Name: absolute quantification of cell-free protein synthesis metabolism by reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry
Uploaded: 2019-10-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry at JoVE.com

O trabalho descrito foi apoiado pelo Centro de Física do Metabolismo do Câncer através do Prêmio Número 1U54CA210184-01 do Instituto Nacional do Câncer (https://www.cancer.gov/). O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais do Instituto Nacional do Câncer ou dos Institutos Nacionais de Saúde. Os financiadores não tiveram nenhum papel no projeto do estudo, na coleta e na análise de dados, na decisão de publicar ou na preparação do manuscrito.

1. Preparação de reagentes para marcação de aniline
<ol><li>Prepare uma solução aniline de 6 M no pH 4.5. Trabalhando em um capô, combinar 550 μL de aniline com 337,5 μL de água grau LCMS e 112,5 μL de 12 M ácido clorídrico (HCl) em um tubo de centrífuga. Vortex bem e armazenar a 4 °C. NOTA: A aniline pode ser armazenada a 4 °C por 2 meses. CUIDADO: Aniline é altamente tóxico e deve ser trabalhado com em um capô de fumaça. O ácido clorídrico é altamente corrosivo</li>
	<li>Prepare uma solu?...

<ol>
	<li>Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthetic+biology:+thinking+outside+the+cell.">Cell-free synthetic biology: thinking outside the cell.</a> Metabolic Engineering. 14, 261-269 (2012).</li><li>Vilkhovoy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+specific+modeling+of+E.+coli+cell-free+protein+synthesis.">Sequence specific modeling of E. coli cell-free protein synthesis.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (8), 1844-1857 (2018).</li><li>Vilkhovoy, M., Minot, M., Varner, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+dynamic+models+of+metabolic+networks.">Effective dynamic models of metabolic networks.</a> IEEE Life Sciences Letters. 2 (4), 51-54 (2016).</li><li>Horvath, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+genome+scale+sequence+specific+dynamic+model+of+cell-free+protein+synthesis+in+Escherichia+coli.">Toward a genome scale sequence specific dynamic model of cell-free protein synthesis in Escherichia coli.</a> bioRxiv. , 215012 (2017).</li><li>Dettmer, K., Aronov, P. A., Hammock, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+metabolomics.">Mass spectrometry-based metabolomics.</a> Mass spectrometry reviews. 26 (1), 51-78 (2007).</li><li>Hajjaj, H., Blanc, P. J., Goma, G., Fran&#231;ois, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sampling+techniques+and+comparative+extraction+procedures+for+quantitative+determination+of+intra-+and+extracellular+metabolites+in+filamentous+fungi.">Sampling techniques and comparative extraction procedures for quantitative determination of intra- and extracellular metabolites in filamentous fungi.</a> FEMS Microbiology Letters. 164 (1), 195-200 (1998).</li><li>Ruijter, G. J. G., Visser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+intermediary+metabolites+in+Aspergillus+niger.">Determination of intermediary metabolites in Aspergillus niger.</a> Journal of Microbiological Methods. 25 (3), 295-302 (1996).</li><li>Mailinger, W., Baltes, M., Theobald, U., Reuss, M., Rizzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+metabolic+dynamics+in+Saccharomyces+cerevisiae:+I.+Experimental+observations.">In vivo analysis of metabolic dynamics in Saccharomyces cerevisiae: I. Experimental observations.</a> Biotechnology and Bioengineering. 55 (2), 305-316 (1997).</li><li>Dunn, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+appeal:+metabolite+identification+in+mass+spectrometry-focused+untargeted+metabolomics.">Mass appeal: metabolite identification in mass spectrometry-focused untargeted metabolomics.</a> Metabolomics. 9 (1), 44-66 (2013).</li><li>Huang, T., Toro, M., Lee, R., Hui, D. S., Edwards, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-functional+derivatization+of+amine,+hydroxyl,+and+carboxylate+groups+for+metabolomic+investigations+of+human+tissue+by+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Multi-functional derivatization of amine, hydroxyl, and carboxylate groups for metabolomic investigations of human tissue by electrospray ionization mass spectrometry.</a> Analyst. 143 (14), 3408-3414 (2018).</li><li>Huang, T., Armbruster, M. R., Coulton, J. B., Edwards, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+Tagging+in+Mass+Spectrometry+for+Systems+Biology.">Chemical Tagging in Mass Spectrometry for Systems Biology.</a> Analytical Chemistry. 91 (1), 109-125 (2019).</li><li>Yang, W. C., Sedlak, M., Regnier, F. E., Mosier, N., Ho, N., Adamec, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+quantification+of+metabolites+involved+in+central+carbon+and+energy+metabolism+using+reversed-phase+liquid+chromatography-mass+spectrometry+and+in+vitro+13C+labeling.">Simultaneous quantification of metabolites involved in central carbon and energy metabolism using reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry and in vitro 13C labeling.</a> Analytical Chemistry. 80 (24), 9508-9516 (2008).</li><li>Jannasch, A., Sedlak, M., Adamec, J., Metz, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Pentose+Phosphate+Pathway+(PPP)+Metabolites+by+Liquid+Chromatography-Mass+Spectrometry+(LC-MS).">Quantification of Pentose Phosphate Pathway (PPP) Metabolites by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS).</a> Metabolic Profiling. Methods in Molecular Biology 708 (Methods and Protocols). , 159-171 (2011).</li><li>Luo, B., Groenke, K., Takors, R., Wandrey, C., Oldiges, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+multiple+intracellular+metabolites+in+glycolysis,+pentose+phosphate+pathway,+and+tricarboxylic+acid+cycle+by+liquid+chromatography-mass+spectrometry.">Simultaneous determination of multiple intracellular metabolites in glycolysis, pentose phosphate pathway, and tricarboxylic acid cycle by liquid chromatography-mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography A. 1147 (2), 153-164 (2007).</li></ol>

