Name: absolute quantification of cell-free protein synthesis metabolism by reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry
Uploaded: 2019-10-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry at JoVE.com

Açıklanan çalışma, Ulusal Kanser Enstitüsü'nden (https://www.cancer.gov/) 1U54CA210184-01 ödül numarası ile Kanser Metabolizması Fiziği Merkezi tarafından desteklenmiştir. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Kanser Enstitüsü'nün veya Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmemektedir. Fon layıcıların çalışma tasarımı, veri toplama ve analiz, makalenin yayımlama kararı veya hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.

1. Aniline etiketleme için reaktiflerin hazırlanması
<ol><li>pH 4.5'te 6 M aniline çözeltisi hazırlayın. Bir başlıkta çalışarak, 550 μL anilin il 337,5 l LCMS sınıfı su ve 112,5 μL 12 M hidroklorik asit (HCl) ile bir santrifüj tüpünde birleştirin. Girdap iyi ve 4 °C'de saklayın. NOT: Anilin 4 °C'de 2 ay saklanabilir. DİkKAT: Anilin son derece zehirlidir ve duman kaputunda çalışılmalıdır. Hidroklorik asit son derece aşındırıcıdır.</li>
	<li>pH 4.5'te 6 M 13C aniline ...

<ol>
	<li>Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthetic+biology:+thinking+outside+the+cell.">Cell-free synthetic biology: thinking outside the cell.</a> Metabolic Engineering. 14, 261-269 (2012).</li><li>Vilkhovoy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+specific+modeling+of+E.+coli+cell-free+protein+synthesis.">Sequence specific modeling of E. coli cell-free protein synthesis.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (8), 1844-1857 (2018).</li><li>Vilkhovoy, M., Minot, M., Varner, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+dynamic+models+of+metabolic+networks.">Effective dynamic models of metabolic networks.</a> IEEE Life Sciences Letters. 2 (4), 51-54 (2016).</li><li>Horvath, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+genome+scale+sequence+specific+dynamic+model+of+cell-free+protein+synthesis+in+Escherichia+coli.">Toward a genome scale sequence specific dynamic model of cell-free protein synthesis in Escherichia coli.</a> bioRxiv. , 215012 (2017).</li><li>Dettmer, K., Aronov, P. A., Hammock, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+metabolomics.">Mass spectrometry-based metabolomics.</a> Mass spectrometry reviews. 26 (1), 51-78 (2007).</li><li>Hajjaj, H., Blanc, P. J., Goma, G., Fran&#231;ois, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sampling+techniques+and+comparative+extraction+procedures+for+quantitative+determination+of+intra-+and+extracellular+metabolites+in+filamentous+fungi.">Sampling techniques and comparative extraction procedures for quantitative determination of intra- and extracellular metabolites in filamentous fungi.</a> FEMS Microbiology Letters. 164 (1), 195-200 (1998).</li><li>Ruijter, G. J. G., Visser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+intermediary+metabolites+in+Aspergillus+niger.">Determination of intermediary metabolites in Aspergillus niger.</a> Journal of Microbiological Methods. 25 (3), 295-302 (1996).</li><li>Mailinger, W., Baltes, M., Theobald, U., Reuss, M., Rizzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+metabolic+dynamics+in+Saccharomyces+cerevisiae:+I.+Experimental+observations.">In vivo analysis of metabolic dynamics in Saccharomyces cerevisiae: I. Experimental observations.</a> Biotechnology and Bioengineering. 55 (2), 305-316 (1997).</li><li>Dunn, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+appeal:+metabolite+identification+in+mass+spectrometry-focused+untargeted+metabolomics.">Mass appeal: metabolite identification in mass spectrometry-focused untargeted metabolomics.</a> Metabolomics. 9 (1), 44-66 (2013).</li><li>Huang, T., Toro, M., Lee, R., Hui, D. S., Edwards, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-functional+derivatization+of+amine,+hydroxyl,+and+carboxylate+groups+for+metabolomic+investigations+of+human+tissue+by+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Multi-functional derivatization of amine, hydroxyl, and carboxylate groups for metabolomic investigations of human tissue by electrospray ionization mass spectrometry.</a> Analyst. 143 (14), 3408-3414 (2018).</li><li>Huang, T., Armbruster, M. R., Coulton, J. B., Edwards, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+Tagging+in+Mass+Spectrometry+for+Systems+Biology.">Chemical Tagging in Mass Spectrometry for Systems Biology.</a> Analytical Chemistry. 91 (1), 109-125 (2019).</li><li>Yang, W. C., Sedlak, M., Regnier, F. E., Mosier, N., Ho, N., Adamec, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+quantification+of+metabolites+involved+in+central+carbon+and+energy+metabolism+using+reversed-phase+liquid+chromatography-mass+spectrometry+and+in+vitro+13C+labeling.">Simultaneous quantification of metabolites involved in central carbon and energy metabolism using reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry and in vitro 13C labeling.</a> Analytical Chemistry. 80 (24), 9508-9516 (2008).</li><li>Jannasch, A., Sedlak, M., Adamec, J., Metz, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Pentose+Phosphate+Pathway+(PPP)+Metabolites+by+Liquid+Chromatography-Mass+Spectrometry+(LC-MS).">Quantification of Pentose Phosphate Pathway (PPP) Metabolites by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS).</a> Metabolic Profiling. Methods in Molecular Biology 708 (Methods and Protocols). , 159-171 (2011).</li><li>Luo, B., Groenke, K., Takors, R., Wandrey, C., Oldiges, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+multiple+intracellular+metabolites+in+glycolysis,+pentose+phosphate+pathway,+and+tricarboxylic+acid+cycle+by+liquid+chromatography-mass+spectrometry.">Simultaneous determination of multiple intracellular metabolites in glycolysis, pentose phosphate pathway, and tricarboxylic acid cycle by liquid chromatography-mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography A. 1147 (2), 153-164 (2007).</li></ol>

