Name: determination of immune cell identity and purity using epigenetic-based quantitative pcr
Uploaded: 2020-02-19T13:00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Immune Cell Identity and Purity Using Epigenetic-Based Quantitative PCR at JoVE.com

Projektet blev finansieret af Thermo Fisher Scientific Intramural tilskud.

Alle humane prøver blev indhentet fra en kommerciel kilde efter deres retningslinjer for human forskning etik.
1. Genomisk DNA-isolation
BEMÆRK: Genomisk DNA-isolation udføres ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt kit (se Materialetabel)fra alle hæmatopoietiske celler, såsom perifere blodmononukleare celler (PBPC'er), rensede T-celler eller enhver anden hæmatopoietisk celletype. I dette eksperiment blev der anvendt perifere mononukleare celler (PFC) og T-celler fra tre forskellige menneskelige donorer.
<ol><li>1-2 x 106 hæmatopoietiske celler i et konisk rør og centrifugeres ved 400 x g i 10 min.</li>
	<li>Aspirere supernatant helt.</li>
	<li>Der tilsættes 350 μL lysis/bindingsbuffer til prøven og inkuberingen i 10 min ved 55 °C.</li>
	<li>Der tilsættes 50 μL proteinase K (20 mg/ml) til 350 μL celleaffjedring og vortex i 30 s.</li>
	<li>Der tilsættes 50 μL DNA-bindende paramagnetiske perler og 400 μL 100% isopropanol og inkuber esitrere i 3 min ved stuetemperatur (RT).</li>
	<li>Placer røret på en magnetisk rack i 2 min og fjern supernatant, passe på ikke at forstyrre perlerne. DNA'et er bundet til de magnetiske perler på dette trin.</li>
	<li>Der tilsættes 950 μL vaskebuffer 1. Vortex for 30 s og gentag trin 1,6.</li>
	<li>Gentag trin 1.7.</li>
	<li>Der tilsættes 950 μL vaskebuffer 2. Vortex for 30 s og gentag trin 1,6.</li>
	<li>Tilsæt 100 μL elueringsbuffer og vortex i 2 min. Røret anbringes på en magnetisk stande i 1 min. og overfør supernatantet, der indeholder gDNA, til et nyt rør.</li>
	<li>Brug 1 μL af gDNA isoleret fra hæmatopoietiske celler til at måle renheden af gDNA ved spektrofotometri ved hjælp af et fluorimeter ved at opnå OD ved 260 nm, 280 nm og 230 nm. Sørg for, at forholdet mellem optisk tæthed (OD-forholdet) ved 260 og 280 nm er mellem 1,7-2,0, og OD-forholdet ved 260 og 230 nm er mellem 1,5-2,4.</li>
</ol>2. Prøveforberedelse
<ol><li>Forvarm en termomixer til 56 °C.</li>
	<li>Etiket 2 ml rør til alle prøver, kalibrator, og referencemateriale.</li>
	<li>Prøverne og kalibratoren fortyndes med elueringsbufferen (fås med det sæt, der anvendes til trin 1) på RT.<ol>
<li>For alle forsøgsprøver fortyndes gDNA'et til et samlet volumen på 142 μL. Fortyndes fortyndes fortyndes fortyndes 4 μL gDNA ved 100 ng/μL til 138 μL elueringsbuffer. BEMÆRK: 400-1.200 ng gDNA kan bruges til analysen.</li>
		<li>Fortyndes 75 μL af kalibratoren til et samlet volumen på 142 μL.</li>
		<li>Kontroller referencegDNA-koncentrationen med et spektrofotometer ved hjælp af TE (pH = 8.0) som tom.</li>
		<li>1.000-1.200 n af referencegDNA'et fortyndes til et samlet volumen på 142 μL. F.eks. fortyndes 10 μL referencegDNA ved 100 ng/μL til 132 μL elueringsbuffer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inkuberrørene ved 56 °C i 5 min ved 900 omdr./min. i en termomixer. Spin kort ned i rørene for at indsamle prøverne.</li>
</ol>3. Bisulfitkonvertering
BEMÆRK: Sørg for, at inkubationstiderne under bisulfitkonverteringen følger de anbefalede tidspunkter. Over-inkubation eller under-inkubation vil påvirke resultaterne af analysen.
<ol><li>Indstil en termomixer til 80 °C.</li>
	<li>Der tilsættes 270 μL ammoniumbisulfit og 90 μL tetrahydrofurfurylalkohol (THFA) til alle rørene. Vortex at blande helt og kort spin ned prøverne for at samle væsken i bunden.</li>
	<li>Inkuberrørene i en termomixer ved 80 °C i 45 min. ved 900 omdr./min. Hvis du bruger en varmeblok, vortex rørene i 1-2 s hver 4,5 min under inkubation.</li>
	<li>Spin kort prøverne ned og lad det køle af til RT i 3-5 minutter, før du fortsætter med trin 4 eller 5. Det endelige volumen skal være ~500 μL.</li>
</ol>4. CD8 og Treg analyser
<ol><li>DNA-rensning efter bisulfitkonvertering BEMÆRK: Dette trin udføres ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt DNA-rensesæt (se Materialetabel)på bisulfit-konverteret DNA. Sørg for, at reagenserne opvarmes til RT før brug.<ol>
<li>Før rensningen påbegyndes, skal du skabe en homogen blanding af DNA-isolationsparamagnetiske perler ved vortexing i 30 s. Tilsæt ethanol og isopropanol til vaskebufferne efter de mængder, der er anført på flaskerne, og sæt en varmeblok til 65 °C.</li>
		<li>Ved RT tilsættes 870 μL lysis/bindingsbuffer og 105 μL DNA-bindende paramagnetiske perler til hvert rør fra trin 3.4. Vortex at blande helt og kort spin ned rørene.</li>
		<li>Tilsæt 570 μL 2-propanol og vortex til at blande helt.</li>