Os sistemas livres de células não têm parede celular, portanto, há acesso direto a metabólitos e as máquinas biossintéticas sem a necessidade de preparação complexa da amostra. No entanto, muito pouco trabalho tem sido feito para desenvolver protocolos completos e robustos para interrogar quantitativamente sistemas de reação livres de células. Neste estudo, desenvolvemos um método rápido e robusto para quantificar metabólitos em misturas de reação livre de células e potencialmente em extratos de célula...

A síntese de proteínas livres de células (CFPS) é uma plataforma promissora para a fabricação de proteínas e produtos químicos, uma aplicação que tradicionalmente tem sido reservada para células vivas. Sistemas livres de células são derivados de extratos de células brutas e eliminar as complicações associadas com o crescimento celular1. Além disso, o CFPS permite o acesso direto aos metabólitos e às máquinas biossintéticas sem a interferência de uma parede celular. No entanto, tem faltado uma compreensão fundamental dos limites de desempenho dos processos livres de células. Métodos de alta taxa de produção para quantificação de metabólitos são valiosos para a caracterização do metabolismo e são fundamentais para a construção de modelos computacionais metabólicos2,3,4. Os métodos comuns usados para determinar concentrações de metabolizados incluem ressonância magnética nuclear (RM), espectroscopia transformo-infravermelha de Fourier (FT-IR), ensaios baseados em enzimas e espectrometria de massa (MS)5,6,7 8. No entanto, estes métodos são muitas vezes limitados pela sua incapacidade de medir eficientemente vários compostos de uma só vez e muitas vezes exigem um tamanho amostral maior do que as reações típicas livres de células. Por exemplo, ensaios baseados em enzimas muitas vezes só podem ser usados para quantificar um único composto em uma corrida, e são limitados quando o tamanho da amostra é pequeno, como em reações de síntese de proteínas livres de células (normalmente executado em uma escala de 10-15 μL). Enquanto isso, nmr requer uma alta abundância de metabólitos para detecção e quantificação5.  Para essas deficiências, os métodos de cromatografia em conjunto com a espectrometria de massa (LC/MS) fornecem várias vantagens, incluindo alta sensibilidade e a capacidade de medir várias espécies simultaneamente9; no entanto, a complexidade analítica aumenta consideravelmente com o número e a diversidade de espécies sendo medidos. É importante, portanto, desenvolver métodos que realizem plenamente o potencial de alta taxa de veiviação dos sistemas LC/MS. Os compostos em uma amostra são separados pela cromatografia líquida e identificados através da espectrometria de massa. O sinal do composto depende de sua eficiência de concentração e ionização, onde a ionização pode variar entre compostos e também pode depender da matriz da amostra.
Alcançar a mesma eficiência de ionização entre a amostra e os padrões é um desafio ao usar LC/MS para quantificar os analitos. Além disso, a quantificação torna-se mais desafiadora com a diversidade de metabólitos devido à divisão de sinais e heterogeneidade na afinidade e polaridade de prótons10. Por fim, a matriz de co-eluting da amostra também pode afetar a eficiência de ionização dos compostos. Para resolver esses problemas, os metabólitos podem ser quimicamente derivatizados, aumentando a resolução e sensibilidade de separação por sistemas LC/MS, ao mesmo tempo em que diminuem a divisão de sinais em alguns casos10,11. A derivatização química funciona marcando grupos funcionais específicos de metabólitos para ajustar suas propriedades físicas, como carga ou hidrofóbica, para aumentar a eficiência de ionização11. Vários agentes de marcação podem ser usados para atingir diferentes grupos funcionais (por exemplo, aminas, hidroxils, fosfatos, ácidos carboxílicos, etc.). Aniline, um tal agente de derivatização, tem como alvo vários grupos funcionais ao mesmo tempo, e adiciona um componente hidrofóbico em moléculas hidrofílicas, aumentando assim a sua resolução de separação e sinal12. Para abordar o efeito de supressão de íons de matriz cooperativa, Yang e colegas de trabalho desenvolveram uma técnica baseada na rotulagem da Tecnologia De Padrão Interno Específico do Grupo (GSIST), onde os padrões são marcados com isótopos aniline 13C e misturados com a amostra 12,13. O metabolito e o padrão interno correspondente têm a mesma eficiência de ionização desde que co-elute, e sua razão de intensidade pode ser usada para quantificar a concentração na amostra experimental.
Neste estudo, desenvolvemos um protocolo para detectar e quantificar 40 compostos envolvidos na glicolíse, a via de fosfato de pentose, o ciclo de ácido tricarboxílico, metabolismo energético e regeneração de cofator em reações de CFPS. O método é baseado na abordagem GSIST, onde usamos 12C-aniline e 13C-aniline para marcar, detectar e quantificar metabólitos usando LC/MS de fase invertida. A escala linear de todos os compostos mediu 2-3 ordens do valor com um coeficiente médio da correlação de 0.988. Assim, o método é uma abordagem robusta e precisa para interrogar o metabolismo livre de células e, possivelmente, extratos de células inteiras.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:665px;" width="665">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">12C Aniline</td>
			<td style="width:121px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">242284</td>
			<td style="width:167px;">Aniline 12C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">13C labeled aniline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>485797</td>
			<td>Aniline 13C6</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">3-Phosphoglyceric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8877</td>
			<td>3PG</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetic Acid</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>AC222140010</td>
			<td>ACE</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile, LCMS</td>
			<td>JT BAKER</td>
			<td>9829-03</td>
			<td>ACN</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetyl-coenzyme A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2056</td>
			<td>ACA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acquity UPLC BEH C18 1.7 &#956;M, 2.1 x 150 mm Column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186002353</td>
			<td>Column</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adenosine diphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2754</td>
			<td>ADP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adenosine monophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1752</td>
