12c-anilin. Den interne standarder og prøven ble blandet og analysert av reversert-fase flytende kromatografi-Mass massespektrometri (LC/MS). Eluering av forbindelser eliminert ion undertrykkelse, slik at nøyaktig kvantifisering av metabolitten konsentrasjoner over 2-3 størrelsesordener der den gjennomsnittlige korrelasjonskoeffisienten var 0,988. Fem av de 40 forbindelsene ble umerkede med anilin, men de ble likevel oppdaget i CFPS prøven og kvantifisert med en standard kurve metode. Det kromatografiske løpe tar ca 10 min å fullføre. Til sammen har vi utviklet en rask, robust metode for å skille og nøyaktig kvantifisere 40 forbindelser involvert i CFPS i en enkelt LC/MS Run. Metoden er en omfattende og nøyaktig tilnærming til å karakterisere celle-fri metabolisme, slik at til slutt, kan vi forstå og forbedre avkastningen, produktivitet og energieffektivisering av celle-frie systemer.

Som et proof-of-konsept, vi brukte protokollen til å kvantifisere metabolitter i en E. coli basert CFPS system uttrykker grønt fluorescerende PROTEIN (GFP).  CFPS-reaksjonen (14 μL) ble slukket og deproteinized med etanol. CFPS-prøven ble deretter merket med 12c-anilin, mens standardene ble merket med 13c-anilin. Den kodede prøven og standardene ble deretter kombinert og injisert i LC/MS (figur 1). Protokollen oppdaget og kvantifisert 40 metabolitter er i...

Watch this Scientific Journal Video about Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry at JoVE.com

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Her presenterer vi en robust protokoll for å kvantifisere 40 forbindelser involvert i Sentral karbon og energi metabolisme i celle-fri protein syntese reaksjoner. Den celle frie syntese blandingen er derivatized med anilin for effektiv separasjon ved hjelp av reversert-fase flytende kromatografi og deretter kvantifisert av masse massespektrometri bruker isotopically merket interne standarder.

Absolutt kvantifisering av Cell-fri protein syntese metabolisme av reversert-fase flytende kromatografi-Mass massespektrometri

