Name: determination of immune cell identity and purity using epigenetic-based quantitative pcr
Uploaded: 2020-02-19T13:00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Immune Cell Identity and Purity Using Epigenetic-Based Quantitative PCR at JoVE.com

Проект финансировался за счет научного интрамурального гранта Thermo Fisher.

<ol>
	<li>Hartmann, J., Sch&#252;&#223;ler-Lenz, M., Bondanza, A., Buchholz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+development+of+CAR+T+cells-challenges+and+opportunities+in+translating+innovative+treatment+concepts.">Clinical development of CAR T cells-challenges and opportunities in translating innovative treatment concepts.</a> EMBO Molecular Medicine. 9, 1183-1197 (2017).</li><li>Graham, C., Jozwik, A., Pepper, A., Benjamin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allogeneic+CAR-T+Cells:+More+than+Ease+of+Access?.">Allogeneic CAR-T Cells: More than Ease of Access?.</a> Cells. 7, E155 (2018).</li><li>Turtle, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD19+CAR-T+cells+of+defined+CD4+:CD8++composition+in+adult+B+cell+ALL+patients.">CD19 CAR-T cells of defined CD4+:CD8+ composition in adult B cell ALL patients.</a> Journal of Clinical Investigation. 126, 2123-2138 (2016).</li><li>Akalin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Chimeric+Antigen+Receptor+(CAR)+Expression+on+Regulatory+T+Cells.">Effects of Chimeric Antigen Receptor (CAR) Expression on Regulatory T Cells.</a> Molecular Therapy. 17, S25 (2009).</li><li>Knochelmann, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T+Cells+in+Solid+Tumors:+Blueprints+for+Building+Effective+Therapies.">CAR T Cells in Solid Tumors: Blueprints for Building Effective Therapies.</a> Frontiers in Immunology. 9, (2018).</li><li>Chen, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T+cells+suppress+tumor-specific+CD8+T+cell+cytotoxicity+through+TGF-&#946;+signals+in+vivo.">Regulatory T cells suppress tumor-specific CD8 T cell cytotoxicity through TGF-&#946; signals in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 102, 419-424 (2005).</li><li>Muranski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-specific+Th17-polarized+cells+eradicate+large+established+melanoma.">Tumor-specific Th17-polarized cells eradicate large established melanoma.</a> Blood. 112, 362-373 (2008).</li><li>Majchrzak, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+IL-17-producing+CD4++and+CD8++T+cells+to+improve+cancer+immunotherapy+in+the+clinic.">Exploiting IL-17-producing CD4+ and CD8+ T cells to improve cancer immunotherapy in the clinic.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 65, 247-259 (2016).</li><li>Guedan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICOS-based+chimeric+antigen+receptors+program+bipolar+TH17/TH1+cells.">ICOS-based chimeric antigen receptors program bipolar TH17/TH1 cells.</a> Blood. 124, 1070-1080 (2014).</li><li>Vicetti Miguel, R. D., Maryak, S. A., Cherpes, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brefeldin+A,+but+not+monensin,+enables+flow+cytometric+detection+of+interleukin-4+within+peripheral+T+cells+responding+to+ex+vivo+stimulation+with+Chlamydia+trachomatis.">Brefeldin A, but not monensin, enables flow cytometric detection of interleukin-4 within peripheral T cells responding to ex vivo stimulation with Chlamydia trachomatis.</a> Journal of Immunological Methods. 384, 191-195 (2012).</li><li>Lovelace, P., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+Intracellular+Cytokine+Staining.">Multiparameter Intracellular Cytokine Staining.</a> Methods in Molecular Biology. 699, 165-178 (2011).</li><li>Presicce, P., Moreno-Fernandez, M. E., Lages, C. S., Orsborn, K. I., Chougnet, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+two+clones+allows+for+optimal+detection+of+human+FOXP3.">Association of two clones allows for optimal detection of human FOXP3.</a> Cytometry A. 77, 571-579 (2010).</li><li>Pach&#243;n, G., Caragol, I., Petriz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subjectivity+and+flow+cytometric+variability.">Subjectivity and flow cytometric variability.</a> Nature Reviews Immunology. 12, 396 (2012).</li><li>Westera, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrally+Determined+Standardization+of+Flow+Cytometry+Methods+Reduces+Interlaboratory+Variation+in+a+Prospective+Multicenter+Study.">Centrally Determined Standardization of Flow Cytometry Methods Reduces Interlaboratory Variation in a Prospective Multicenter Study.</a> Clinical and Translational Gastroenterology. 8, e126 (2017).</li><li>Baron, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+immune+cell+counting+in+human+blood+samples+for+immunodiagnostics.">Epigenetic immune cell counting in human blood samples for immunodiagnostics.</a> Science Translational Medicine. 10, (2018).</li><li>Kleen, T. O., Yuan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+real-time+PCR+assisted+cell+counting+(qPACC)+for+epigenetic+-+based+immune+cell+quantification+in+blood+and+tissue.">Quantitative real-time PCR assisted cell counting (qPACC) for epigenetic - based immune cell quantification in blood and tissue.