			<td>AMP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adenosine triphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td>ATP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alpha-ketoglutarate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1128</td>
			<td>aKG</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>251275</td>
			<td>CIT</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytidine diphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9755</td>
			<td>CDP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytidine monophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1006</td>
			<td>CMP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytidine triphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9274</td>
			<td>CTP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">D-glyceraldehyde 3-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>39705</td>
			<td>GAP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Erythrose 4-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E0377</td>
			<td>E4P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EX0276</td>
			<td>EtOH</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fisher Scientific accuSpin Micro 17 Centrifuge</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td></td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Flavin adenine dinucleotide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6625</td>
			<td>FAD</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fructose 1,6-bisphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6803</td>
			<td>F16P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fructose 6-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3627</td>
			<td>F6P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fumarate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8509</td>
			<td>FUM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gluconate 6-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7877</td>
			<td>6PG</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>GLC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose 6-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7879</td>
			<td>G6P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol 3-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7886</td>
			<td>Gly3P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Guanosine diphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7127</td>
			<td>GDP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Guanosine monophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8377</td>
			<td>GMP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Guanosine triphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td>GTP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258148</td>
			<td>HCl</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isocitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1252</td>
			<td>ICIT</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L1750</td>
			<td>LAC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Malate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>02288</td>
			<td>MAL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">myTXTL - Sigma 70 Master Mix Kit</td>
			<td>ArborBiosciences</td>
			<td>507024</td>
			<td>Cell-free protein synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N-(3-dimethylaminopropyl)-N&#8242;-ethylcarbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03449</td>
			<td>EDC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nicotinamide adenine dinucleotide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43410</td>
			<td>NAD</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N5755</td>
			<td>NADP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>481973</td>
			<td>NADPH</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nicotinamide adenine dinucleotide reduced</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N8129</td>
			<td>NADH</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Oxalacetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O4126</td>
			<td>OAA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphoenolpyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0564</td>
			<td>PEP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280</td>
			<td>PYR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ribose 5-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R7750</td>
			<td>R5P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ribulose 5-phosphate</td>
			<td>CarboSynth</td>
			<td>MR45852</td>
			<td>RL5P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sedoheptulose 7-phosphate</td>
			<td>CarboSynth</td>
			<td>MS07457</td>
			<td>S7P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Succinate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3674</td>
			<td>SUCC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tributylamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90780</td>
			<td>TBA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triethylamine</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>O4884</td>
			<td>TEA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ultrapure water</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>10977-015</td>
			<td>water</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Uridine diphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U4125</td>
			<td>UDP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Uridine monophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6375</td>
			<td>UMP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Uridine triphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6625</td>
			<td>UTP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">VWR Heavy Duty Vortex</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>Vortex</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Water, LCMS</td>
			<td>JT BAKER</td>
			<td>9831-03</td>
			<td>WATER</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters Acquity H UPLC Class Quaternary Solvent Manager</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>LCMS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters Acquity H UPLC Class Sample Manager FTN</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>LCMS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters Acquity Qda detector</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>LCMS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters Empower 3</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters LCMS Total Recovery Vial</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186000384c</td>
			<td>LCMS Vial</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