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Cellefri proteinsyntese er en ny teknologi i systemer og syntetisk biologi for in vitro produksjon av proteiner. Cellefrie proteinsyntesesystemer har ingen cellevegg, og dermed har vi direkte tilgang til metabolitter. I denne protokollen kvantifiserer vi de absolutte målingene av 40 metabolitter involvert i sentral karbon- og energimetabolisme, noe som gjør at vi kan karakterisere cellefri metabolisme.Protokollen er avhengig av metastasering forbindelsene med anilin, noe som gir bedre separasjon og høyere massespektrometri oppløsning. I tillegg bruker vi interne standarder med en isotopisk vi merker anilin, for absolutt kvantifisering av metabolittene. De merkede metabolittene koelute, som eliminerer effekten av jernundertrykkelse.Åpner for nøyaktig kvantifisering av forbindelsene. I en hette kombinerer du 550 mikroliter av anilin, med 337,5 mikroliter LC-MS-graders vann. Og 112,5 mikroliter 12 molarsyre i et sentrifugerør.Vortex godt, og lagre de seks molar anilin løsning på pH 4,5 og fire grader Celsius. For å forberede en seks molar karbon-13 anilin løsning, på pH 4.5, kombinere 250 milligram karbon-13anilin med 132 mikroliter vann, og 44 mikroliter av 12 molar saltsyre. Vortex godt, og lagre på fire grader Celsius.For å forberede 200 milligram per milliliter EDC-løsning, oppløs to milligram EDC i 10 mikroliter vann for hver prøve som skal merkes. Og virvel godt. For å forberede prøver, slukke og utløse proteinene i en cellefri proteinsyntesereaksjon, ved å legge til et likt volum iskaldt 100% etanol til den cellefrie syntesereaksjonen.Sentrifuger prøven på 12 000 ganger g, i 15 minutter ved fire grader Celsius. Overfør den overnaturlige prøven til et nytt sentrifugerør. For å merke prøven med karbon-12anilinløsning, overfør seks mikroliter av prøven til et nytt sentrifugerør, og bring volumet til 50 mikroliter med vann.Tilsett 5 mikroliter på 200 milligram per milliliter EDC-løsning, bland karbon-12 anilinløsningen godt, og overfør 5 mikroliter inn i røret. Vortex reaksjonen med mild risting i to timer ved romtemperatur. Etter to timer, fjern rørene fra shakeren og overfør dem til en røykhette.Tilsett 1,5 mikroliter trietyamin til hver reaksjon for å stoppe anilinmerkingsreaksjonen og stabilisere forbindelsene. Sentrifuge på 13, 500 ganger g i tre minutter. Og lagre det overnaturlige.For å merke de interne standardene med karbon-13 anilinløsning, fortynne den interne lagerløsningen til 80 mikromos med et endelig volum på 50 mikroliter. Tilsett fem mikroliter av 200 milligram per milliliter EDC-løsning, og fem mikroliter av den godt blandede karbon-13 anilinløsningen. Vortex reaksjonen med mild risting i to timer ved romtemperatur.Etter to timer, fjern rørene fra shakeren, og legg til 1,5 mikroliter trietylamin til reaksjonen i en røykhette. Sentrifuge på 13, 500 ganger g i tre minutter og lagre supernatant. For å guddommeliggjøre den kodede interne standarden, og den merkede prøven, bland 25 mikroliter av hver i et autosampler hetteglass.Og analysere ved LC-MS prosedyren. Deretter, for å skape en standard kurve for ukodede metabolitter, først, fortynne lagerløsningen av ukodede metabolitter til forskjellige konsentrasjoner, med volum på 50 mikroliter. Tilsett fem mikroliter av 200 milligram per milliliter EDC-løsning, og fem mikroliter karbon-12 anilinløsning til hver konsentrasjon.Vortex reaksjonen med mild risting i to timer ved romtemperatur. Og fortsett med trietylaminbehandlingen. Og sentrifugalisering før analyse av LC-MS som tidligere.Etter initialisering av LC-MS, i henhold til produsentens instruksjoner, injiser fem mikroliter av prøven i kolonnen. Og tilegne deg de riktige m over z ion intensiteter for karbon-12 anilin merket prøven. Deretter injiserer du fem mikroliter av samme prøve igjen.Og skaffe m over z ion intensiteter for karbon-13 anilin merket standarder. I denne protokollen ble metabolitter som uttrykker grønt fluorescerende protein i en E.coli-basert cellefri proteinsyntese kvantifisert. 40 metabolitter involvert i sentral karbon- og energimetabolisme, ble oppdaget og kvantifisert ved hjelp av interne standarder.Mens en standard kurve for fem av metabolitter som ikke ble merket med anilin ble også utviklet. De ulike metabolittene som var involvert i disse banene var en klasse fosforyler, fosfo-karboksylsyrer, karboksylsyrer, nukleotider og samtidige faktorer. I tillegg gjorde metoden det mulig å skille mellom strukturelle isomerpar, som glukose-seks fosfat og fruktose-seks fosfat i en enkelt LC-MS-kjøring.Det viktigste trinnet er å merke den avproteiniserte prøven med anilin. Siden anilinløsningen skiller seg, er det viktig å arbeide raskt og effektivt, samtidig som god sikkerhetspraksis opprettholdes. Denne metoden bidrar til å karakterisere cellefri metabolisme med kvantifisering av 40 metabolitter.Men, flere forbindelser er i cellefri blanding, som aminosyrer som kan kvantifiseres. Dette ville hjelpe i å gi en mer omfattende titt på celle-fri metabolisme. Denne metoden viste at cellefrie systemer har komplekse metabolismer, fortsatt i drift som potensielt kan utnyttes for bedre energieffektivitet og karbonutbytte.Protokollen er avhengig av å tagge forbindelsene med anilin med bruk av EDC som katalysator. Begge disse reagensene er farlige og bør brukes med forsiktighet.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrospray-ionisering Hydrogen-deuterium Veksling massespektrometri for å studere Protein struktur og dynamikk

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Løse affinitetsrenset protein komplekser av Blå Native PAGE og Protein korrelasjon Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

Et tandem-væskekromatografi-massespektrometri basert tilnærming for Metabolitt Analyse av<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Dyp proteom profilering av isobar merking, omfattende flytende Ture, massespektrometri og Software-baserte kvantifisering

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Høy følsomhet måling av transkripsjon faktor-DNA Binding slektskap av konkurransedyktige titrering bruker fluorescens mikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Påvisning av protein ubiquitination nettsteder av peptid berikelse og masse spektrometri

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ analyse av cellulær lipidom eav saccharomyces cerevisiae ved hjelp av flytende kromatografi kombinert med tandem massespektrometri

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Opprette svært spesifikke kjemisk indusert protein Dimerization Systems av trinnvis Phage utvalg av Kombinatorisk single-Domain antistoff bibliotek

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Umålrettet flytende kromatografi-massespektrometribasert metabolomikkanalyse av hvetekorn

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...