		<li>Inkuberrørene på RT i 7 min ved 50 omdrejninger i en termomixer eller en standard roterende mixer.</li>
		<li>Spin kort ned i rørene. Placer rørene på den magnetiske rack og inkubere i 5 min.</li>
		<li>Med prøverne stadig på den magnetiske rack, fjerne supernatant uden at forstyrre perlerne. BEMÆRK: DNA'et er bundet til perlerne.</li>
		<li>Fjern rørene fra det magnetiske rack, og tilsæt 900 μL vaskebuffer 1. Vortex rørene til helt at resuspendere perlerne og derefter kort spin ned rørene.</li>
		<li>Sæt rørene tilbage til det magnetiske rack og inkuber esugei 3 min.</li>
		<li>Med prøverne stadig på den magnetiske rack, fjerne supernatant uden at forstyrre perlerne.</li>
		<li>Vaskene (4.1.7-4.1.9), én gang med vaskebuffer 1, derefter to gange med vaskebuffer 2.</li>
		<li>Efter fjernelse af supernatant, kort spin ned rørene og vende tilbage til den magnetiske rack i 3 min.</li>
		<li>Fjern al restvaskbuffer 2, og fjern rørene fra det magnetiske rack.</li>
		<li>De tørres med rørlågene åbne ved 65 °C i 15 min.</li>
		<li>Der tilsættes 60 μL elueringsbuffer til hvert rør og inkuberes ved RT i 7 min ved 1.400 omdrejninger i minuttet. Alternativt vortex ved en moderat hastighed ved hjælp af en skum adapter.</li>
		<li>Spin kort ned i rørene og placer på den magnetiske rack i 2 min.</li>
		<li>Overfør 55 μL eluat til et nyt rør uden at forstyrre perlerne. Eluatet indeholder det bisulfit-konverterede DNA. Det er ikke nødvendigt at måle DNA-koncentrationen.</li>
	</ol></li>
	<li>Konfigurere og køre qPCR<ol>
<li>Tænd qPCR-maskinen og den computer, der driver dens software.</li>
		<li>På softwarebrugergrænsefladen skal du oprette et nyt eksperiment og vælge, hvilken blok der bruges til at køre eksperimentet.</li>
		<li>Vælg Standardkurve som eksperimenttype.</li>
		<li>Hvis det er relevant, skal du vælge, hvilken detektionskemi du vil bruge. Denne analyse bruger TaqMan reagenser. Ellers skal du vælge ROX som passiv reference.</li>
		<li>Hvis det er relevant, skal du vælge egenskaberne for instrumentet køre som Standard.</li>
		<li>Definer dit eksperimentelle design ved at tildele mål (f.eks. GAPDH eller CD8 med FAM som reporter) og en ikke-fluorescerende quencher.</li>
		<li>Tildel eksempelnavne for standarder, eksempler og kontrolelementer.</li>
		<li>Dernæst tildele hver brønd position i henhold til qPCR plade. Hver brønd kræver et mål, f.eks. Hver prøve køres i treeksemplarer og skal afspejles på instrumentets pladelayout.</li>
		<li>Tildel hver standard opgavestandarden, og angiv de endelige kopinumre i henhold til tabel 1.</li>
		<li>Tildel eksempler, kalibrator, og reference opgaven Ukendt.</li>
		<li>Angiv brønde for ingen skabelonkontrolelement som NTC eller N.</li>
		<li>De serielle fortyndinger af lambda-DNA (10 ng/μL), der skal anvendes som standard (se tabel 1).</li>
		<li>Forbered qPCR master mix cocktails, en for målet celletype og en for GAPDH (se tabel 2). Kør alle prøver, standarder og NTC kontrol i treeksemplarer. BEMÆRK: GAPDH bruges til at kvantificere det samlede antal celler og køres parallelt med målforstærkningen. Kopier af umethylerede reguleringselementer til CD8 B-genet måles i CD8-analysen, FoxP3 i Treg og IL-17 i Th17.</li>
		<li>Brug en 96 brøndplade til qPCR. Læg 3 μL skabelon-DNA i brøndene først. Dernæst belastning 7 μL af master mix.</li>
		<li>Forsegle pladen med en qPCR film og kort spin ned pladen, før du placerer den i qPCR instrument.</li>
		<li>Kør qPCR som vist i tabel 3.</li>
		<li>Når kørslen er fuldført, skal du eksportere qPCR-dataene som en .txt- eller .xlsx-fil.</li>
		<li>Analysér dataene ved hjælp af analyseskabelonerne for CD8-analysen og Treg-analysen (se Materialetabel) for at beregne Ct-gennemsnittet, Ct-standardafvigelsen og kopinummeret.</li>
	</ol></li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Indledende plasmid kopinummer/3 μL</td>
			<td>Volumen</td>
			<td>Fortyndings-DNA [1]</td>
			<td>Endeligt kopinummer pr. 3 μL</td>
			<td>Etiket</td>
		</tr>
<tr>
<td>31250</td>
			<td>1000 μL</td>
			<td>-</td>
			<td>31250</td>
			<td>STD#1</td>
		</tr>
<tr>
<td>31250</td>
			<td>200 μL</td>
			<td>800 μL</td>
			<td>6250</td>
			<td>STD#2</td>
		</tr>
<tr>
<td>6250</td>
			<td>200 μL</td>
			<td>800 μL</td>
			<td>1250</td>
			<td>STD#3</td>
		</tr>
<tr>
<td>1250</td>
			<td>200 μL</td>
			<td>800 μL</td>
			<td>250</td>
			<td>STD#4</td>
		</tr>
<tr>
<td>250</td>
			<td>200 μL</td>
			<td>800 μL</td>
			<td>50</td>
			<td>STD#5</td>
		</tr>
<tr>
<td>1250</td>
			<td>30 μL</td>
			<td>1200 μL</td>
			<td>30</td>