absolute quantification of cell-free protein synthesis metabolism by reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry

A síntese de proteínas livres de células (CFPS) é uma tecnologia emergente em sistemas e biologia sintética para a produção in vitro de proteínas. No entanto, se cfps vai ir além do laboratório e se tornar um padrão generalizado e apenas no tempo de fabricação de tecnologia, temos de compreender os limites de desempenho desses sistemas. Em relação a essa questão, desenvolvemos um protocolo robusto para quantificar 40 compostos envolvidos na glicolíse, a via de fosfato de pentose, o ciclo de ácido tricarboxílico, o metabolismo energético e a regeneração do cofator nas reações da CFPS. O método utiliza padrões internos marcados com 13C-aniline, enquanto os compostos na amostra são derivados com 12C-aniline. Os padrões internos e a amostra foram mistos e analisados por cromatografia líquida de fase invertida-espectrometria de massa (LC/MS). A co-elução de compostos eliminou a supressão de íons, permitindo a quantificação precisa de concentrações de metabolizados em 2-3 ordens de magnitude, onde o coeficiente de correlação média foi de 0,988. Cinco dos quarenta compostos não foram marcados com aniline, entretanto, foram detectados ainda na amostra de CFPS e quantificados com um método padrão da curva. A corrida cromatográfica leva aproximadamente 10 min para ser concluída. Em conjunto, desenvolvemos um método rápido e robusto para separar e quantificar com precisão 40 compostos envolvidos no CFPS em uma única execução lc/ms. O método é uma abordagem abrangente e precisa para caracterizar o metabolismo livre de células, de modo que, em última análise, podemos entender e melhorar o rendimento, produtividade e eficiência energética dos sistemas livres de células.