</a> Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3, 46 (2015).</li><li>Rapko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+analysis+as+novel+tool+for+quality+control+in+regenerative+medicine.">DNA methylation analysis as novel tool for quality control in regenerative medicine.</a> Tissue Engineering. 13, 2271-2280 (2007).</li><li>Wieczorek, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+DNA+Methylation+Analysis+of+FOXP3+as+a+New+Method+for+Counting+Regulatory+T+Cells+in+Peripheral+Blood+and+Solid+Tissue.">Quantitative DNA Methylation Analysis of FOXP3 as a New Method for Counting Regulatory T Cells in Peripheral Blood and Solid Tissue.</a> Cancer Research. 69, 599-608 (2009).</li><li>Andersson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+targeted+preamplification+in+DNA+and+cDNA+quantification.">Properties of targeted preamplification in DNA and cDNA quantification.</a> Expert Review of Molecular Diagnosis. 15, 1085-1100 (2015).</li><li>Jung, T., Schauer, U., Heusser, C., Neumann, C., Rieger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+intracellular+cytokines+by+flow+cytometry.">Detection of intracellular cytokines by flow cytometry.</a> Journal of Immunological Methods. 159, 197-207 (1993).</li><li>Armbruster, D. A., Pry, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limit+of+Blank,+Limit+of+Detection+and+Limit+of+Quantitation.">Limit of Blank, Limit of Detection and Limit of Quantitation.</a> Clinical Biochemistry Reviews. 29, S49-S52 (2008).</li><li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+guidelines:+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 55, 611-622 (2009).</li><li>Li, Y., Tollefsbol, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+detection:+Bisulfite+genomic+sequencing+analysis.">DNA methylation detection: Bisulfite genomic sequencing analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 791, 11-21 (2011).</li><li>Warnecke, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+resolution+of+artifacts+in+bisulfite+sequencing.">Identification and resolution of artifacts in bisulfite sequencing.</a> Methods. 27, 101-107 (2002).</li><li>Genereux, D. P., Johnson, W. C., Burden, A. F., St&#246;ger, R., Laird, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Errors+in+the+bisulfite+conversion+of+DNA:+modulating+inappropriate-+and+failed-conversion+frequencies.">Errors in the bisulfite conversion of DNA: modulating inappropriate- and failed-conversion frequencies.</a> Nucleic Acids Research. 36, e150 (2008).</li><li>Darst, R. P., Pardo, C. E., Ai, L., Brown, K. D., Kladde, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisulfite+Sequencing+of+DNA.">Bisulfite Sequencing of DNA.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 91, 7.9.1-7.9.7 (2010).</li><li>Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+approach+to+RT-qPCR-Publishing+data+that+conform+to+the+MIQE+guidelines.">A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines.</a> Methods. 50, S1-S5 (2010).</li><li>Baron, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+demethylation+in+the+human+FOXP3+locus+discriminates+regulatory+T+cells+from+activated+FOXP3(+)+conventional+T+cells.">DNA demethylation in the human FOXP3 locus discriminates regulatory T cells from activated FOXP3(+) conventional T cells.</a> European Journal of Immunology. 37, 2378-2389 (2007).</li><li>Yao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+IL-17:+a+novel+cytokine+derived+from+T+cells.">Human IL-17: a novel cytokine derived from T cells.</a> Journal of Immunology. 155, 5483-5486 (1995).</li><li>Lockhart, E., Green, A. M., Flynn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-17+production+is+dominated+by+gammadelta+T+cells+rather+than+CD4+T+cells+during+Mycobacterium+tuberculosis+infection.">IL-17 production is dominated by gammadelta T cells rather than CD4 T cells during Mycobacterium tuberculosis infection.</a> Journal of Immunology. 177, 4662-4669 (2006).</li><li>Liang, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin+(IL)-22+and+IL-17+are+coexpressed+by+Th17+cells+and+cooperatively+enhance+expression+of+antimicrobial+peptides.">Interleukin (IL)-22 and IL-17 are coexpressed by Th17 cells and cooperatively enhance expression of antimicrobial peptides.</a> Journal of Experimental Medicine. 203, 2271-2279 (2006).</li><li>Olsen, I., Sollid, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pitfalls+in+determining+the+cytokine+profile+of+human+T+cells.">Pitfalls in determining the cytokine profile of human T cells.</a> Journal of Immunological Methods. 390, 106-112 (2013).</li></ol>

Суман К. Прадхан, Джерри Гузман, Карл Даргиц, Марк Лэндон и Ума Лакшмипати работают в Thermo Fisher Scientific. Свен Олек, Бьорн Саманс и Ульрих Хоффмюллер являются учредителями и сотрудниками компании Epiontis, соответственно. При производстве этой рукописи не использовалась помощь в написании.