Hücresiz sistemlerin hücre duvarı yoktur, bu nedenle karmaşık numune hazırlamaya gerek kalmadan metabolitlere ve biyosentetik makinelere doğrudan erişim vardır. Ancak, hücreiçermeyen reaksiyon sistemlerini nicel olarak sorgulamak için kapsamlı ve sağlam protokoller geliştirmek için çok az çalışma yapılmıştır. Bu çalışmada, hücresiz reaksiyon karışımlarında ve potansiyel olarak tüm hücre ekstrelerinde metabolitleri ölçmek için hızlı ve sağlam bir yöntem geliştirdik. Hücreiçermey...

Hücre içermeyen protein sentezi (CFPS), geleneksel olarak canlı hücreler için ayrılmış bir uygulama olan protein ve kimyasalların üretimi için umut verici bir platformdur. Hücre içermeyen sistemler ham hücre özlerinden türetilmiştir ve hücre büyümesi ile ilişkili komplikasyonları ortadan kaldırır1. Buna ek olarak, CFPS bir hücre duvarının müdahalesi olmadan metabolitleri ve biyosentetik makine doğrudan erişim sağlar. Ancak, hücresiz süreçlerin performans limitleri temel bir anlayış eksik olmuştur. Metabolit nicelliği için yüksek iş yapma yöntemleri metabolizmanın karakterizasyonu için değerlidir ve metabolik hesaplamalı modellerin2,3,4'ünyapımı için çok önemlidir. Metabolit konsantrasyonlarını belirlemek için kullanılan yaygın yöntemler nükleer manyetik rezonans (NMR), Fourier transform-kızılötesi spektroskopi (FT-IR), enzim bazlı tahliller ve kütle spektrometresi (MS)5,6,7 ,8. Ancak, bu yöntemler genellikle verimli bir kerede birden fazla bileşikleri ölçmek için onların yetersizlik ile sınırlıdır ve genellikle tipik hücre içermeyen reaksiyonlar daha büyük bir örnek boyutu gerektirir. Örneğin, enzim bazlı tahliller genellikle yalnızca bir çalışmada tek bir bileşiği ölçmek için kullanılabilir ve hücre içermeyen protein sentezreaksiyonları (genellikle 10-15 μL ölçekte çalıştırılır) gibi örnek boyutu küçük olduğunda sınırlıdır. Bu arada, NMR algılama ve nicelleştirme5için metabolitlerin yüksek bir bolluk gerektirir.  Bu eksikliklere doğru, kütle spektrometresi (LC/MS) ile birlikte kromatografi yöntemleri, yüksek duyarlılık ve aynı anda birden fazla türü ölçme yeteneği de dahil olmak üzere çeşitli avantajlar sağlar9; ancak, analitik karmaşıklık ölçülen türlerin sayısı ve çeşitliliği ile önemli ölçüde artmaktadır. Bu nedenle, LC/MS sistemlerinin yüksek iş verme potansiyelini tam olarak gerçekleştirecek yöntemler geliştirmek önemlidir. Numunedeki bileşikler sıvı kromatografi ile ayrılır ve kütle spektrometresi ile tanımlanır. Bileşiğin sinyali, iyonlaşmanın bileşikler arasında değişebileceği ve aynı zamanda numune matrisine de bağlı olabileceği konsantrasyon ve iyonizasyon verimliliğine bağlıdır.
Analizleri ölçmek için LC/MS kullanırken örnek ve standartlar arasında aynı iyonizasyon verimliliğini sağlamak zordur. Ayrıca, proton afinite ve polarite10sinyal bölünmesi ve heterojenite nedeniyle metabolit çeşitliliği ile nicel daha zor hale gelir. Son olarak, numunenin eş-eluting matris de bileşiklerin iyonizasyon verimliliğini etkileyebilir. Bu sorunları gidermek için, metabolitler kimyasal olarak türevlenebilir, LC/MS sistemleri tarafından ayırma çözünürlüğü ve hassasiyeti artırılarak, bazı durumlarda sinyal bölünmesi aynı anda azalırken10,11. Kimyasal türevleştirme, iyonizasyon verimliliğini artırmak için yük veya hidrofobiklik gibi fiziksel özelliklerini ayarlamak için belirli işlevsel metabolit gruplarını etiketleyerek çalışır11. Farklı fonksiyonel grupları (örneğin, aminler, hidroksiller, fosfatlar, karboksilik asitler vb.) hedeflemek için çeşitli etiketleme ajanları kullanılabilir. Anilin, böyle bir tür türtürasyon ajan, aynı anda birden fazla fonksiyonel grupları hedefler ve hidrofilik moleküller içine bir hidrofobik bileşen ekler, bu nedenle onların ayırma çözünürlüğü ve sinyal12artırarak. Birlikte eluting matris iyon bastırma etkisi ele almak için, Yang ve iş arkadaşları standart 13C anilin izotopları ile etiketlenir ve örnek ile karıştırılır Grup Özel İç Standart Teknolojisi (GSIST) etiketleme dayalı bir teknik geliştirdi 12,13. Metabolit ve buna karşılık gelen iç standart, birlikte elute beri aynı iyonlaşma verimliliğine sahip, ve onların yoğunluk oranı deneysel örnek konsantrasyonu ölçmek için kullanılabilir.
