Name: identification of transcription factor regulators using medium-throughput screening of arrayed libraries and a dual-luciferase-based reporter
Uploaded: 2020-03-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter at JoVE.com

ونود أن نشكر إميلي نورتون وميكايلان كوتشياري - ستوليسغروس على المساعدة في إعداد ناقلات shRNA. وقد دعم هذا العمل جزئيا ً منحة سوزان ج. كومن المحفز المهني التي منحت لـ J.M.L. (#CCR17477184).

ملاحظة: يتم عرض ملخص تخطيطي لهذا البروتوكول في الشكل 1.
1. إعداد مكتبة ناقلات العدول Lentiviral
ملاحظة: استخدمت الشاشة المثبتة مكتبة shRNA مصفوفة تم شراؤها كمخزونات الجلسرين في لوحات 96 بئر، ولكن يمكن أيضا أن يتم تجميع المكتبات يدويا استنادا إلى قائمة ا?...

في هذه الدراسة ، ونحن نظهر نهجا للفرز المتوسطة الإنتاجية للمكتبات الفيروسية مصفوفة في تركيبة مع الازدواج ية القائمة على النسخة القائمة على القول مراسل التي يمكن استخدامها لتحديد واختبار المنظمين رواية من عوامل النسخ. من الأهمية بمكان توصيف وتحسين نظام المراسل لكل خط خلية قبل أي شاشة. وين...