С появлением новых иммунотерапевтических препаратов, существует необходимость в стандартизированных методах обнаружения иммунной идентичности клеток и чистоты. Методы оценки для тестирования в процессе и выпуске, которые являются надежными, проверенными и масштабируемыми, еще предстоит установить и создать серьезную проблему для коммерциализации клеточных методов лечения. В то время как цитометрия потока в настоящее время является наиболее распространенным методом фенотипирования иммунных клеток, высокое качество образца и требования к количеству затрудняют регулярное использование. Кроме того, внедрение цитометрии потока в хорошую производственную практику (GMP) среды ограничивается оператором зависимых стратегий gating и требование эталонных стандартов для каждого маркера используется13,14. Хотя было показано, что автоматизированная gating улучшает надежность анализа, она еще не является хорошо отлаженной стратегией контроля качества. В то время как профилирование экспрессии генов может также использоваться для характеристики идентичности продукта клеточной терапии и чистоты, данные являются полуколичественными и трудоемкими. Кроме того, РНК и микроРНК относительно менее стабильны, чем ДНК, и могут способствовать отсутствию надежных и воспроизводимых результатов. Таким образом, использование эпигенетического состояния метилирования ДНК конкретного локуса обеспечивает стабильный, простой в исполнении, надежный и масштабируемый метод выявления и количественной оценки клеточного типа интереса.
Обнаружение метиловых моделей для клеток фенотипа опирается на три критических шага: Во-первых, анализ требует использования гДНК, которая изолирована в соответствии с описанными методами. Высокое качество ДНК требуется, и если не используется, бисульфит преобразования могут быть затронуты23,24. При получении ДНК низкого качества рекомендуется дальнейшая очистка для обеспечения надежности анализа. Во-вторых, требуется успешное превращение бисульфита неметилированный цитозин в урацил. Наиболее важным шагом в преобразовании бисульфита является денатурация ДНК23,25. Высокая температура денатурации с использованием бисульфита аммония, в отличие от бисульфита натрия, повышает эффективность преобразования и консистенции и является рекомендуемым процессом для этих анализов25,26. Пользователи должны убедиться, что реакция происходит при 80 градусах Цельсия и что смешивание образцов выполняется часто. По этим причинам рекомендуется цифровой термомиксер (см. Таблицу материалов). В-третьих, при подготовке qPCR необходимо соблюдать надлежащий метод трубачирования. Три технических репликаций требуется во время реакции qPCR придерживаться минимальной информации для публикации количественных экспериментов PCR в реальном времени (MI'E) руководящие принципы27. Включение большего количества технических повторов является приемлемым, но не обязательным. Неправильный метод трубачирования и/или неведомость технических репликаций приведет к ненадежным результатам qPCR.
Если критические шаги выполняются и желаемые результаты все еще не получены, несколько элементов управления в рамках проверки могут быть использованы для выявления проблемы. Правильное преобразование бисульфита является наиболее важным шагом в этом анализе. Неправильное преобразование бисульфита будет выделено неудавшимся фактором калибровки и/или эталонными значениями, рассчитанными шаблоном анализа. Если бы конверсия бисульфита была выполнена неправильно (например, если бы реакция была проведена на RT), не было бы усиления во время qPCR. Кроме того, не будет замечено усиления, если ошибка была допущена во время подготовки к реакции qPCR (например, если не была добавлена мастер-микс qPCR). Эти две проблемы могут быть разделены путем изучения стандартных образцов. Усиление в стандартных образцах, но не в эталонных, калибраторных и экспериментальных образцах, указывает на то, что преобразование бисульфита было выполнено неправильно. Никакое усиление ни в одном из образцов не указывает на то, что qPCR был выполнен неправильно.
Хотя этот анализ касается строгих требований к выборке и изменчивости анализа, связанной с другими методами фенотипирования, в частности цитометрией потока, существуют ограничения, которые необходимо отметить. Этот анализ нацелен на один локус, который используется в качестве уникального идентификатора для целевой ячейки, который запрещает мультиплексный анализ, который обычно выполняется с цитометрией потока. Это затрудняет выявление сложных типов клеток, таких как Th17. Тем не менее, использование метилирования моделей на одном локусе было показано, что точный фенотипический маркер нескольких клеток и был использован в нескольких клинических испытаниях15,16. Это верно, особенно в Tregs, где оценка FOXP3 метилирования подписей является точным и недвусмысленным методом для обнаружения истинных Tregs от переходно FOXP3 выражения клеток28. Потеря мультиплексного анализа компенсируется точностью опрошенных локусов. Будущие итерации ассея могут включать в себя несколько красителей qPCR и утолятелей, чтобы обеспечить обнаружение нескольких локутов в одной реакции qPCR.
Этот ассеможно использовать в качестве альтернативного метода цитометрии потока при определении фенотипа и идентичности клеток. Следует отметить, что этот процесс не дает точных значений, которые поток цитометрии делает(Рисунки 1-3). Отчасти это объясняется изменчивостью анализа данных, связанной с цитометрией потока. В зависимости от стратегии gating, результаты от цитометрии потока могут значительно варьироваться. Это особенно актуально при использовании сложных протоколов окрашивания для изучения внутриклеточных целей, таких как Ил-17, где коэффициент вариации (CV) может достигать 15%14. Между несколькими пользователями, ассс, представленный последовательно, было резюме в размере 15%, поддерживая надежность асссея и улучшенные возможности стандартизации. Наибольшие различия между эпигенетической и потока цитометрии на основе фенотипирования наблюдается, когда стимуляция клеток требуется(Рисунок 3). Обнаружение т17 клеток с помощью цитометрии потока было достигнуто с помощью общего протокола для стимуляции Т-клеток и внутриклеточного цитокина окрашивания29,30,31. Различия, наблюдаемые в th17 фенотипии между эпигенетической измерения и цитометрии потока может быть связано с кинетикой производства IL-17. В то время как метилированные сигнатуры являются устойчивыми, производство белка требует времени и должно присутствовать в достаточном количестве, чтобы быть обнаружены флуоресцентными антителами20,32. Инкубация 6 ч с ингибитором переноса белка и коктейлем стимуляции клеток, возможно, потребуется расширить, чтобы увидеть уровень клеток Th17, обнаруженных с помощью эпигенетических методов фенотипирования. Необходимы дополнительные исследования, чтобы определить точную причину, почему значения не совпадают, и определить наиболее точный метод фенотипирования.
В этом отчете мы подробно описываем и количественно определяем типы иммунных клеток в разнородной смеси клеток простым и надежным способом. Анализы разработаны и оптимизированы для потенциального использования для в процессе и выпустить тестирование клеточной терапии. Описанные анализы отвечают требованиям для высококвалифицированного сырья, которые будут использоваться в приложениях клеточной терапии. Устранив недостатки цитометрии потока и других молекулярных методов, таких как стабильность, требования к выборке, предварительная стимуляция, клеточная пермяковость для внутриклеточного окрашивания и субъективность анализа данных, описанные анализы находятся в соответствии с целями коммерциализации клеточной терапии.