Bu çalışmada, CFPS reaksiyonlarında glikoliz, pentoz fosfat yolu, trikarboksilik asit döngüsü, enerji metabolizması ve kofaktör rejenerasyonu ile ilgili 40 bileşiğin saptanması ve ölçülmesi için bir protokol geliştirdik. Yöntem, ters fazLC/MS kullanarak metabolitleri etiketlemek, tespit etmek ve ölçmek için 12C-aniline ve 13C-aniline kullandığımız GSIST yaklaşımına dayanmaktadır. Tüm bileşiklerin doğrusal aralığı 0,988 ortalama korelasyon katsayısı ile 2-3 büyüklük sırasını kapsıyordu. Böylece, yöntem hücresiz metabolizma sorgulamak için sağlam ve doğru bir yaklaşımdır, ve muhtemelen bütün hücre özleri.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:665px;" width="665">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">12C Aniline</td>
			<td style="width:121px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">242284</td>
			<td style="width:167px;">Aniline 12C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">13C labeled aniline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>485797</td>
			<td>Aniline 13C6</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">3-Phosphoglyceric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8877</td>
			<td>3PG</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetic Acid</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>AC222140010</td>
			<td>ACE</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile, LCMS</td>
			<td>JT BAKER</td>
			<td>9829-03</td>
			<td>ACN</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetyl-coenzyme A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2056</td>
			<td>ACA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acquity UPLC BEH C18 1.7 &#956;M, 2.1 x 150 mm Column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186002353</td>
			<td>Column</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adenosine diphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2754</td>
			<td>ADP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adenosine monophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1752</td>
			<td>AMP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adenosine triphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td>ATP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alpha-ketoglutarate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1128</td>
			<td>aKG</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>251275</td>
			<td>CIT</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytidine diphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9755</td>
			<td>CDP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytidine monophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1006</td>
			<td>CMP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytidine triphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9274</td>
			<td>CTP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">D-glyceraldehyde 3-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>39705</td>
			<td>GAP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Erythrose 4-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E0377</td>
			<td>E4P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EX0276</td>
			<td>EtOH</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fisher Scientific accuSpin Micro 17 Centrifuge</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td></td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Flavin adenine dinucleotide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6625</td>
			<td>FAD</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fructose 1,6-bisphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6803</td>
			<td>F16P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fructose 6-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3627</td>
			<td>F6P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fumarate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8509</td>
			<td>FUM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gluconate 6-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7877</td>
			<td>6PG</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>GLC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose 6-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7879</td>
			<td>G6P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol 3-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7886</td>
			<td>Gly3P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Guanosine diphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7127</td>