Como prova de conceito, usamos o protocolo para quantificar metabólitos em um sistema cfps baseado em E. coli expressando proteína fluorescente verde (GFP).  A reação do CFPS (14 μL) foi saciada e desproteinizada com etanol. A amostra cfps foi então marcada com 12C-aniline, enquanto os padrões foram marcados com 13C-aniline. A amostra e os padrões marcados foram então combinados e injetados no LC/MS (Figura 1). O protocolo detectou e quantificou 40 me...

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Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Aqui, apresentamos um protocolo robusto para quantificar 40 compostos envolvidos no metabolismo central de carbono e energia em reações de síntese de proteínas livres de células. A mistura de síntese livre de células é derivada com aniline para separação eficaz usando cromatografia líquida de fase invertida e, em seguida, quantificada pela espectrometria de massa usando padrões internos isotópicos rotulados.

Quantificação absoluta do metabolismo da síntese de proteínas livres de células por cromatografia líquida de fase reversa-espectrometria

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

A síntese de proteínas sem células é uma tecnologia emergente em sistemas e biologia sintética para a produção in vitro de proteínas. Os sistemas de síntese de proteínas livres de células não têm parede celular, portanto temos acesso direto a metabólitos. Neste protocolo, quantificamos as medidas absolutas de 40 metabólitos envolvidos no metabolismo central de carbono e energia, o que nos permite caracterizar o metabolismo livre de células.O protocolo conta com a metástase dos compostos com anilina, o que permite uma melhor separação e maior resolução de espectrometria de massa. Além disso, usamos padrões internos com uma isotópica que rotulamos anilina, para quantificação absoluta dos metabólitos. Os metabólitos marcados coelute, que elimina os efeitos da supressão de ferro.Permitindo a quantificação precisa dos compostos. Trabalhando em um capô, combine 550 microliters da anilina, com 337,5 microliters de água de grau LC-MS. E 112,5 microliters de 12 ácidos clorídricos molares em um tubo de centrífuga.Vortex bem, e armazene a solução de seis molar aniline em pH 4,5 e quatro graus Celsius. Para preparar uma solução de anilina de carbono molar de seis molares 13, em pH 4.5, combine 250 miligramas de anilina de carbono-13 com 132 microliters de água, e 44 microlitres de 12 ácidos clorídricos molares. Vórtice bem, e armazenar a quatro graus Celsius.Para preparar 200 miligramas por solução EDC mililitro, dissolva dois miligramas de EDC em 10 microliters de água para cada amostra a ser marcada. E vórtice bem. Para preparar amostras, sacie e precipitar as proteínas em uma reação de síntese proteica livre de células, adicionando um volume igual de 100% etanol gelado à reação de síntese livre de células.Centrifugar a amostra a 12.000 vezes g, por 15 minutos a quatro graus Celsius. Transfira o supernatante da amostra para um novo tubo de centrífuga. Para rotular a amostra com solução de anilina de carbono-12, transfira seis microlitadores da amostra para um novo tubo de centrífuga e leve o volume para 50 microliters com água.Adicione 5 microliters de 200 miligramas por solução EDC mililitro, misture bem a solução de anilina de carbono-12 e transfira 5 microliters para o tubo. Vórtice a reação com agitação suave por duas horas em temperatura ambiente. Depois de duas horas, remova os tubos do agitador e transfira-os para um capô de fumaça.Adicione 1,5 microlitadores de trietilamina a cada reação para parar a reação de marcação de anilina e estabilizar os compostos. Centrifugar a 13.500 vezes g por três minutos. E salve o supernatante.Para rotular as normas internas com solução anilina de carbono-13, diluir a solução de estoque interno para 80 micromolar com um volume final de 50 microliters. Adicione cinco microliters da solução EDC de 200 mililitros por mililitro, e cinco microliters da solução de anilina de carbono-13 bem misturada. Vórtice a reação com agitação suave por duas horas em temperatura ambiente.Após duas horas, remova os tubos do agitador e adicione 1,5 microlitadores de trietilamina à reação em um capô de fumaça. Centrifugar a 13.500 vezes g por três minutos e salvar o supernatante. Para adivinhar o padrão interno