			<td>STD#6 [2]</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">[1] 10 ng/μL Lambda DNA i TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">[2] Brug STD#3 til at forberede STD#6</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Forberedelse af standardfortyndinger. Der blev udarbejdet en fortyndingsstandarder på 4 log, der spænder over 31250-30-kopier, i henhold til tabellen ved hjælp af TE/lambda DNA som fortyndingsmiddel. De samme standardfortyndinger blev anvendt til både CD8 og GAPDH. Standarderne blev opbevaret ved -20 °C.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagenser</td>
			<td>Beløb</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lambda DNA (50 ng/μL i TE, pH8.0)</td>
			<td>1 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>TaqMan assay</td>
			<td>0,5 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Vand, Nuclease-fri</td>
			<td>0,5 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Master Mix</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Samlede</td>
			<td>7 μL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: Forberedelse af qPCR cocktail. Forbered qPCR master mix i to separate rør, en hver for CD8 og GAPDH, eksklusive skabelonen DNA i henhold til tabellen.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Trin</td>
			<td>Tid</td>
			<td>Temp</td>
			<td>Cykler</td>
		</tr>
<tr>
<td>Forinkubation</td>
			<td>35 min.</td>
			<td>95°C</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Forstærkning</td>
			<td>15 sek.</td>
			<td>95°C</td>
			<td rowspan="2">50X</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 min.</td>
			<td>61°C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cooldown</td>
			<td>5 sek.</td>
			<td>42°C</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 3: qPCR-kørselsparametre for CD8- og Treg-analysen. QPCR blev kørt i overensstemmelse med de parametre, der er angivet i tabellen.
5. Th17 analyse
<ol><li>DNA-rensning efter bisulfitkonvertering<ol>
<li>Udfør rensningstrinnene som beskrevet i afsnit 4.1.</li>
		<li>For at eute prøverne, tilsættes 25 μL eluering buffer til hvert rør og inkubere på RT i 7 min ved 1.400 rpm. Alternativt vortex ved en moderat hastighed ved hjælp af en skum adapter.</li>
		<li>Spin kort ned i rørene og placer på et magnetisk stativ i 2 minutter.</li>
		<li>Overfør 20 μL eluat til et nyt rør uden at forstyrre perlerne. Eluatet indeholder det bisulfit-konverterede DNA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>DNA forforstærker BEMÆRK: DNA forforstærker anbefales til lave mål for forekomst for nøjagtig kvantificering via qPCR19. Th17 methyleringsanalyse var designet til at kræve forforstærker af denne grund.<ol>
<li>Overfør 2 μL bisulfit-omdannet DNA til PCR-strimlen. Opret et NTC-rør med 2 μL vand.</li>
		<li>Opret forforstærkermasterblandingen for alle prøver (se tabel 4).</li>
		<li>Der tilsættes 23 μL af masterblandingen til hvert rør. Cap rørene, vortex, og kort spin ned rørene.</li>
		<li>Kør forforstærkerprotokollen på en termocykelr ved hjælp af et opvarmet låg. (Tabel 5). Når løbet er fuldført, skal du kort dreje rørene ned.</li>
		<li>Overfør 2 μL af det forstærkede DNA til nye rør og tilsæt 78 μL vand, fortynding prøverne 1:40.</li>
	</ol>
</li>
	<li>qPCR konfigurere og køre<ol>
<li>Følg afsnit 4.2 for at konfigurere og køre qPCR.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analysér data ved hjælp af analyseskabelonen for analysen Th17 (se Materialetabel) for at beregne Ct-gennemsnittet, Ct-standardafvigelsen og kopinummeret.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagens</td>
			<td>Beløb</td>
		</tr>
<tr>
<td>Vand, Nuclease-fri</td>
			<td>9,5 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hot Start PCR Master Mix</td>
			<td>12,5 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Th17 PCR Primer</td>
			<td>1 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Samlede</td>
			<td>23 μL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 4: Forforstærker DNA'et til Th17-analysen. Forforstærkningsreaktionsmasterblandingen blev udarbejdet i henhold til bordet.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Trin</td>
			<td>Tid</td>
			<td>Temp</td>
			<td>Cykler</td>
		</tr>
<tr>
<td>Forinkubation</td>
			<td>35 min.</td>
			<td>95°C</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
<tr>
<td>Denaturering</td>
			<td>1 min.</td>
			<td>95°C</td>
			<td rowspan="3">12X</td>
		</tr>
<tr>
<td>Udglødning</td>
			<td>45 sek.</td>
			<td>55°C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Forlængelse</td>
			<td>30 sek.</td>
			<td>72°C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Endelig forlængelse</td>
			<td>10 min.</td>
			<td>72°C</td>
			<td rowspan="2">1X</td>
		</tr>
<tr>
<td>Holde</td>
			<td>Ubestemt</td>
			<td>4°C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 5: Forforstærker Th17 DNA. Th17 DNA blev forforstærket i 12 cyklusser før den faktiske qPCR.