			<td>GDP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Guanosine monophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8377</td>
			<td>GMP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Guanosine triphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td>GTP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258148</td>
			<td>HCl</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isocitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1252</td>
			<td>ICIT</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L1750</td>
			<td>LAC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Malate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>02288</td>
			<td>MAL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">myTXTL - Sigma 70 Master Mix Kit</td>
			<td>ArborBiosciences</td>
			<td>507024</td>
			<td>Cell-free protein synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N-(3-dimethylaminopropyl)-N&#8242;-ethylcarbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03449</td>
			<td>EDC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nicotinamide adenine dinucleotide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43410</td>
			<td>NAD</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N5755</td>
			<td>NADP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>481973</td>
			<td>NADPH</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nicotinamide adenine dinucleotide reduced</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N8129</td>
			<td>NADH</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Oxalacetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O4126</td>
			<td>OAA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphoenolpyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0564</td>
			<td>PEP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280</td>
			<td>PYR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ribose 5-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R7750</td>
			<td>R5P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ribulose 5-phosphate</td>
			<td>CarboSynth</td>
			<td>MR45852</td>
			<td>RL5P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sedoheptulose 7-phosphate</td>
			<td>CarboSynth</td>
			<td>MS07457</td>
			<td>S7P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Succinate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3674</td>
			<td>SUCC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tributylamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90780</td>
			<td>TBA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triethylamine</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>O4884</td>
			<td>TEA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ultrapure water</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>10977-015</td>
			<td>water</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Uridine diphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U4125</td>
			<td>UDP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Uridine monophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6375</td>
			<td>UMP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Uridine triphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6625</td>
			<td>UTP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">VWR Heavy Duty Vortex</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>Vortex</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Water, LCMS</td>
			<td>JT BAKER</td>
			<td>9831-03</td>
			<td>WATER</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters Acquity H UPLC Class Quaternary Solvent Manager</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>LCMS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters Acquity H UPLC Class Sample Manager FTN</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>LCMS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters Acquity Qda detector</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>LCMS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters Empower 3</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters LCMS Total Recovery Vial</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186000384c</td>
			<td>LCMS Vial</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