والغرض من هذا القول هو استخدام المكتبات الفيروسية لتحديد المنظمين لعوامل النسخ بطريقة سريعة نسبيا وغير مكلفة. ويرتبط النشاط النسخ الشاذ مع السرطان والانبثاث1،2،3،4،5،6، لذلك استهداف عوامل النسخ في الخلايا السرطانية هو نهج علاجي واعد. ومع ذلك، غالباً ما تكون عوامل النسخ صعبة لاستهداف الأدوية7 وكثير مطلوبة لوظيفة الخلوية العادية في أنسجة الكبار8,9,10. استهداف المسارات المرتبطة بالسرطان التي تنشط بشكل خاطئ عوامل النسخ لدفع المرض هو نهج أكثر جدوى مع احتمال أن يكون لها آثار جانبية أقل حدة. يتيح التوافر التجاري لـ RNAi أو CRISPR/CAS9 أو cDNA أو مكتبات ORF للباحثين اختبار أهمية العديد من الجينات في تجربة واحدة. ومع ذلك، يلزم قراءة موثوقة لنشاط النسخ المتغير.
هنا، نحن نصف استخدام فحص مراسل النسخ القائم على اللوسيفراز المزدوج والمكتبات المصصفوفة للصفات للبروتينات التي تنظم عوامل النسخ في الخلايا السرطانية. في هذا القول، يتم تسليم shRNAs التي تستهدف الجينات المرتبطة بالسرطان إلى الخلايا السرطانية الثديية عن طريق نقل الفيروس lentiviral ويتم اختيار الخلايا للتكامل المستقر باستخدام البورومايسين. يتم نقل الخلايا بعد ذلك مع بناء مراسل الذي يعبر عن اليراعات luciferase يقودها مروج محددة لعامل النسخ التي يجري التحقيق فيها وبناء التحكم الذي يعبر عن رينيلا luciferase من المروج نشطة بشكل تأسيسي التي لا تستجيب لعامل النسخ يجري التحقيق. نحن نبرهن على هذا النهج مع شاشة إثبات المفهوم للمنظمين من YAP و TAZ ، والآثار الحاسمة المصب لمسار فرس النهر8،10،11. نشاط غير طبيعي من YAP وTAZ يعزز عدة خطوات من سلسلة منالمنق11 ويلاحظ في العديد من أنواع السرطان11,12,13. ومع ذلك، كيف YAP وTAZ تصبح تنشيط بشكل خاطئ في بعض الخلايا السرطانية لم يفهم تماما بعد. YAP وTAZ لا تربط الحمض النووي، ولكن بدلا من ذلك يتم تجنيدهم إلى المروجين من قبل عوامل النسخ الأخرى. أعضاء عائلة مجال الشاي (TEAD) من عوامل النسخ هي الشركاء ملزمة الرئيسية لYAP وTAZ، وحاسمة بالنسبة لمعظم YAP وTAZ تعتمد على الوظائف. لدينا بناء مراسل يعبر عن luciferase اليراعات من YAP / TAZ-TEAD استجابة المروج والدراسات السابقة أظهرت أنه يكشف بأمانة التغيرات في YAP-TEAD وTAZ-TEAD نشاط النسخ2،14،15.
نهجنا سريع ومتوسط الإنتاجية، ولا يتطلب مرافق فحص، روبوتات آلية، أو تسلسل عميق للمكتبات المجمعة. التكاليف منخفضة نسبيا وهناك العديد من المكتبات المتاحة تجاريا للاختيار من بينها. كما أن المعدات والكواشف المطلوبة قياسية نسبيا في معظم المختبرات. ويمكن استخدامه لفحص المنظمين من أي عامل النسخ تقريبا إذا كان المراسل القائم على luciferase موجود أو تم إنشاؤه. نحن نستخدم هذا النهج لفحص shRNAs في الخلايا السرطانية، ولكن أي خط الخلية التي يمكن أن تكون مصابة بكفاءة معقولة يمكن استخدامها مع أي نوع من مكتبة صفيف.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.0 ml 96-well deep well polypropylene plate</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1896-2000</td>
			<td>For bacterial mini-prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin - 2.50%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td>Component of trypsin-EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat bottom white assay plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3922</td>
			<td>For dual-luciferase assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin - 100 mg/ml</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>45-10835242001-EA</td>
			<td>For bacterial mini-prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto-tryptone - powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>95039</td>
			<td>Component of LB broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-luciferase reporter assay system, which include LAR II reagent (reagent A), Stop &#38; Glo substrate (reagent B substrate) and Stop &#38; Glo buffer (reagent B buffer) - Kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1960</td>
			<td>For dual-luciferase assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline w/o calcium, magnesium and phenol red - 9.6 g/L</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>TS1006</td>
			<td>For PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA - 0.5 M</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-406</td>
			<td>Component of trypsin-EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol - 100%</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td>111000200</td>
			<td>For bacterial mini-prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum - 100%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97068-085</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine bromide (Polybrene) - 8 mg/ml</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>45-H9268</td>
			<td>For virus infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone DMEM/High glucose - 4 mM L-Glutamine; 4500 mg/L glucose; sodium pyruvate</td>
			<td>GE Healthcare life sciences</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td></td>
			<td>For dual-luciferase assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine - 200 mM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 (Transfection Reagent 2) - 100%</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>L3000008</td>
			<td>For transfections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Biology Water - 100%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>02-0201-0500</td>
			<td>For dilution of shRNA vector for virus packaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl - powder</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH9286</td>
			<td>Component of LB broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td></td>
			<td>For measuring vector DNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM (Transfection Buffer) - 100%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-062</td>
			<td>For transfections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin - 10,000 Unit/ml (Penicillin); 10,000 &#181;g/ml (Streptomycin)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit - Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K210010</td>
			<td>For bacterial mini-prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin - 2.5 mg/ml</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>45-P7255</td>
			<td>For antibiotic selection after infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20 automated cell counter</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (Transfection Reagent 1) - 100%</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6365787001</td>
			<td>For virus packaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract - powder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>J850</td>
			<td>Component of LB broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P3000 (Transfection Reagent 3) - 100%</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>L3000008</td>
			<td>For transfections</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of transcription factor regulators using medium-throughput screening of arrayed libraries and a dual-luciferase-based reporter