<ol>
	<li>Hartmann, J., Sch&#252;&#223;ler-Lenz, M., Bondanza, A., Buchholz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+development+of+CAR+T+cells-challenges+and+opportunities+in+translating+innovative+treatment+concepts.">Clinical development of CAR T cells-challenges and opportunities in translating innovative treatment concepts.</a> EMBO Molecular Medicine. 9, 1183-1197 (2017).</li><li>Graham, C., Jozwik, A., Pepper, A., Benjamin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allogeneic+CAR-T+Cells:+More+than+Ease+of+Access?.">Allogeneic CAR-T Cells: More than Ease of Access?.</a> Cells. 7, E155 (2018).</li><li>Turtle, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD19+CAR-T+cells+of+defined+CD4+:CD8++composition+in+adult+B+cell+ALL+patients.">CD19 CAR-T cells of defined CD4+:CD8+ composition in adult B cell ALL patients.</a> Journal of Clinical Investigation. 126, 2123-2138 (2016).</li><li>Akalin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Chimeric+Antigen+Receptor+(CAR)+Expression+on+Regulatory+T+Cells.">Effects of Chimeric Antigen Receptor (CAR) Expression on Regulatory T Cells.</a> Molecular Therapy. 17, S25 (2009).</li><li>Knochelmann, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T+Cells+in+Solid+Tumors:+Blueprints+for+Building+Effective+Therapies.">CAR T Cells in Solid Tumors: Blueprints for Building Effective Therapies.</a> Frontiers in Immunology. 9, (2018).</li><li>Chen, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T+cells+suppress+tumor-specific+CD8+T+cell+cytotoxicity+through+TGF-&#946;+signals+in+vivo.">Regulatory T cells suppress tumor-specific CD8 T cell cytotoxicity through TGF-&#946; signals in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 102, 419-424 (2005).</li><li>Muranski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-specific+Th17-polarized+cells+eradicate+large+established+melanoma.">Tumor-specific Th17-polarized cells eradicate large established melanoma.</a> Blood. 112, 362-373 (2008).</li><li>Majchrzak, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+IL-17-producing+CD4++and+CD8++T+cells+to+improve+cancer+immunotherapy+in+the+clinic.">Exploiting IL-17-producing CD4+ and CD8+ T cells to improve cancer immunotherapy in the clinic.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 65, 247-259 (2016).</li><li>Guedan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICOS-based+chimeric+antigen+receptors+program+bipolar+TH17/TH1+cells.">ICOS-based chimeric antigen receptors program bipolar TH17/TH1 cells.</a> Blood. 124, 1070-1080 (2014).</li><li>Vicetti Miguel, R. D., Maryak, S. A., Cherpes, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brefeldin+A,+but+not+monensin,+enables+flow+cytometric+detection+of+interleukin-4+within+peripheral+T+cells+responding+to+ex+vivo+stimulation+with+Chlamydia+trachomatis.">Brefeldin A, but not monensin, enables flow cytometric detection of interleukin-4 within peripheral T cells responding to ex vivo stimulation with Chlamydia trachomatis.</a> Journal of Immunological Methods. 384, 191-195 (2012).</li><li>Lovelace, P., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+Intracellular+Cytokine+Staining.">Multiparameter Intracellular Cytokine Staining.</a> Methods in Molecular Biology. 699, 165-178 (2011).</li><li>Presicce, P., Moreno-Fernandez, M. E., Lages, C. S., Orsborn, K. I., Chougnet, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+two+clones+allows+for+optimal+detection+of+human+FOXP3.">Association of two clones allows for optimal detection of human FOXP3.</a> Cytometry A. 77, 571-579 (2010).</li><li>Pach&#243;n, G., Caragol, I., Petriz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subjectivity+and+flow+cytometric+variability.">Subjectivity and flow cytometric variability.</a> Nature Reviews Immunology. 12, 396 (2012).</li><li>Westera, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrally+Determined+Standardization+of+Flow+Cytometry+Methods+Reduces+Interlaboratory+Variation+in+a+Prospective+Multicenter+Study.">Centrally Determined Standardization of Flow Cytometry Methods Reduces Interlaboratory Variation in a Prospective Multicenter Study.</a> Clinical and Translational Gastroenterology. 8, e126 (2017).</li><li>Baron, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+immune+cell+counting+in+human+blood+samples+for+immunodiagnostics.">Epigenetic immune cell counting in human blood samples for immunodiagnostics.</a> Science Translational Medicine. 10, (2018).</li><li>Kleen, T. O., Yuan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+real-time+PCR+assisted+cell+counting+(qPACC)+for+epigenetic+-+based+immune+cell+quantification+in+blood+and+tissue.">Quantitative real-time PCR assisted cell counting (qPACC) for epigenetic - based immune cell quantification in blood and tissue.</a> Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3, 46 (2015).</li><li>Rapko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+analysis+as+novel+tool+for+quality+control+in+regenerative+medicine.">DNA methylation analysis as novel tool for quality control in regenerative medicine.</a> Tissue Engineering. 13, 2271-2280 (2007).</li><li>Wieczorek, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+DNA+Methylation+Analysis+of+FOXP3+as+a+New+Method+for+Counting+Regulatory+T+Cells+in+Peripheral+Blood+and+Solid+Tissue.">Quantitative DNA Methylation Analysis of FOXP3 as a New Method for Counting Regulatory T Cells in Peripheral Blood and Solid Tissue.</a> Cancer Research. 69, 599-608 (2009).</li><li>Andersson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+targeted+preamplification+in+DNA+and+cDNA+quantification.">Properties of targeted preamplification in DNA and cDNA quantification.</a> Expert Review of Molecular Diagnosis. 15, 1085-1100 (2015).</li><li>Jung, T., Schauer, U., Heusser, C., Neumann, C., Rieger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+intracellular+cytokines+by+flow+cytometry.">Detection of intracellular cytokines by flow cytometry.</a> Journal of Immunological Methods. 159, 197-207 (1993).</li><li>Armbruster, D. A., Pry, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limit+of+Blank,+Limit+of+Detection+and+Limit+of+Quantitation.">Limit of Blank, Limit of Detection and Limit of Quantitation.</a> Clinical Biochemistry Reviews. 29, S49-S52 (2008).</li><li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+guidelines:+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 55, 611-622 (2009).</li><li>Li, Y., Tollefsbol, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+detection:+Bisulfite+genomic+sequencing+analysis.">DNA methylation detection: Bisulfite genomic sequencing analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 791, 11-21 (2011).</li><li>Warnecke, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+resolution+of+artifacts+in+bisulfite+sequencing.">Identification and resolution of artifacts in bisulfite sequencing.</a> Methods. 27, 101-107 (2002).</li><li>Genereux, D. P., Johnson, W. C., Burden, A. F., St&#246;ger, R., Laird, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Errors+in+the+bisulfite+conversion+of+DNA:+modulating+inappropriate-+and+failed-conversion+frequencies.">Errors in the bisulfite conversion of DNA: modulating inappropriate- and failed-conversion frequencies.</a> Nucleic Acids Research. 36, e150 (2008).</li><li>Darst, R. P., Pardo, C. E., Ai, L., Brown, K. D., Kladde, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisulfite+Sequencing+of+DNA.">Bisulfite Sequencing of DNA.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 91, 7.9.1-7.9.7 (2010).</li><li>Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+approach+to+RT-qPCR-Publishing+data+that+conform+to+the+MIQE+guidelines.">A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines.</a> Methods. 50, S1-S5 (2010).</li><li>Baron, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+demethylation+in+the+human+FOXP3+locus+discriminates+regulatory+T+cells+from+activated+FOXP3(+)+conventional+T+cells.">DNA demethylation in the human FOXP3 locus discriminates regulatory T cells from activated FOXP3(+) conventional T cells.</a> European Journal of Immunology. 37, 2378-2389 (2007).</li><li>Yao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+IL-17:+a+novel+cytokine+derived+from+T+cells.">Human IL-17: a novel cytokine derived from T cells.</a> Journal of Immunology. 155, 5483-5486 (1995).</li><li>Lockhart, E., Green, A. M., Flynn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-17+production+is+dominated+by+gammadelta+T+cells+rather+than+CD4+T+cells+during+Mycobacterium+tuberculosis+infection.">IL-17 production is dominated by gammadelta T cells rather than CD4 T cells during Mycobacterium tuberculosis infection.</a> Journal of Immunology. 177, 4662-4669 (2006).</li><li>Liang, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin+(IL)-22+and+IL-17+are+coexpressed+by+Th17+cells+and+cooperatively+enhance+expression+of+antimicrobial+peptides.">Interleukin (IL)-22 and IL-17 are coexpressed by Th17 cells and cooperatively enhance expression of antimicrobial peptides.</a> Journal of Experimental Medicine. 203, 2271-2279 (2006).</li><li>Olsen, I., Sollid, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pitfalls+in+determining+the+cytokine+profile+of+human+T+cells.">Pitfalls in determining the cytokine profile of human T cells.</a> Journal of Immunological Methods. 390, 106-112 (2013).</li></ol>