Использование Т-клеток в клеточной иммунотерапии значительно возросло за последнее десятилетие, особенно с появлением химерных рецепторов антигена (CAR) Т-клеток технологии1. В то время как Т-клеточная терапия была встречена с большим клиническим успехом, они неоднородны и клеточные характеристики и идентичности могут значительно варьироваться между донорами2. Неоднородность популяций Т-клеток может оказывать значительное влияние на терапевтическую эффективность и усложнять выводы клинических испытаний. По этой причине, очень важно понять неоднородность Т-клеток во время производства продукта и разработки для определения оптимальных формулировок иммунотерапии Т-клеток.
В широком смысле, Т-клетки могут быть разделены на две группы: CD4 "помощник Т-клеток, которые выделяют иммуномодулирующие цитокины, и CD8" цитотоксических Т-клеток, которые непосредственно лизать клетки, представляющие коньяк антигена на основных комплекс гистосовместимости (MHC) I молекул. CD4 "помощник Т-клетки могут дифференцироваться в множество конкретных подмножеств, которые производят уникальный набор цитокинов. Некоторые предполагают, что определенное соотношение CD4 "к CD8" Т-клеток в конечных клеток продукта максимизировать эффективность и настойчивость vivo, но может осложнить производство клеток3. Регуляторные Т-клетки (Tregs), подмножество CD4 "Т-клеток, являются иммуносупрессивными и уменьшают активацию иммунных клеток. Регуляторные Т-клетки были вовлечены в посредничество толерантности к опухоли и, если присутствует во время производства Т-клеток CAR, может ингибировать противоопухолевый иммунный ответ CAR Т-клеток4,5,6. Другие подмножества CD4, такие как T-помощник 17 (Th17) Т-клетки способствуют очистке опухоли и могут быть использованы для повышения эффективности Т-клеточной терапии. Таким образом, увеличение Т-клеток Th17 CD4', представляет особый интерес в твердых опухолевых условиях, где увеличение производства интерлейкина 17 (IL-17) способствует противоопухолевому иммунному ответу5,7,8,9. Понимание важности T17 клеток в опухолевых реакций побудило больше исследований в стратегии для создания этих клеток в пробирке7,9. Таким образом, методы для обнаружения этих Подмножества Т-клеток имеют решающее значение для оптимизации Т-клеточной терапии и должны быть надежными, легкими, масштабируемыми и воспроизводимыми.
Цитометрия потока является наиболее распространенным методом для определения идентичности иммунной клетки. Тем не менее, поток цитометрии требует живых, нетронутых клеток, которые должны быть проанализированы в тот же день они собирают. Для внутриклеточного окрашивания цитокинов (ICS) ингибирование секреции белка необходимо для удержания цитокинов в Т-клетках. Однако различные ингибиторные соединения оказывают дифференцирующее воздействие на секрецию специфических цитокинов, заставляя пользователей создавать специализированные коктейли для обнаружения цитокинов интереса10,11. Кроме того, верность потока цитометрии опирается на клоны антител, которые связывают сяконкретно и мощно к своей цели. Использование различных клонов антител может вызвать различные результаты и привести к неточным выводам, что затрудняет стандартизацию12. Кроме того, анализ данных, собранных с помощью цитометрии потока, и, таким образом, выводы, сделанные из данных, может сильно варьироваться между пользователями в зависимости от того, как ворота установлены13,14. По этим причинам цитометрия потока не идеально подходит для точного контроля качества при развитии клеточной терапии.
Оценка геномного метилирования на конкретных генных локусах является альтернативным методом определения клеточной идентичности. Обоснование использования метилирования ДНК для выявления конкретных типов клеток было описано в нескольких статьях и опирается на конкретные модели метилирования, присутствующие в данной популяции клеток15,16,17. В целевых ячейках некоторые участки содержат неметилированные нуклеотиды, в то время как в нецелевых ячеек эти участки метилируются. Эта модель может быть обнаружена с помощью преобразования бисульфита, процесса, который исключительно преобразует неметилированные нуклеотиды цитозин (C) в uracil (U). Праймеры и зонды могут быть разработаны против преобразованных сайтов, а затем усилены и обнаружены через qPCR16.
Анализ, описанный в настоящем тексте, измеряет частоту подтипов иммунных клеток в разнородных популяциях путем количественной оценки числа конкретных неметилированных локусов по сравнению с геном домашнего хозяйства. Копии неметилированных регулятивных элементов гена CD8 B измеряются в тесте CD8, FoxP3 в Treg и IL-17 в Th17 в этом ассее. Эти локусы были определены путем изоляции конкретной популяции клеток, представляющих интерес (например, CD8 "Т-клетки) и выполнения бисульфитного секвенирования для выявления локусов, которые неметилируются только в этой клетке типа15. Праймеры и зонды разрабатываются против уникально неметилированных локусов, а образцы анализируются с помощью qPCR. Стандартная кривая известных номеров копий создается из разбавления стандартного плазмида высокого номера копий, что позволяет преобразовало значение Ct в номер копии стенограммы.