marcado, e a amostra marcada, misture 25 microliters de cada um em um frasco de autosampler.E analisar pelo procedimento LC-MS. Em seguida, para criar uma curva padrão para metabólitos não grampeados, primeiro, diluir a solução de estoque de metabólitos não grampeados para diferentes concentrações, com volume de 50 microliters. Adicione cinco microliters da solução EDC de 200 mililiteres e cinco microliters de solução de anilina de carbono-12 para cada concentração.Vórtice a reação com agitação suave por duas horas em temperatura ambiente. E prossiga com o tratamento de trietilamina. E centrifugação antes de analisar pela LC-MS como anteriormente.Após inicializar o LC-MS, de acordo com as instruções do fabricante, injete cinco microliters da amostra na coluna. E adquira as intensidades de íons m mais apropriadas para a amostra anilina de carbono-12. Então, injete cinco microliters da mesma amostra novamente.E adquirir o m sobre z intensidades de íons para os padrões de anilina de carbono-13 marcados. Neste protocolo, foram quantificados metabólitos que expressavam proteína fluorescente verde em uma síntese proteica sem células baseada em E.coli. 40 metabólitos envolvidos no metabolismo central de carbono e energia foram detectados e quantificados por meio de padrões internos.Enquanto uma curva padrão para cinco dos metabólitos que não foram marcados com anilina também foi desenvolvida. Os diversos metabólitos envolvidos nessas vias foram uma classe de açúcares fosfoilados, ácidos fosfo-carboxílicos, ácidos carboxílicos, nucleotídeos e cofatores. Além disso, o método possibilitou a separação de pares de isômeros estruturais, como fosfato de glicose-seis e fosfato de frutose-seis em uma única corrida LC-MS.O passo mais importante é rotular a amostra desem proteína com anilina. Uma vez que a solução anilina se separa, é importante trabalhar de forma rápida e eficaz, mantendo boas práticas de segurança. Este método ajuda a caracterizar o metabolismo livre de células com a quantificação de 40 metabólitos.Mas, compostos adicionais estão na mistura livre de células, como aminoácidos que podem ser quantificados. Isso ajudaria a fornecer um olhar mais abrangente sobre o metabolismo livre de células. Este método revelou que sistemas livres de células têm metabolismos complexos, ainda operando que podem ser potencialmente explorados para melhor eficiência energética e rendimento de carbono.O protocolo se baseia em marcar os compostos com anilina com o uso de EDC como catalisador. Ambos os reagentes são perigosos e devem ser usados com cautela.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

resolvida no tempo com ionização por electrospray Hidrogénio-deutério troca Espectrometria de Massa para estudar a estrutura e dinâmica das proteínas

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Bioquímica

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Resolver purificada por afinidade complexos de proteínas por Azul Native PAGE e Proteína Correlação Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

Uma abordagem baseada em Espectrometria Tandem Cromatografia Líquida de Massachusetts para análise de metabolitos de<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Proteome profunda de criação de perfil por isobárica rotulagem extensa cromatografia líquida, espectrometria de massa e quantificação assistida por Software

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Medição de alta sensibilidade de afinidades de ligação do fator-DNA transcrição por titulação do competidor usando microscopia de fluorescência

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Detecção de locais de ubiquitinação de proteínas por enriquecimento de peptídeos e espectrometria de massa

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Análise Quantitativa do Lipidome Celular de Saccharomyces Cerevisiae Usando Cromatografia Líquida Juntamente com Espectrometria de Massa de Tandem

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Criando sistemas de dimerização de proteínas quimicamente induzidas altamente específicos pela seleção de fagos de uma biblioteca de anticorpos de domínio único combinatorial

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Análise de metabolômica baseada em espectrometria líquida não direcionada

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...