Suman K. Pradhan, Jerry Guzman, Carl Dargitz, Mark Landon og Uma Lakshmipathy er ansat af Thermo Fisher Scientific. Sven Olek, Bjoern Samans og Ulrich Hoffmueller er henholdsvis grundlægger og ansatte i virksomheden Epiontis. Der blev ikke brugt skriftlig hjælp til produktionen af dette manuskript.

Med fremkomsten af nye immunterapeutiske, der er behov for standardiserede metoder til at opdage immuncelle identitet og renhed. Vurderingsmetoder til in-process- og frigivelsestest, der er robuste, validerede og skalerbare, mangler at blive etableret og udgør en stor udfordring for kommercialiseringen af cellebaserede behandlinger. Mens flow cytometri er i øjeblikket den mest almindelige metode til immuncelle fænonopping, høj prøvekvalitet og mængde krav gør det vanskeligt for regelmæssig brug. Endvidere begrænses gennemførelsen af flowcytometri i et miljø med god fremstillingspraksis (GMP) af operatørafhængige gatingstrategier og kravet om referencestandarder for hver markør , der anvendes13,14. Selv om automatiseret gating har vist sig at forbedre analysen robusthed, er det endnu ikke en veletableret kvalitetskontrol strategi. Mens genekspression profilering også kan bruges til at karakterisere celleterapi produkt identitet og renhed, dataene er semikvantitative og arbejdskrævende. Derudover er RNA og microRNA relativt mindre stabile end DNA og kan bidrage til manglen på robuste og reproducerbare resultater. Således, udnytte epigenetiske DNA methylering status af en bestemt locus giver en stabil, nem at udføre, robust, og skalerbar metode til at identificere og kvantificere en celle type interesse.
Påvisning af methyleringsmønstre til fænotypeceller er afhængig af tre kritiske trin: For det første kræver analysen brug af gDNA, som isoleres efter de beskrevne metoder. Dna af høj kvalitet er påkrævet, og hvis det ikke anvendes, kan bisulfitomdannelse påvirkes23,24. Hvis der opnås DNA af lav kvalitet, anbefales yderligere rensning for at sikre analysens pålidelighed. For det andet er en vellykket bisulfit omdannelse af den umethylerede cytosin til uracil påkrævet. Det mest kritiske trin i bisulfitomdannelsen er DNA-denaturering23,25. Høj temperatur denaturering ved hjælp af ammonium bisulfit, i modsætning til natriumbisulfit, øger konvertering effektivitet og konsistens og er den anbefalede proces for disse analyser25,26. Brugerne skal sikre, at reaktionen sker ved 80 °C, og at prøveblandingen foretages hyppigt. Af disse grunde anbefales en digital termomixer (se Materialetabel). For det tredje skal korrekt pipetteringsteknik følges under qPCR-præparatet. Der kræves tre tekniske replikater under qPCR-reaktionen for at overholde minimumsoplysningerne for offentliggørelseaf kvantitative pcr-samarbejdsretningslinjer (Real-Time PCR). Det er acceptabelt, men ikke nødvendigt at medtage mere tekniske replikater. Forkert pipetteringsteknik og/eller ikke inklusive tekniske replikater vil føre til upålidelige qPCR-resultater.
Hvis de kritiske trin følges, og de ønskede resultater stadig ikke opnås, kan flere kontroller inden for analysen udnyttes til at lokalisere problemet. Korrekt bisulfit konvertering er det mest afgørende skridt i denne analyse. Forkert bisulfitkonvertering vil blive fremhævet af en mislykket kalibreringsfaktor og/eller referenceværdier beregnet af analyseskabelonen. Hvis bisulfitkonverteringen blev udført forkert (f.eks. hvis reaktionen blev udført på RT), ville der ikke være nogen forstærkning under qPCR. Der ville heller ikke blive set nogen forstærkning, hvis der blev begået en fejl under qPCR-reaktionsforberedelsen (f.eks. hvis qPCR-mastermixet ikke blev tilføjet). Disse to problemer kan adskilles ved at undersøge standardprøverne. Forstærkning i standardprøverne, men ikke reference-, kalibratoren og forsøgsprøverne, tyder på, at bisulfitomdannelsen ikke blev udført korrekt. Ingen forstærkning i nogen af prøverne tyder på, at qPCR ikke blev udført korrekt.
Mens denne analyse omhandler de strenge krav om prøve og analysevariation forbundet med andre fænonoponeringsmetoder, der specifikt flyder cytometri, er der begrænsninger, der skal bemærkes. Denne analyse er rettet mod en enkelt locus, der bruges som en entydig identifikator for målcellen, som forbyder multiplexed analyse, der er almindeligt udført med flow cytometri. Dette gør det vanskeligt at identificere komplekse celletyper som Th17. Brugen af methyleringsmønstre ved et enkelt locus har imidlertid vist sig at være en nøjagtig fænotypisk markør for flere celler og har været anvendt i flere kliniske forsøg15,16. Dette gælder især i Tregs, hvor vurdering foxp3 methylering signaturer er en nøjagtig og utvetydig metode til påvisning af sande Tregs fra forbigående FOXP3 udtrykke celler28. Tabet af multiplexed analyse opvejes af nøjagtigheden af loci afhørt. Fremtidige iterationer af analysen kunne omfatte flere qPCR farvestoffer og quenchers at give mulighed for påvisning af flere loci i en qPCR reaktion.
Denne analyse kan bruges som en alternativ metode til flow cytometri i bestemmelse af celle fænotype og identitet. Det skal bemærkes, at denne analyse ikke giver de nøjagtige værdier, som flow cytometri gør (Figur 1-3). Dette skyldes til dels variationen i dataanalyse i forbindelse med flowcytometri. Afhængigt af gating strategi, resultater fra flow cytometri kan variere betydeligt. Dette er især tilfældet, når du bruger komplekse farvningsprotokoller til at se på intracellulære mål, såsom IL-17, hvor variationskoefficienten (CV) kan være helt op til 15 %14. Mellem flere brugere, analysen præsenteret konsekvent havde et CV på <15%, støtte robusthed af analysen og forbedret standardisering kapaciteter. De største forskelle mellem epigenetisk og flow cytometri-baseret fænosotning ses, når cellestimulation er påkrævet (Figur 3). Påvisning af Th17-celler via flowcytometri blev udført ved hjælp af en fælles protokol for T-cellestimulering og intracellulær cytokinfarvning29,30,31. Forskellene i Th17 fænosod mellem epigenetisk måling og flow cytometri kunne skyldes kinetik il-17 produktion. Mens methyleringssignaturerne er stabile, tager proteinproduktionen tid og skal være til stede i tilstrækkelige mængder til at blive påvist ved fluorescerende antistoffer20,32. Det kan være nødvendigt at udvide den 6 timers inkubation med proteintransporthæmmer og cellestimuleringscocktail for at se niveauet af Th17-celler, der er påvist via epigenetiske-baserede fænosotningsmetoder. Flere undersøgelser er nødvendige for at bestemme den præcise årsag til, at værdierne ikke stemmer overens, og bestemmer den mest nøjagtige fænonoptosende metode.
I denne rapport beskriver vi, hvordan man identificerer og kvantificerer immuncelletyper i en heterogen blanding af celler på en enkel og robust måde. Analyserne er designet og optimeret til potentiel brug til in-process og release test af celle-baserede terapeutiske. De beskrevne analyser opfylder kravet om, at højt kvalificerede råvarer skal anvendes i celleterapi applikationer. Ved at afhjælpe manglerne ved flow cytometri og andre molekylære metoder såsom stabilitet, prøvekrav, forudgående stimulation, cellulær permeabilisering for intracellulær farvning, og subjektivitet dataanalyse, er de beskrevne analyser i overensstemmelse med målene om kommercialisering af cellebaserede behandlinger.