يمكن لعوامل النسخ تغيير التعبير عن العديد من الجينات المستهدفة التي تؤثر على مجموعة متنوعة من العمليات المصب مما يجعلها أهدافا جيدة للعلاجات المضادة للسرطان. ومع ذلك، استهداف عوامل النسخ مباشرة غالباً ما يكون صعباً ويمكن أن يسبب آثار جانبية سلبية إذا كان عامل النسخ ضروري في واحد أو أكثر من أنسجة البالغين. تحديد المنظمين المنبع التي تنشط بشكل خاطئ عوامل النسخ في الخلايا السرطانية يقدم بديلا أكثر جدوى، لا سيما إذا كانت هذه البروتينات سهلة للدواء. هنا ، نحن نصف بروتوكول يمكن استخدامه للجمع بين المكتبات المتوسطة النطاق على نطاق واسع والمكتبات ذات النسخة المزدوجة اللوسيفاز القائمة على القول لتحديد المنظمين الرواية لعوامل النسخ في الخلايا السرطانية. يقدم نهجنا طريقة سريعة وسهلة وغير مكلفة لاختبار مئات الجينات في تجربة واحدة. لإثبات استخدام هذا النهج، قمنا بإجراء شاشة مكتبة RNAI مصفّى تحتوي على العديد من المنظمين للبروتين المرتبط بنعم (YAP) والنسخ المشارك المنشط مع عزر PDZ-ملزمة (TAZ)، واثنين من المنشطات المشتركة النسخ التي هي تأثيرات المصب لمسار فرس النهر. ومع ذلك، يمكن تعديل هذا النهج لفحص المنظمين من أي عامل النسخ تقريبا أو العامل المشارك ويمكن أيضا أن تستخدم لفحص CRISPR/CAS9، cDNA، أو مكتبات ORF.

لدينا YAP / TAZ-TEAD مراسل بناء (pGL3-5xMCAT (SV)-4922,14,,15)يحتوي على الحد الأدنى SV-49 المروج مع 5 يكرر من عنصر الربط TEAD الكنسي (MCAT)15 يقود اليراعات الزمرة الجين(الشكل 1). يتم نقلها إلى خلايا جنبا إلى جنب مع ناقل مك...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter at JoVE.com

Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter

لتحديد المنظمين الرواية من عوامل النسخ، وضعنا نهجا لفحص صفيفlentiviral أو retroviral المكتبات RNAI باستخدام النسخ المزدوج القائم على luciferase. هذا النهج يوفر طريقة سريعة وغير مكلفة نسبيا لفحص مئات المرشحين في تجربة واحدة.

تحديد منظمي عوامل النسخ باستخدام فحص متوسط الإنتاجية للمكتبات المصصفوفة ومراسل ثنائي لوسيفراز القائم

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for ...