Для оценки эффективности анализа необходимы контрольные образцы, в том числе эталонная гДНК и калибраторная плазмида. Справочный геномный материал представляет собой объединенный образец крови от нескольких доноров с известными частотами иммунных клеток и используется для проверки производительности качества (КК). Образец калибратора представляет собой синтезированный плазмид, содержащий последовательности генов CD8, FoxP3 и GAPDH в эквимолярном соотношении. Он используется в качестве меры эффективности преобразования бисульфита, потому что конверсии бисульфита в различных геномных регионах будут варьироваться в эффективности. Соотношение целевого показателя к GAPDH внутри калибратора составляет 1, но из-за различий в эффективности преобразования бисульфита соотношение может варьироваться. Этот фактор калибровки применяется к анализу CD8 и Treg. FoxP3, ген, используемый в Treg asay, расположен на Х-хромосоме. Потому что этот ассс измеряет только неметилированные копии FoxP3, и только одна копия FoxP3 неметилируется в Tregs, это мнение является секс агностик и может быть использован как с мужчинами и женщинами образцы18. Анализ Th17 не использует образец калибратора или GAPDH в качестве гена домашнего хозяйства. Вместо этого включается еще один набор грунтовок, ориентированный на метилированные локусы, присутствующие в клетках, не относятсях от Th17, и общее количество ячеек отражается в сумме метилированных и неметилированных копий IL-17. Данные, полученные из qPCR, вводятся в шаблон заранее заданный анализ, который выполняет контроль качества данных и вычисляет процент целевой ячейки в исходной популяции. Это обеспечивает автоматизированный и объективный анализ данных, тем самым устраняя субъективность пользователя и улучшая возможности стандартизации.
Этот анализ использует gDNA, которые могут быть изолированы по процедуре лейкапереза с использованием культивированных или фиксированных клеток, или замороженных клеточных гранул. Низкая потребность в выборке, гибкость в исходном материале образца, высокая точность и стандартизированный анализ устраняют ограничения, связанные с цитометрией потока, и идеально подходят для целей контроля качества во время развития процесса клеточной терапии.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.0 ml Eppendorf Safe-Lock Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis template for CD8 assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/CTSPureQuantCD8plusTCellAssayAnalysisTemplate.xlsx">Click Here</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis template for Th17 assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/CTSPureQuantTh17AssayAnalysisTemplate.xlsx">Click Here</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis template for Treg assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/CTSPureQuantTregAssayAnalysisTemplate.xlsx">Click Here</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer, blue/red/violet6/yellow</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A29004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS PureQuant CD8+ T-Cell Assay</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A43674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS PureQuant Th17 Assay</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A43676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS PureQuant Treg Assay</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A43675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads SILANE Genomic DNA Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>37012D</td>
			<td>Used for genomic DNA isolation and purification after bisulfite conversion. Contains elution buffer to dilute samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td>Used as a magnetic rack during DNA isolation and purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Essential Human T cell Phenotyping Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A42923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Essential Human Th1/Th17 Phenotyping Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A42927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Essential Human Treg Phenotyping Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A42925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf SmartBlock 2 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5362000035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HulaMixer Sample Mixer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15920D</td>
			<td>Recommended sample mixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND 1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>AM12450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12S Flex</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4470661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE, pH 8.0, RNase-free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H2KT17113</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of immune cell identity and purity using epigenetic-based quantitative pcr