Brugen af T-celler i cellulære immunterapi er steget betydeligt i løbet af det sidste årti, især med fremkomsten af kimære antigen receptor (CAR) T celle teknologi1. Mens T celle-baserede behandlinger er blevet mødt med stor klinisk succes, de er heterogene og celle egenskaber og identiteter kan variere betydeligt mellem donorer2. Heterogeniteten af T-cellepopulationer kan have stor indvirkning på terapeutisk effekt og komplicere konklusioner fra kliniske forsøg. Af denne grund er det afgørende at forstå T celle heterogenitet under produktfremstilling og formulering til at bestemme de optimale formuleringer af T celle immunterapier.
I bred forstand kan T-celler opdeles i to grupper: CD4+ hjælpestoffer T-celler, som udskiller immunmodulerende cytokiner, og CD8+ cytotoksiske T-celler, som direkte lyseceller præsenterer cognate-antigenet på store histokompatibilitetskompleks (MHC) I molekyler. CD4+ hjælpemiddel T-celler kan differentiere sig til et utal af specifikke undersæt, der producerer et unikt sæt cytokiner. Nogle foreslår, at et defineret forhold mellem CD4+ og CD8+ T-celler i slutcelleproduktet maksimerer in vivo-effekten og vedholdenhed, men kan komplicere cellefremstilling3. Regulatoriske T-celler (Tregs), en delmængde af CD4 + T celler, er immunsuppressive og mindske aktiveringen af immunceller. Regulatorisk T-celler har været involveret i mægle tumor tolerance og, hvis de findes under CAR T celle fremstilling, kan hæmme antitumor immunrespons af CAR T celler4,5,6. Andre CD4 + undersæt såsom T hjælper 17 (Th17) T-celler fremme tumor clearance og kan udnyttes til at øge effekten af T celle behandlinger. Således, stigende Th17 CD4 + T celler er af særlig interesse i solid tumor indstillinger, hvor øget produktion af interleukin 17 (IL-17) fremmer antitumor immunrespons5,7,8,9. Forståelse af betydningen af Th17 celler i tumor reaktioner har fået mere undersøgelse af strategier til at generere disse celler in vitro7,9. Derfor er metoder til påvisning af disse T-celleundersæt afgørende for optimering af T-cellebehandlinger og bør være robuste, nemme, skalerbare og reproducerbare.
Flow cytometri er den mest almindelige metode til at bestemme identiteten af en immuncelle. Men flow cytometri kræver levende, intakte celler, der skal analyseres på samme dag, de høstes. For intracellulær cytokin farvning (ICS), protein sekresekretorhæmning er nødvendig for at bevare cytokiner i T-celler. Men, forskellige inhibitor forbindelser har forskellige virkninger på udskillelsen af specifikke cytokiner, tvinger brugerne til at skabe specialiserede cocktails til påvisning af cytokin af interesse10,11. Derudover er troskaben af flow cytometri afhængig af antistof kloner, der binder specifikt og potent til deres mål. Brugen af forskellige antistofkloner kan forårsage varierende resultater og føre til upræcise konklusioner, hvilket gør metoden vanskelig at standardisere12. Endvidere kan analysen af data indsamlet via flowcytometri og dermed konklusioner fra dataene variere meget fra brugere baseret på, hvordan porte sættes13,14. Af disse grunde er flow cytometri ikke ideel til præcis kvalitetskontrol under celleterapi udvikling.
Vurderingen af genomisk methylering ved specifikke genloci er en alternativ metode til bestemmelse af celleidentitet. Begrundelsen for at anvende DNA-methylering til at identificere specifikke celletyper er beskrevet i flere artikler og bygger på specifikke methyleringsmønstre i en given cellepopulation15,16,17. I målceller indeholder visse steder umethylerede nukleotider, mens disse steder i celler, der ikke er målarter, er methyleret. Dette mønster kan påvises gennem bisulfit konvertering, en proces, der udelukkende konverterer umethyleret cytosin nukleotider (C) til uracil (U). Primere og sonder kan designes mod de ombyggede steder, derefter forstærkes og detekteres gennem qPCR16.
Analysen beskrevet heri måler hyppigheden af immuncelle undertyper i heterogene populationer ved at kvantificere antallet af specifikke umethylerede loci sammenlignet med et husholdning gen. Kopier af de umethylerede reguleringselementer for CD8 B-genet måles i CD8-analysen, FoxP3 i Treg og IL-17 i Th17 i denne analyse. Disse loci blev identificeret ved at isolere den specifikke cellepopulation af interesse (f.eks. cd8+ T-celler) og udføre bisulfitsekventering for at identificere loci, der kun er methyleret i den pågældende celletype15. Primere og sonder udvikles mod den entydigt umethylerede loci og prøver analyseres via qPCR. Der oprettes en standardkurve med kendte kopinumre fra fortyndinger af en høj kopinummersstandardplasmid, hvilket giver mulighed for konvertering af en Ct-værdi til et udskriftskopinummer.
For at evaluere analysens ydeevne kræves der kontrolprøver, herunder en reference gDNA og en calibrator plasmid. Referencegenomic materiale er en samlet blodprøve fra flere donorer med kendte immuncellefrekvenser og bruges til en kvalitetskontrol (QC) analyse ydeevne kontrol. Kalibratorprøven er en syntetiseret plasmid, der indeholder CD8-, FoxP3- og GAPDH-gensekvenserne i et ækvimolarforhold. Det anvendes som et mål for bisulfitkonverteringseffektiviteten, fordi bisulfitkonverteringer inden for forskellige genomiske regioner vil variere i effektivitet. Forholdet mellem målet og GAPDH i kalibratoren er 1, men på grund af forskelle i bisulfitkonverteringseffektiviteten kan forholdet variere. Denne kalibreringsfaktor påføres CD8- og Treg-analyserne. FoxP3, genet, der anvendes i Treg assay, er placeret på X-kromosomet. Fordi denne analyse foranstaltninger kun umethylerede kopier af FoxP3, og kun én kopi af FoxP3 er umethyleret i Tregs, denne analyse er sex agnostiker og kan bruges med både mandlige og kvindelige prøver18. Th17-analysen anvender ikke en kalibratorprøve eller GAPDH som et rengøringsgen. I stedet medregnes et andet primersæt, der er rettet mod den methylerede loci, der findes i celler uden for Th17, og det samlede antal celler afspejles af summen af de methylerede og umethylerede kopier af IL-17. De data, der er hentet fra qPCR, indtastes i en forudindstillet analyseskabelon, der udfører kvalitetskontrol af dataene og beregner procentdelen af målcellen i startpopulationen. Dette giver automatiseret og upartisk dataanalyse, hvilket fjerner brugersubjektivitet og forbedrer standardiseringsfunktionerne.
Denne analyse bruger gDNA, som kan isoleres af en leukafomese procedure ved hjælp af dyrkede eller faste celler, eller frosne celle pellets. Det lave prøvekrav, fleksibilitet i prøveudgangsmaterialet, høj nøjagtighed og standardiseret analyse omhandler de begrænsninger, der er forbundet med flowcytometri, og er ideelle til kvalitetskontrol under udvikling af celleterapiprocesser.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.0 ml Eppendorf Safe-Lock Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis template for CD8 assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/CTSPureQuantCD8plusTCellAssayAnalysisTemplate.xlsx">Click Here</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis template for Th17 assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/CTSPureQuantTh17AssayAnalysisTemplate.xlsx">Click Here</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis template for Treg assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/CTSPureQuantTregAssayAnalysisTemplate.xlsx">Click Here</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer, blue/red/violet6/yellow</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A29004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS PureQuant CD8+ T-Cell Assay</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A43674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS PureQuant Th17 Assay</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A43676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS PureQuant Treg Assay</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A43675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads SILANE Genomic DNA Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>37012D</td>
			<td>Used for genomic DNA isolation and purification after bisulfite conversion. Contains elution buffer to dilute samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td>Used as a magnetic rack during DNA isolation and purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Essential Human T cell Phenotyping Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A42923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Essential Human Th1/Th17 Phenotyping Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A42927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Essential Human Treg Phenotyping Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A42925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf SmartBlock 2 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5362000035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HulaMixer Sample Mixer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15920D</td>
			<td>Recommended sample mixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND 1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>AM12450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12S Flex</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4470661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE, pH 8.0, RNase-free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H2KT17113</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of immune cell identity and purity using epigenetic-based quantitative pcr