يمكن استخدام هذا البروتوكول لفحص مكتبات فحص العدسي أو الفيروسية الرجعية لتحديد المنظمين رواية عوامل النسخ في الخلايا السرطانية. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي أنها سريعة ومتوسطة الإنتاجية وغير مكلفة ، وأنها تستخدم المعدات والكواشف التي يمكن الوصول إليها عادة لمعظم المحققين. لتوسيع وتنقية كل متجه من المغذيات الناظرة في المكتبة، أضف أولاً 1.3 ملليلتر من مرق لوريا المُكمَّل بـ 100 ميكروغرام لكل ملليلتر من الأمبيسيلين إلى كل بئر من 96 بئراً.تلقيح كل بئر مع اثنين من microliters من مخزون الجلسرين لاحتضان ليلة وضحاها في 37 درجة مئوية و 225 الثورات في الدقيقة الواحدة. في اليوم التالي، نقل كل ثقافة البكتيريا إلى الفردية 1.5 ملليلتر microcentuge أنابيب للطرد المركزي. تنقية كل ناقل مع مجموعة صغيرة البكتيريا المناسبة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.لكل ناقل في المكتبة المعدة، بذور بئر واحد من لوحة 24-جيدا مع واحد مرات 10 إلى الخلايا الخامسة 293FT واحتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة. لإعداد خليط transfection التي سيتم إعدادها لكل ناقل في المكتبة، أولاً elute كل متجه العدسي إلى تركيز نهائي من 50 نانوغرام لكل ميكرولتر مع مياه خالية من النوى. نقل خمسة ميكروليتر من كل تخفيف في آبار فردية من لوحة PCR 96-well.جعل مزيج فائق transfection عن طريق خلط 1.25 ميكرولتراترز مرات x من كاشف transfection واحد مع 23.75 ميكرولتررز مرات x من العازلة ما قبل الدافئة transfection. احتضان مزيج فائق transfection في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. ثم إضافة 125 نانوغرام مرات x من psPAX2 و 125 نانوغرام مرات x من VSVG إلى مزيج فائق مع الأنابيب لطيف.aliquot على الفور مزيج السوبر في كل أنبوب من شريط PCR واستخدام ماصة متعددة القنوات لنقل 25 ميكرولترات من الخليط في كل بئر من ناقلات الفيروسية المخفف. بعد حضانة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، واستخدام ماصة متعددة القنوات لنقل 30 ميكرولترات من كل خليط transfection من كل بئر إلى بئر المقابلة من الخلايا 293FT في لوحة 24-جيدا أعدت سابقا. احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة قبل استبدال المتوسطة في كل بئر مع 500 ميكرولترات من متوسط النمو الكامل الطازجة لاحتضان آخر على مدار 24 ساعة في حاضنة ثقافة الخلية.في اليوم التالي ، استخدم ماصة متعددة القنوات لجمع الماين الفيروسي من كل بئر و aliquot 220 ميكرولترات من كل اضخم في بئرين في لوحة جديدة 96-well لتوليد لوحة كبيرة فيروسية مصفّعة. لإعداد الخلايا A375 للعدوى، بذور مرة واحدة 10 إلى الخلايا الخامسة في لوحة 24-جيدا في 0.5 ملليلتر من متوسط النمو الكامل لكل بئر لكل متجه الفيروسية في المكتبة. وتشمل أيضاً إضافية لن تكون مصابة لتكون بمثابة مراقبة لاختيار المخدرات.بعد حضانة لمدة 24 ساعة في حاضنة ثقافة الخلية ، اذيب الاسطون المصفى المجمد مجموعة فائقة على درجة حرارة الغرفة قبل استبدال متوسط النمو من كل بئر من لوحة ثقافة الخلية المعدة مع 200 ميكرولترات من متوسط النمو تكملها 20 ميكروغرام لكل ملليلتر من البوليبرين. باستخدام ماصة متعددة القنوات، نقل 200 ميكرولترات من الفيروسية العملاقة من كل 96 جيدا إلى كل بئر من لوحة 24 جيدا. إعادة الخلايا إلى الحاضنة ثقافة الخلية لمدة 24 إلى 48 ساعة.في نهاية الحضانة، واستبدال المتوسطة في كل بئر مع 500 ميكرولترات من متوسطة النمو تكمل مع البوسوميسين والعودة إلى الخلايا الحاضنة ثقافة الخلية لمدة 48 ساعة إضافية. بعد اختيار البوروميسين لمدة 48 ساعة ، قم بفرز الخلايا إلى ثلاث أو أربع مجموعات بحيث تحتوي جميع الآبار في مجموعة واحدة على كثافة خلايا مماثلة وإضافة 200 ميكرولترات من التربسين -EDTA إلى ممثل واحد جيدًا من كل مجموعة لاحتضان لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية. مرة واحدة قد فصلت الخلايا، تحييد التربسين مع 400 ميكرولترات من متوسطة النمو تستكمل مع البورومايسين وعدد من الخلايا من كل التربسينيد جيدا.