Иммунные клетки подтипа популяционных частот может иметь большое влияние на эффективность Т-клеток терапии. Современные методы, такие как цитометрия потока, имеют специфические требования к выборке, высокий ввод образцов, имеют низкую пропускную стоимость и трудно стандартизировать, все из которых наносят ущерб характеристике продуктов клеточной терапии во время их разработки и Производство.
Анализы, описанные здесь, точно идентифицируют и количественно определяют типы иммунных клеток в разнородной смеси клеток с использованием изолированной геномной ДНК (gDNA). Модели метилирования ДНК выявляются через преобразование бисульфита, процесс, в котором неметилированные цитозины преобразуются в урацилы. Неметилированные области ДНК обнаруживаются с помощью усиливаемого qPCR с помощью грунтовок, нацеленных на преобразованные области. Один уникальный локус за асссеизм измеряется и служит точным идентификатором для конкретного типа клеток. Анализы являются надежными и определить CD8 ", нормативных, и Th17 Т-клеток в высокой пропускной форме. Эти оптимизированные анализы потенциально могут быть использованы для тестирования в процессе и выпуска продукта для процесса клеточной терапии.

Все три анализа метилирования начинаются с входной гДНК и приводят к проценту клеток CD8, Treg или Th17 в общей популяции клеток. Данные, полученные из qPCR после преобразования бисульфита, были проанализированы с помощью предоставленного шаблона анализа. Этот шаблон использовал стандартные кривые, полученные из стандартных образцов, для оценки количества копий целей и общего количества ячеек в тестовых образцах. Затем тип ячейки процент вычислялся с использованием формул, интегрированных в шаблоны анализа. На рисунке 1 показаны репрезентативные данные анализа CD8, полученные в результате анализа как периферических моноядерных клеток крови (ПБМК), так и Т-клеток трех различных доноров, использующих цитометрию потока и описанную метилирование. Тенденции между этими двумя методами среди всех доноров в обоих типах клеток были одинаковыми. На рисунке 2 показаны репрезентативные данные анализа Treg. Три очищенных донора Treg были проанализированы с использованием как метилирования основе qPCR и потока цитометрии и результаты были построены на графике показано. Результаты по обоим методам были относительно одинаковыми. Однако во всех случаях цитометрия течет выше значений. На рисунке 3 показано сравнение клеток Th17, обнаруженных с помощью цитометрии потока и метилирования. На этом графике существуют стимулируемые и нестимулированные условия для экспериментальных методов. Клетки требуют стимуляции с PMA и иомамицин и лечения с ингибитором переноса белка, чтобы увеличить количество IL-17A присутствует в каждой клетке, так что он может быть обнаружен с помощью потока цитометрии20. Статус метилирования может быть обнаружен независимо от состояния стимуляции. Цитометрия потока дала более низкие уровни клеток Th17 по сравнению с метилированием. Чувствительность и специфичность ассеа были продемонстрированы пределом пробела (LOB), пределом обнаружения (LOD) и ограничением значений количественной оценки (LOЗ), отображаемыми в таблице 6.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60465/60465fig1.jpg"> Рисунок 1: Сравнение потока и метилирования процентных ставок CD8 для ПБМК и Т-клеток для трех различных доноров. ПБМК и Т-клетки из трех различных доноров были просачились на процент CD8 "Т-клеток во всей популяции с использованием либо поток цитометрии или метилирования. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60465/60465fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60465/60465fig2.jpg"> Рисунок 2: Сравнение потока и метилирования процентов Treg для очищенного Treg для трех различных доноров. Очищенные клетки Treg были обсированы на процент клеток Treg в всей популяции, используя либо цитометрию потока или метилирование. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60465/60465fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60465/60465fig3.jpg"> Рисунок 3: Сравнение потока и метилирования процентов Th17 для стимулируемых и нестимулированных экспериментальных групп. Стимулированные и нестимулированные Т-клетки анализировались с использованием цитометрии потока и метилирования. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60465/60465fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Анализа</td>
			<td>Lob</td>
			<td>Лод</td>
			<td>Лоз</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD8</td>
			<td>0</td>
			<td>19</td>
			<td>52</td>
		</tr>
<tr>
<td>Гапх</td>
			<td>0</td>
			<td>7</td>
			<td>21</td>
		</tr>
<tr>
<td>FoxP3</td>
			<td>0</td>
			<td>3</td>
			<td>12</td>
		</tr>
<tr>
<td>Th17 TpG</td>
			<td>0</td>
			<td>35</td>
			<td>73</td>
		</tr>
<tr>
<td>Th17 CpG</td>
			<td>0</td>
			<td>38</td>
			<td>73</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 6: LoB, LoD, Лоз копий номеров для анализов на основе метилирования. Чувствительность и специфика ацензии подробно описаны в значениях LoB, LoD и Lo, полученных руководящими принципами21,22. В общем, всего лишь 40 экземпляров могут быть точно обнаружены этими анализами.