Immuncelle subtype population frekvenser kan have en stor effekt på effekten af T celle behandlinger. Nuværende metoder, ligesom flow cytometri, har specifikke prøve krav, høj prøve input, er lav gennemløb, og er vanskelige at standardisere, som alle er skadelige for karakterisering af celleterapi produkter under deres udvikling og Fremstilling.
De analyser, der er beskrevet heri nøjagtigt identificere og kvantificere immuncelletyper i en heterogen blanding af celler ved hjælp af isoleret genomisk DNA (gDNA). DNA methylering mønstre afsløres gennem bisulfit konvertering, en proces, hvor umethylerede cytosiner omdannes til uracils. Umethylerede DNA-områder påvises ved qPCR forstærkning ved hjælp af primere rettet mod konverterede områder. Et entydigt locus pr. analyse måles og fungerer som en nøjagtig identifikator for en bestemt celletype. Analyserne er robuste og identificerer CD8+, regulatoriske og Th17 T-celler på en høj overførselsmåde. Disse optimerede analyser kan potentielt bruges til in-process og produkt frigivelse test for celleterapi proces.

Alle tre methyleringsanalyser begynder med et input af gDNA og resulterer i en procentdel af CD8+ T-celler, Treg eller Th17-celler i hele cellepopulationen. De data, der genereres fra qPCR efter bisulfitkonvertering, blev analyseret ved hjælp af den medfølgende analyseskabelon. Denne skabelon brugte de standardkurver, der blev hentet fra standardprøverne, til at estimere kopinummeret på målene og de samlede celletal i testprøverne. Celletypen procent blev derefter beregnet ved hjælp af de formler, der er integreret i analyseskabelonerne. Figur 1 viser repræsentative data fra CD8+ analysen, der er indhentet ved at analysere både perifere blodmononukleare celler (PBPC'er) og T-celler fra tre forskellige donorer ved hjælp af både flowcytometri og den beskrevne methyleringsanalyse. Tendenserne mellem de to metoder på tværs af alle donorer i begge celletyper var ens. Figur 2 viser repræsentative data fra Treg-analysen. Tre rensede Treg donorer blev analyseret ved hjælp af både methylering-baserede qPCR og flow cytometri og resultaterne blev plottet på grafen vist. Resultaterne for begge metoder var relativt ens. I alle tilfælde gav flowcytometri imidlertid højere værdier. Figur 3 viser sammenligningen af Th17-celler, der er påvist via flowcytometri og methylering. I denne graf er der stimulerede og ustimulerede betingelser for forsøgsmetoderne. Celler kræver stimulering med PMA og ionomycin og behandling med en proteintransporthæmmer for at øge mængden af IL-17A til stede i hver celle, så det kan påvises via flow cytometri20. Methyleringsstatus kan påvises uanset stimuleringsstatus. Flow cytometri gav lavere niveauer af Th17 celler sammenlignet med methylering. Analysens følsomhed og specificitet blev påvist ved grænsen af tomme (LOB), detektionsgrænse (LOD) og kvantitationsgrænsen (LOQ), der vises i tabel 6.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60465/60465fig1.jpg"> Figur 1: Sammenligning af flow og methylering af CD8+ procenter for både PBPC'er og T-celler for tre forskellige donorer. PbPC'er og T-celler fra tre forskellige donorer blev analysefor procentdelen af CD8 + T-celler i hele populationen ved hjælp af enten flow cytometri eller methylering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60465/60465fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60465/60465fig2.jpg"> Figur 2: Sammenligning af flow og methylering af Treg-procenter for renset Treg for tre forskellige donorer. Renset Treg celler blev assayed for den procentdel af Treg celler i hele befolkningen ved hjælp af enten flow cytometri eller methylering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60465/60465fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60465/60465fig3.jpg"> Figur 3: Sammenligning af flow og methylering af Th17-procentfor stimulerede og ustimulerede forsøgsgrupper. Stimuleret og ustimuleret T-celler blev analyseret ved hjælp af både flow cytometri og methylering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60465/60465fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Analyse</td>
			<td>Lob</td>
			<td>LoD (LoD)</td>
			<td>LoQ (LoQ)</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD8</td>
			<td>0</td>
			<td>19</td>
			<td>52</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gapdh delte et link.</td>
			<td>0</td>
			<td>7</td>
			<td>21</td>
		</tr>
<tr>
<td>FoxP3 delte et år.</td>
			<td>0</td>
			<td>3</td>
			<td>12</td>
		</tr>
<tr>
<td>Th17 TpG</td>
			<td>0</td>
			<td>35</td>
			<td>73</td>
		</tr>
<tr>
<td>Th17 CpG</td>
			<td>0</td>
			<td>38</td>
			<td>73</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 6: LoB, LoD, LoQ af kopinumre til methyleringsbaserede analyser. Analysens følsomhed og specificitet er beskrevet af værdierne LoB, LoD og LoQ, der er opnået ved MIQE-retningslinjerne21,22. Generelt kan så få som 40 eksemplarer præcist opdages af disse analyser.

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Immune Cell Identity and Purity Using Epigenetic-Based Quantitative PCR at JoVE.com

Determination of Immune Cell Identity and Purity Using Epigenetic-Based Quantitative PCR

Her beskriver vi en robust metode til bestemmelse af immuncelleidentitet og renhed gennem epigenetiske signaturer opdaget ved hjælp af kvantitative PCR (qPCR). DNA-demethylering ved et bestemt locus fungerer som en entydig identifikator for en bestemt celletype og giver mulighed for identifikation af CD8+, regulatoriske eller Th17 T-celler.

Bestemmelse af immuncelleidentitet og renhed ved hjælp af epigenetisk baseret kvantitativ PCR

Immune cell subtype population frequencies can have a large effect on the efficacy of T cell therapies. Current methods, like flow cytometry, have ...