تمييع كل تعليق خلية إلى مرتين 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر التركيز مع متوسط النمو تكملها البوروميسين والبذور 500 ميكرولتر من الخلايا من كل بئر في نفس الوضع جيدا في لوحة جديدة 24-جيدا. بعد استخدام العد من كل ممثل جيدا لتقدير عدد الخلايا في كل ما تبقى بشكل جيد في كل مجموعة، إضافة حجم مناسب من التربسين-EDTA إلى كل بئر لتحقيق واحد مرات 10 إلى الخلايا السادسة في تركيز المليلتر. أثناء التربسينينيونية، استخدم ماصة متعددة القنوات لإضافة 400 ميكرولترات من متوسطة النمو المكملة مع البورومايسين إلى الآبار المناسبة المقابلة في لوحة 24-well الجديدة.مرة واحدة قد فصلت الخلايا، بلطف مزيج محتويات كل بئر ونقل 100 ميكرولترات من كل تعليق الخلية إلى مناسبة المقابلة جيدا في لوحة جديدة 24-جيدا. ثم قم بإعادة الخلايا إلى حاضنة ثقافة الخلية لمدة 24 ساعة. لtransfect الخلايا مع ثنائي luciferase المراسل يبني، وإعداد خليط التخفيف transfection كما هو مبين في الجدول.لتحضير خليط تخفيف المراسل، اخلطي أحجام كل كاشف مضروبة في العدد الإجمالي للعابرة بالإضافة إلى عدة وحدات تخزين إضافية. بعد ذلك، اخلطي خليط تخفيف النتروبات مع خليط تخفيف المراسل وحضن المحلل الناتج في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة لإنتاج خليط transfection. خلال الحضانة، شطف كل بئر من لوحة ثقافة الخلية مع 250 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني وإضافة 447 ميكرولترات من نمو كامل جديد المتوسطة لكل بئر.ثم استخدام ماصة متعددة القنوات لتوزيع 53 ميكرولترات من مزيج transfection إلى كل بئر من لوحة ثقافة الخلية. ضع الصفيحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة. لقياس نشاط لوسيفراز، تمييع 5X العازلة السلبية من مجموعة نشاط لوسيفيراز في تخفيف واحد إلى خمسة مع المياه غير المؤينة وذوبان الكميات اللازمة من الكاشف A والمكاشف B العازلة من عدة.عندما تكون الكواشف جاهزة ، استبدل المابير في كل بئر بـ 75 ميكرولترات من عازلة التحلل السلبي واحتضان اللوحة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز عرضي. أثناء الحضانة، وتمييع الركيزة 50X مُكْشف B من المجموعة إلى تركيز واحد إلى 50 مع عازلة المذابة ب الكاشف. في نهاية الحضانة، إضافة 30 microliters من العازلة التحلل السلبي إلى أربعة آبار التحكم فارغة ونقل 30 microliters من lysate من كل بئر إلى آبار مكررة من 96 مسطحة جيدا أسفل لوحة فحص بيضاء.عندما تم مطلي كل من lysate، واستخدام ماصة متعددة القنوات لإضافة 50 ميكرولترات من الكاشف A إلى كل بئر وقراءة إشارة لوسيفراز اليراعة مع قارئ لوحة. ثم استخدام ماصة متعددة القنوات لإضافة 50 ميكرولترات من B الكاشف إلى كل بئر وقراءة إشارة luciferase رينايلا مع قارئ لوحة. كما هو متوقع، YAP2SA يزيد من نشاط لوسيفراز اليراعات ولكن ليس نشاط رينيهيلا لوسيفالاس بالمقارنة مع ناقلات التحكم.في المقابل، YAP2SA S94A لا يزيد من نشاط لوسيفايراس اليراعات. الأهم من ذلك، YAP2SA لا يغير نشاط بناء المروج الحد الأدنى الذي يفتقر إلى عناصر الربط تييد MCAT. في الخلايا التي تحتوي على المقاومة YAP-TAZ-TEAD بناء مراسل، وتاند YAP وTAZ دبابيس الشعر قصيرة خفضت بشكل كبير مستويات الثيريفلاي لوسيفراز، ولكن السيطرة على دبابيس الشعر قصيرة غير استهداف السيطرة لا.في المقابل، في الخلايا التي تُصاب بأدنى مستوى من بناء المراسل، فإن رنا ناوب الشعر القصير YAP-TAZ لا يغير بشكل كبير مستويات اليراعات في النفّاس. إشارة رينايلا في كل بئر أيضا لا تتغير بشكل كبير من قبل عنصر التحكم في دبوس الشعر القصير غير الاستهداف أو RNA RNA PIN الشعر القصير YAP-TAZ. كما هو متوقع، رناس دبوس الشعر القصير التي تستهدف YAP وTAZ، SARC أو PI3 كيناز يقلل بشكل كبير من النشاط YAP-TAZ-TEAD.RNAs قصيرة دبوس الشعر التي تستهدف أجهزة الصراف الآلي، CDH1، CSK، ERBB2، وgelsolin كل زيادة مستويات لوسيفراز اليراعات تطبيع تتفق مع الدراسات المنشورة التي تبين أن هذه البروتينات كانت YAP و / أو TAZ. على الرغم من الأدوار الراسخة ل ATR وCCNE2 و ERBB4 في أنواع الخلايا الأخرى ، فإن RNAs قصير دبوس الشعر الذي يستهدف هذه الجينات لا يغير بشكل كبير مستويات لوسيفراز اليراعات الطبيعية في الخلايا A375. بعد هذه الشاشة، يجب التحقق من تحديد المنظمين باستخدام قراءات أخرى لنشاط عامل النسخ الخاصة بهم.وينبغي أيضا تأكيد الضربة القاضية الفعالة للمنظم المحدد من قبل الفحص. تذكر أن تُحذِر وأن تتبع إرشادات السلامة عند العمل مع فيروسات العدس المعدية، خاصة إذا كانت الفيروسات بشرية معدية.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification

سيكتيونينغ الغدة الثديية يتصاعد كله لتحديد الآفة

Normal mammary gland development may be altered by exposure to environmental toxicants and pharmaceutical products, excessive exposure to hormones, and ...

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

تدفق المخدرات على أساس الخلوي فحص النظام لتحديد الجزيئات الصغيرة التي تعزز التمايز الخلوي للخلايا الجذعية جليوبلاستوما

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

Live Cell Imaging of the TGF-	&beta;/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

Live Cell Imaging of the TGF-	ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

يعيش خلية تصوير TGF-β/Smad3 مما يشير إلى المسار في المختبر و في فيفو باستخدام نظام مراسل إتش

Transforming Growth Factor &#946; (TGF-&#946;) signaling regulates many important functions required for cellular homeostasis and is commonly found ...

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array (HMCA)-based Plates

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array HMCA-based Plates

تحليل لغزو خلايا السرطان والمنتشر لمكافحة المخدرات فحص استخدام صفيف المائية الصغيرة-الدائرة (همكا)-على أساس لوحات

Cancer metastasis is known to cause 90% of cancer lethality. Metastasis is a multistage process which initiates with the penetration/invasion of tumor ...

Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells

عزل الحويصلات خارج الخلية المخصبة Exosome تحمل عامل تحفيز مستعمرة الحبيبية-الضامة من الخلايا الجذعية الجنينية

Embryonic stem cells (ESCs) are pluripotent stem cells capable of self-renewal and differentiation into all types of embryonic cells. Like many other cell ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

إنشاء وتوصيف الأمعاء العصبية الصغيرة ورم الغدد الصماء خزان

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

رسم خرائط للعلاقات بين الهيكل والوظيفة لعوامل النسخ غير المنضبطة باستخدام التحليل النسخي

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

تحديد مثبطات EGFR و RAS باستخدام إليجانات Caenorhabditis

The changes in the plasma membrane localization of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and its downstream effector RAS have been implicated in ...

Discovery of Metastatic Regulators using a Rapid and Quantitative Intravital Chick Chorioallantoic Membrane Model

اكتشاف المنظمين النقيلي باستخدام نموذج الغشاء السريع والكمي داخل الفرخ Chorioallantoic

Recent advances in cancer research has illustrated the highly complex nature of cancer metastasis. Multiple genes or genes networks have been found to be ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

سير عمل الفحص السريع لتحديد العلاج المركب المحتمل ل GBM باستخدام الخلايا الجذعية الدبقي المشتقة من المريض

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...