absolute quantification of cell-free protein synthesis metabolism by reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry

Hücresiz protein sentezi (CFPS), proteinlerin in vitro üretimi için sistemlerde ve sentetik biyolojide gelişen bir teknolojidir. Ancak, CFPS laboratuvar ötesine taşımak ve sadece zaman üretim teknolojisi yaygın ve standart haline gidiyor, biz bu sistemlerin performans sınırlarını anlamak gerekir. Bu soruya doğru, glikoliz, pentoz fosfat yolu, trikarboksilik asit döngüsü, enerji metabolizması ve CFPS reaksiyonlarında kofaktör rejenerasyonu ile ilgili 40 bileşiğin ölçülmesi için sağlam bir protokol geliştirdik. Yöntem, 13C-aniline ile etiketlenmiş dahili standartları kullanırken, örnekteki bileşikler 12C-aniline ile türevleştirilmiştir. İç standartlar ve örnek, ters fazlı sıvı kromatografi-kütle spektrometresi (LC/MS) ile karıştırılarak analiz edildi. Bileşiklerin birlikte elüsyonu iyon bastırma ortadan kaldırarak, ortalama korelasyon katsayısının 0.988 olduğu 2-3 büyüklük sırası üzerinde metabolit konsantrasyonlarının doğru nicelemesini sağladı. Kırk bileşiğin beşi anilin ile etiketlenmemiş, ancak CFPS örneğinde hala tespit edilmiş ve standart bir eğri yöntemi ile ölçüldü. Kromatografik koşunun tamamlanması yaklaşık 10 dakika sürer. Birlikte ele alındığında, tek bir LC/MS çalışmasında CFPS'de yer alan 40 bileşimi ayırmak ve doğru bir şekilde ölçmek için hızlı ve sağlam bir yöntem geliştirdik. Bu yöntem, hücresiz metabolizmayı karakterize etmek için kapsamlı ve doğru bir yaklaşımdır, böylece hücresiz sistemlerin verimini, üretkenliğini ve enerji verimliliğini anlayabilir ve geliştirebiliriz.

Kavram kanıtı olarak, yeşil floresan proteini (GFP) ifade eden E. coli tabanlı CFPS sistemindeki metabolitleri ölçmek için protokolü kullandık.  CFPS reaksiyonu (14 μL) söndürüldü ve etanol ile deproteinize edildi. CFPS örneği daha sonra 12C-aniline ile etiketlenirken, standartlar 13C-aniline ile etiketlendi. Etiketlenen örnek ve standartlar daha sonra birleştirildi ve LC/MS'ye enjekte edildi (Şekil 1). Protokol, iç standartlar kullanılara...

Watch this Scientific Journal Video about Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry at JoVE.com

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Burada, hücre siz protein sentezi reaksiyonlarında merkezi karbon ve enerji metabolizmasında yer alan 40 bileşiği ölçmek için sağlam bir protokol salıyoruz. Hücresiz sentez karışımı ters fazlı sıvı kromatografi kullanılarak etkili ayrıştırma için anilin ile türevize edilir ve daha sonra izotopik olarak etiketlenmiş iç standartlar kullanılarak kütle spektrometresi ile ölçülür.