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Immune Cell Identity and Purity Using Epigenetic-Based Quantitative PCR at JoVE.com

Determination of Immune Cell Identity and Purity Using Epigenetic-Based Quantitative PCR

Здесь мы описываем надежный метод определения идентичности и чистоты иммунных клеток с помощью эпигенетических подписей, обнаруженных с помощью количественного ПЦР (qPCR). Деметилирование ДНК в определенном локусе служит уникальным идентификатором для определенного типа клеток и позволяет идентифицировать КЛЕТКи CD8, регулятивные или Th17 T.

Определение идентичности и чистоты иммунных клеток с использованием эпигенетических основе количественных ПЦР

Immune cell subtype population frequencies can have a large effect on the efficacy of T cell therapies. Current methods, like flow cytometry, have ...

Этот протокол предлагает стандартизированный метод определения идентичности и чистоты иммунных клеток, а также устраняет ограничение цитометрии потока, такие как большие требования к выборке, высокая изменчивость пользователя к пользователю и субъективный анализ данных. Этот анализ включает в себя автоматизированный шаблон анализа данных, который позволяет пользователям объективно оценивать идентичность и чистоту иммунных клеток. Это, наряду с несколькими контроля анализа предлагает под ключ, легко стандартизированный метод для оценки иммунной идентичности клеток и чистоты.Демонстрацией этой техники будет Джерри Гузман, ученый в нашей лаборатории. После геномной изоляции ДНК от образца гематопоэтических клеток, представляющих интерес, используйте один микролитер геномной ДНК для измерения чистоты образца на спектрофотометре путем получения оптической плотности на 260, 280 и 230 нанометров. Далее разбавить от 400 до 1200 нанограммов геномного образца ДНК до конечного объема 142 микролитров с элюционным буфером из комплекта изоляции геномной ДНК.Добавьте 75 микролитров калибратора в 67 микролитров буфера элюции. И разбавить 1200 нанограммов эталонной геномной ДНК общим объемом 142 микролитера с буфером элюции. Затем инкубировать трубки в течение пяти минут при 56 градусов по Цельсию и 900 оборотов в минуту в тепловой смеситель.Для преобразования бисульфита добавьте 270 микролитров бисульфита аммония и 90 микролитров THFA во все трубки. И вихрь труб для обеспечения тщательного смешивания. Кратко спина вниз образцы для сбора жидкости и место труб в тепловой смеситель в течение 45 минут при 80 градусов по Цельсию и 900 оборотов в минуту.Затем кратко спина вниз образцы снова и дайте им остыть до комнатной температуры в течение трех-пяти минут. Для очистки ДНК после преобразования бисульфита вихрь изоляции ДНК парамагнитных бусин в течение 30 секунд. Добавить этанол и изопропанол в буферы мытья в соответствии с объемами, перечисленными на бутылках.Вихрь снова, пока бисер полностью resuspended и на 870 микролитров лиза связывания буфера и 105 микролитров ДНК связывания парамагнитных бусин для каждой трубки. Vortex трубки смешивать, прежде чем кратко спиннинг вниз образцов. Добавьте 570 микролитров 2-пропанола в каждую трубку и смешайте вихрем.Инкубировать трубки в течение семи минут при комнатной температуре и 50 об /мин в минуту, прежде чем кратко спиннинг вниз труб снова и поместив их на магнитную стойку в течение пяти минут. В конце инкубации удалить супернат, не нарушая бисера. Вымойте образец буфером 1 и вихрем труб.После краткой центрифугации поместите трубки обратно в стойку на три минуты и удалите супернат, не нарушая бисера. Вымойте образец дважды с буфером мытья 2 и высушить трубки при 65 градусах по Цельсию в течение 15 минут. Затем добавьте 60 буферов эволюции микролитров к каждой трубке.После семиминутной инкубации при комнатной температуре и 1400 оборотов в минуту, кратко спина вниз труб и вернуть трубки в магнит в течение двух минут. В конце инкубации 55 микролитров бисульфита преобразуют ДНК, содержащуюся в новой трубке, не нарушая бисера. Для запуска количественных ПЦР в образцах назначьте каждому стандарту Task Standard в количественном программном обеспечении PCR и укажите окончательные номера копий в соответствии с таблицей.