Denne protokol tilbyder en standardiseret metode til bestemmelse af immuncelleidentitet og renhed og omhandler begrænsning af flowcytometri, f.eks. Denne analyse omfatter en automatiseret dataanalyse skabelon, som giver brugerne mulighed for at vurdere immuncelle identitet og renhed objektivt. Dette, sammen med de mange assay kontrol giver en nøglefærdig, let standardiseret metode til vurdering af immuncelle identitet og renhed.At demonstrere denne teknik vil være Jerry Guzman, en videnskabsmand i vores laboratorium. Efter genomisk DNA-isolering fra den hæmatopoietiske celleprøve af interesse anvendes en mikroliter af det genomiske DNA til at måle prøvens renhed på et spektrofotometer ved at opnå den optiske tæthed ved 260, 280 og 230 nanometer. Næste fortyndes 400 til 1200 nanogram genomisk DNA-prøve til et endeligt volumen af 142 mikroliter med elution buffer fra en genomisk DNA isolation kit.Der tilsættes 75 mikroliter af kalibratoren til 67 mikroliter af elueringsbuffer. Og fortyndes 1200 nanogram af referencegenomic DNA til et samlet volumen på 142 mikroliter med elution buffer. Derefter inkuberes rørene i fem minutter ved 56 grader Celsius og 900 omdrejninger i minuttet i en termisk mixer.Ved omdannelse af bisulfit tilsættes 270 mikroliter ammoniumbisulfit og 90 mikroliter THFA til alle rørene. Og vortex rørene for at sikre en grundig blanding. Drej kortvarigt prøverne for at opsamle væsken og læg rørene i den termiske mixer i 45 minutter ved 80 grader Celsius og 900 omdrejninger i minuttet.Drej derefter kortvarigt prøverne ned igen og lad dem køle af til stuetemperatur i tre til fem minutter. For DNA rensning efter bisulfit konvertering, vortex DNA isolation paramagnetiske perler i 30 sekunder. Der tilsættes ethanol og isopropanol til vaskepufferne i overensstemmelse med de mængder, der er anført på flaskerne.Vortex igen, indtil perlerne er helt resuspended og på 870 mikroliter af lysis bindende buffer og 105 mikroliter af DNA bindende paramagnetiske perler til hvert rør. Vortex rørene til at blande før kort spinning ned prøverne. Tilføj 570 mikroliter af 2-propanol til hvert rør og bland ved vortexing.Slangerne inkuberes i syv minutter ved stuetemperatur og 50 omdr./min., før rørene kortvarigt drejer ned og placerer dem på et magnetisk rist i fem minutter. I slutningen af inkubationen fjernes supersat uden at forstyrre perlerne. Prøven vaskes med buffer 1 og vortex rørene.Efter en kort centrifugering placere rørene tilbage i rack i tre minutter og fjerne supernate uden at forstyrre perlerne. Prøven vaskes to gange med vaskepude 2, og rørene tørres ved 65 grader Celsius i 15 minutter. Dernæst tilføje 60 microliters evolution buffer til hvert rør.Efter en syv minutters inkubation ved stuetemperatur og 1400 rotationer i minuttet, drej kortvarigt rørene ned og returnerer rørene til magneten i to minutter. Ved slutningen af inkubationen overføres 55 mikroliter af bisulfitten omregnet DNA, der indeholder til et nyt rør uden at forstyrre perlerne. Hvis du vil køre kvantitativ PCR på eksemplerne, skal du tildele hver standard opgavestandarden i den kvantitative PCR-software og angive de endelige kopinumre i henhold til tabellen.Forbered serielle fortyndinger af standard DNA og forberede en kvantitativ PCR master mix cocktail for målet celletype. Og en kvantitativ PCR master mix cocktail for GAPDH, ifølge bordet. Læg tre mikroliter af skabelon-DNA'et i de relevante brønde på en 96 godt afrundet bundplade efterfulgt af syv mikroliter af master mix.Når alle brøndene er blevet læsset forsegle pladen med kvantitative PCR film og kort dreje pladen, før du lægger den på den kvantitative PCR instrument. Kør derefter reaktionen som angivet i tabellen. Når kørslen er fuldført, skal du eksportere de kvantitative PCR-data som en txt- eller xlsx-fil.Efter rensning af bisulfit konverteret DNA med paramagnetiske beats som påvist, elute 25 mikroliter af DNA. Bisulfit omdannet DNA til et nyt rør og tilsæt to mikroliter af prøven i individuelle PCR striprør. Tilføj to mikroliter vand til en ingen skabelon kontrol rør og forberede forforstærkning master mix for alle prøverne i henhold til tabellen.Tilføj 23 mikroliter af master mix til hvert rør og hætte, vortex, og kort spin ned rørene. Kør derefter forforstærkningsprotokollen på en termocykrator ved hjælp af et opvarmet låg. Når løbet er afsluttet, drejer rørerne kortvarigt ned og overføres til mikroliter af det forstærkede DNA til nye rør.Derefter fortyndes prøverne med 78 mikro liter vand til en 1 til 40 koncentration og køre en kvantitativ PCR af prøverne som påvist. Her vises repræsentative data fra en CD8+T-celleanalyse fra analyse af både perifert blod, mononukleare celler og T-celler fra tre forskellige donorer, der bruger både flowcytometri og methyleringsanalyser. Tendenserne mellem de to metoder på tværs af alle donorer i begge celletyper var ens.Disse repræsentative data fra Treg-analysen viser også lignende resultater mellem metoderne. Men, i alle tilfælde, denne methylering assay gav højere værdier under både stimuleret og ustimuleret betingelser. Følsomheden og specificiteten af hver analyse blev påvist ved grænseværdien for tomhed, detektionsgrænse og mængdegrænseværdier.Da denne analyse tilbyder en automatiseret dataanalyseskabelon, forbedrer den objektiv analyse og øger standardiseringsfunktionerne. Dette er ideelt til celleterapi fremstilling, hvor standardiserede metoder er afgørende for at skabe en konsekvent celle terapi produkt.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Isolering af Funktionel Cardiac immunceller

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Intravital Imaging af Mouse Thymus med 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

Generering af lymfeknuder-fedt Pad kimærer for Studiet af lymfeknuder stromacelle Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Development and Validation of a Quantitative PCR Method for Equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

Udvikling og validering af en kvantitativ PCR Metode til hovdyrets herpesvirus-2 Diagnose i Respiratory Væsker

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Kvalitativ og kvantitativ analyse af den immun Synapse i det menneskelige System, ved hjælp af Imaging flowcytometri

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning

Kvantitativ PCR af T7 Bacteriophage fra Biopanning

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a ...

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

Bestemmelse af regulerende T celle Subsets i Murine Thymus, pancreas afdrypning lymfeknude og milten ved hjælp af flowcytometri

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

Vurdering af cellulære immunrespons i frugtflue Drosophila melanogaster, ved hjælp af en i Vivo fagocytose Assay

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are ...