Ters Faz Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi Ile Hücresiz Protein Sentezmetabolizmasının Mutlak Niceliği

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Hücresiz protein sentezi, proteinlerin in vitro üretimi için sistemlerde ve sentetik biyolojide gelişen bir teknolojidir. Hücresiz protein sentez sistemlerinin hücre duvarı yoktur, bu nedenle metabolitlere doğrudan erişebiliyoruz. Bu protokolde, merkezi karbon ve enerji metabolizmasında yer alan 40 metabolitin mutlak ölçümlerini ölçeriz, bu da hücresiz metabolizmayı karakterize etmemizi sağlar.Protokol, bileşiklerin aniline metastaz yapmasına dayanır, bu da daha iyi ayırma ve daha yüksek kütle spektrometresi çözünürlüğü sağlar. Buna ek olarak, metabolitlerin mutlak niceliği için aniline etiketli bir izotopik ile iç standartları kullanırız. Etiketli metabolitleri coelute, hangi demir bastırma etkilerini ortadan kaldırır.Bileşiklerin doğru niceliklenmesine izin verir. Bir başlık çalışma, anipin 550 mikrolitre birleştirmek, LC-MS sınıf su 337.5 mikrolitre ile. Ve 112.5 mikrolitre 12 molar hidroklorik asit bir santrifüj tüpünde.Girdap iyi, ve pH 4.5 ve dört derece santigrat altı azı lı aniline çözeltisi saklayın. Altı molar karbon-13 aniline çözeltisi hazırlamak için, pH 4.5, karbon-13 aniline 250 miligram su 132 mikrolitre ve 12 molar hidroklorik asit 44 mikrolitre birleştirir. Girdap iyi, ve dört santigrat derecede saklayın.Mililitre EDC çözeltisi başına 200 miligram hazırlamak için, etiketlenecek her numune için 10 mikrolitre suda iki miligram EDC çözün. Ve girdap iyi. Numunehazırlamak için, hücre içermeyen protein sentezreaksiyonundaki proteinleri söndürün ve çökeltin, hücresiz sentez reaksiyonuna eşit hacimde buz soğuğu %100 etanol ekleyerek.Numuneyi 12,000 kez g,4 derecede 15 dakika santrifüj edin. Numunenin süpernatantını yeni bir santrifüj tüpüne aktarın. Numuneyi karbon-12 anifin çözeltisi ile etiketlemek için, numunenin altı mikrolitresini yeni bir santrifüj tüpüne aktarın ve hacmi suyla birlikte 50 mikrolitreye getirin.Mililitre EDC çözeltisi başına 200 miligram 5 mikrolitre ekleyin, karbon-12 aniline çözeltisini iyice karıştırın ve tüpe 5 mikrolitre aktarın. Oda sıcaklığında iki saat boyunca hafifçe sallayarak reaksiyon girdap. İki saat sonra, shaker tüpleri çıkarın ve bir duman başlık içine aktarın.Anilin etiketleme reaksiyonu durdurmak ve bileşikleri stabilize etmek için her reaksiyona 1,5 mikrolitre triethylamamin ekleyin. Santrifüj 13, 500 kez g üç dakika. Ve süpernatant'ı kurtar.İç standartları karbon-13 aninin çözeltisi ile etiketlemek için, iç stok çözeltisini son hacmi 50 mikrolitre olan 80 mikromuza seyreltin. Mililitre EDC çözeltisi başına 200 miligram beş mikrolitre ve iyi karıştırılmış karbon-13 aniline çözeltisinin beş mikrolitresini ekleyin. Oda sıcaklığında iki saat boyunca hafifçe sallayarak reaksiyon girdap.İki saat sonra, shaker tüpleri çıkarın ve bir duman kaputunda reaksiyona triethylamamin 1.5 mikrolitre ekleyin. Santrifüj 13, 500 kez g üç dakika ve supernatant kaydedin. Etiketli dahili standardı ve etiketli örneği ilâhetmek için, her birinin 25 mikrolitresini bir otoörnekleyici şişede karıştırın.Ve LC-MS prosedürü ile analiz edin. Daha sonra, etiketlenmemiş metabolitler için standart bir eğri oluşturmak için, ilk olarak, 50 mikrolitre hacmi ile, farklı konsantrasyonlarda etiketsiz metabolitlerin stok çözeltisi seyreltmek. Her konsantrasyona mililitre EDC çözeltisi başına 200 miligram lık beş mikrolitre ve