Подготовьте серийные разбавления стандартной ДНК и подготовьте один количественный коктейль смеси ПЦР для целевого типа клеток. И один количественный PCR мастер смесь коктейль для GAPDH, в соответствии с таблицей. Загрузите три микролитров шаблона ДНК в соответствующие скважины 96 хорошо округлые нижней пластины следуют семь микролитров мастер смеси.Когда все скважины были загружены печать пластины с количественной пленкой ПЦР и кратко спина пластины перед загрузкой его на количественный инструмент ПЦР. Затем запустите реакцию, как указано в таблице. По завершении запуска экспорт количественных данных ПЦР в качестве файла txt или xlsx.После очистки бисульфита преобразуется ДНК с парамагнитных ударов, как попродемонстрировано, elute 25 микролитров ДНК. Передача бисульфита преобразуется ДНК в новую трубку и добавить два микролитера образца в отдельные трубки полосы ПЦР. Добавьте два микролитров воды в трубку управления шаблоном и подготовьте мастер-микс preamplification для всех образцов в соответствии с таблицей.Добавьте 23 микролитров мастер-микса к каждой трубке и крышке, вихрю и кратко свяйте трубы. Затем запустите протокол предварительной упрощения на термохикере с помощью нагретой крышки. После завершения пробега, кратко спина вниз труб и передачи микролитров усиленных ДНК в новые трубы.Затем разбавить образцы с 78 микролитров воды до 1 до 40 концентрации и запустить количественный ПЦР образцов, как попродемонстрировано. Здесь показаны репрезентативные данные анализа клеток CD8-T, полученные в результате анализа как периферической крови, моноядерных клеток, так и Т-клеток трех различных доноров, использующих как цитометрию потока, так и анализ метилирования. Тенденции между этими двумя методами для всех доноров в обоих типах клеток были схожими.Эти репрезентативные данные из анализа Treg также показывают аналогичные результаты между методами. Однако во всех случаях этот анализ метилирования дал более высокие значения как при стимулируемых, так и в нестимулированных условиях. Чувствительность и специфичность каждого анализа была продемонстрирована пределом пустоты, пределом обнаружения и пределом значений количественной оценки.Поскольку этот анализ предлагает автоматизированный шаблон анализа данных, он улучшает объективный анализ и увеличивает возможности стандартизации. Это идеально подходит для производства клеточной терапии, где стандартизированные методы имеют решающее значение для создания последовательного продукта клеточной терапии.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Количественная оценка иммунных клеток в поврежденный спинной ткани шнура с помощью проточной цитометрии: Роман Используйте для метода очистки сотовый

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Выделение функциональных сердечно иммунных клеток

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Прижизненное Визуализация Мышь Thymus использованием 2-Фотон микроскопии

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Количественные измерения иммунного ответа и сна в<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Development and Validation of a Quantitative PCR Method for Equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

Разработка и проверка количественной ПЦР метод для Equid герпесвирусных-2 Диагностика в Респираторные жидкостям

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Качественный и количественный анализ иммунной синапсов в системе человека с использованием визуализации проточной цитометрии

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning

Количественная ПЦР бактериофага Т7 от Biopanning

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a ...

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

Определение нормативных Т-клеток подмножеств в мышиных вилочковой железы, поджелудочной железы, дренаж лимфатических узлов и селезенки, с помощью проточной цитометрии

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

Оценка клеточный иммунный ответ плодовой мушки Drosophila melanogaster, используя Assay фагоцитоза в естественных условиях

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are ...