beş mikrolitre karbon-12 aniline çözeltisi ekleyin.Oda sıcaklığında iki saat boyunca hafifçe sallayarak reaksiyon girdap. Ve trietitamin tedavisine devam edin. Ve daha önce olduğu gibi LC-MS tarafından analiz önce santrifüj.LC-MS'yi aldıktan sonra, üreticinin talimatlarına göre, numunenin beş mikrolitresini kolona enjekte edin. Ve karbon-12 aniline etiketli örnek için z iyon yoğunlukları üzerinde uygun m elde. Sonra, aynı örnekten beş mikrolitre tekrar enjekte edin.Ve karbon-13 aniline etiketli standartları için z iyon yoğunlukları üzerinde m elde. Bu protokolde, E.coli tabanlı hücre içermeyen protein sentezinde yeşil floresan proteini ifade eden metabolitler ölçüldü. Merkezi karbon ve enerji metabolizmasında yer alan 40 metabolit iç standartlar kullanılarak tespit edildi ve ölçüldü.Anilin ile etiketlenmemiş metabolitlerin beşi için standart bir eğri de geliştirilmiştir. Bu yollarda yer alan çeşitli metabolitler fosforilasyonlu şekerler, fosfo-karboksilik asitler, karboksilik asitler, nükleotidler ve ko-faktörler sınıfıydı. Buna ek olarak, yöntem tek bir LC-MS çalışmasında glukoz-altı fosfat ve fruktoz-altı fosfat gibi yapısal izomer çiftlerinin ayrılmasını sağladı.En önemli adım de-proteinleşmiş örnek anin ile etiketleme olduğunu. Aniline çözüm ayrılır yana, iyi güvenlik uygulamaları korurken, hızlı ve etkili bir şekilde çalışmak önemlidir. Bu yöntem 40 metabolitin nicelliği ile hücresiz metabolizmayı karakterize etmeye yardımcı olur.Ama, ek bileşikler hücre içermeyen karışımı bulunmaktadır, bu sayısal olabilir amino asitler gibi. Bu hücresiz metabolizma içine daha kapsamlı bir görünüm sağlanmasında yardımcı olacaktır. Bu yöntem, hücresiz sistemlerin daha iyi enerji verimliliği ve karbon verimi için potansiyel olarak yararlanılabilen karmaşık metabolizmalara sahip olduğunu ortaya koymuştur.Protokol, bileşiklerin anilin ile etiketleetiketlep EDC'nin katalizör olarak kullanılmasına dayanır. Her iki reaktif tehlikelidir ve dikkatli kullanılmalıdır.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zaman çözülmesi elektro sprey iyonizasyon Hidrojen-döteryum Değişim Kütle Spektrometre Protein Yapısı ve Dinamikleri incelenmesi için

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

metabolit analizi için bir Tandem Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi tabanlı yaklaşım<em&gt; Stafilokok aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Derin Proteom izobarik etiketleme, kapsamlı sıvı Kromatografi, kütle spektrometresi ve yazılım destekli miktar tarafından profil oluşturma

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Transkripsiyon faktörü-DNA bağlayıcı Affinities floresans mikroskobu kullanarak rekabet titrasyon tarafından yüksek hassasiyet ölçümü

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Peptit Zenginleştirme ve Kütle Spektrometresi ile Protein Ubiquitinasyon Sitelerinin Saptanması

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Tandem Kütle Spektrometresi Ile Birleşen Sıvı Kromatografi kullanarak Saccharomyces Cerevisiae'nin Hücresel Lipidomukan Analizi

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Bir Kombinatoryal Tek Etki Alanı Antikor Kütüphanesi adım wise Faj Seçimi ile Son Derece Spesifik Kimyasal Kaynaklı Protein Dimerization Sistemleri Oluşturma

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Hedefsiz Sıvı Kromatografisi-Kütle Spektrometresi Tabanlı Metabolomik Buğday Tanesi Analizi

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...