Name: identification of transcription factor regulators using medium-throughput screening of arrayed libraries and a dual-luciferase-based reporter
Uploaded: 2020-03-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter at JoVE.com

我们要感谢艾米莉·诺顿和米凯拉·库恰尔-斯图利格罗斯协助制备shRNA载体。这项工作得到了苏珊·科门职业催化剂赠款的部分支持，该赠款授予了J.M.L.（#CCR17477184）。

注： 该协议的原理图摘要如图1所示。
1. 伦迪病毒病媒库制备
注：演示的屏幕使用在 96 孔板中作为甘油库存购买的阵列 shRNA 库，但库也可以根据候选列表手动组装。应考虑适当的控件并将其包含在任何库中。这包括非目标控制shRNA（shNTC），一种针对被调查的转录因子的控制shRNA，如果可能的话，一个针对萤火虫荧光酶的shRNA。
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在这项研究中，我们演示了一种将基于双透明酶的转录器检测方法结合在一起，用于识别和测试新的转录因子调节器的中通量筛选方法。在任何屏幕之前，对每个单元行的分型和优化报告系统至关重要。应进行实验，以确认报告者对正在调查的转录因子的活动变化有反应，并且应对照对照载体测试活动变化程度。PRL-TK构造与报告器构造的共转导非常重要，因为它有助于控制与报告器一起转染的细?...

此测定的目的是使用病毒库，以相对快速和廉价的方式识别转录因子的调节器。异常转录活性与癌症和转移11、2、3、4、5、62,3,4,5,6相关，因此靶向癌细胞中的转录因子是一种很有前途的治疗方法。然而，转录因子往往难以瞄准药理学7和许多需要正常细胞功能在成人组织8，9，10。9,108靶向癌症相关途径，异常激活转录因子驱动疾病是一种更可行的方法，有可能有不太严重的副作用。阵列慢病毒和逆转录病毒RNAi、CRISPR/CAS9、cDNA或ORF库的商业可用性使研究人员能够在单个实验中测试许多基因的重要性。但是，需要为更改的转录活动进行可靠的读出。
在这里，我们描述了使用基于双透明酶的转录报告器测定和排列的慢病毒库来识别调节癌细胞转录因子的蛋白质。在此测定中，针对癌症相关基因的shRNA通过慢病毒转导输送到哺乳动物癌细胞，并且选择细胞使用紫杉霉素进行稳定整合。细胞的下一个转染与一个记者构造，表达萤火虫透明酶驱动特定到被调查的转录因子和对照结构，表达雷尼拉透明化从一个产生活性的促进剂，对被调查的转录因子不响应。我们演示了这种方法，为YAP和TAZ的监管机构提供了概念验证屏幕，这是Hippo通路8、10、1110,的关键下游8效应器。11YAP和TAZ的异常活动促进转移级联11的几个步骤，并观察到在许多癌症11，12，13。11,12,13然而，YAP和TAZ如何变得异常激活在一些癌细胞还没有完全了解。YAP 和 TAZ 不绑定 DNA，而是通过其他转录因子招募给促进者。TEA 域 （TEAD） 转录因子系列的成员是 YAP 和 TAZ 的主要绑定合作伙伴，对于大多数 YAP 和 TAZ 相关函数至关重要。本报记者从YAP/TAZ-TEAD反应促进器中构建了萤火虫荧光酶，以往的研究表明，它忠实地检测了YAP-TEAD和TAZ-TEAD转录活动22、14、1514,15的变化。
我们的方法快速、中等吞吐量，不需要筛选设施、自动化机器人或池库的深层测序。成本相对较低，有许多商业上可用的图书馆可供选择。在大多数实验室中，所需的设备和试剂也相对标准。如果存在或生成基于荧光酶的分录器，它可用于筛选几乎任何转录因子的监管机构。我们使用这种方法在癌细胞中筛选shRNA，但任何能以合理效率转染的细胞系都可以用于任何类型的阵列库。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.0 ml 96-well deep well polypropylene plate</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1896-2000</td>
			<td>For bacterial mini-prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin - 2.50%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td>Component of trypsin-EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat bottom white assay plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3922</td>
			<td>For dual-luciferase assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin - 100 mg/ml</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>45-10835242001-EA</td>
			<td>For bacterial mini-prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto-tryptone - powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>95039</td>
			<td>Component of LB broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-luciferase reporter assay system, which include LAR II reagent (reagent A), Stop &#38; Glo substrate (reagent B substrate) and Stop &#38; Glo buffer (reagent B buffer) - Kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1960</td>
			<td>For dual-luciferase assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline w/o calcium, magnesium and phenol red - 9.6 g/L</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>TS1006</td>
			<td>For PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA - 0.5 M</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-406</td>
			<td>Component of trypsin-EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol - 100%</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td>111000200</td>
			<td>For bacterial mini-prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum - 100%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97068-085</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine bromide (Polybrene) - 8 mg/ml</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>45-H9268</td>
			<td>For virus infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone DMEM/High glucose - 4 mM L-Glutamine; 4500 mg/L glucose; sodium pyruvate</td>
			<td>GE Healthcare life sciences</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td></td>
			<td>For dual-luciferase assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine - 200 mM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 (Transfection Reagent 2) - 100%</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>L3000008</td>
			<td>For transfections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Biology Water - 100%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>02-0201-0500</td>
			<td>For dilution of shRNA vector for virus packaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl - powder</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH9286</td>
			<td>Component of LB broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td></td>
			<td>For measuring vector DNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM (Transfection Buffer) - 100%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-062</td>
			<td>For transfections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin - 10,000 Unit/ml (Penicillin); 10,000 &#181;g/ml (Streptomycin)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit - Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K210010</td>
			<td>For bacterial mini-prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin - 2.5 mg/ml</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>45-P7255</td>
			<td>For antibiotic selection after infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20 automated cell counter</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (Transfection Reagent 1) - 100%</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6365787001</td>
			<td>For virus packaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract - powder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>J850</td>
			<td>Component of LB broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P3000 (Transfection Reagent 3) - 100%</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>L3000008</td>
			<td>For transfections</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of transcription factor regulators using medium-throughput screening of arrayed libraries and a dual-luciferase-based reporter

转录因子可以改变许多目标基因的表达，这些基因影响各种下游过程，使它们成为抗癌治疗的良好目标。然而，直接瞄准转录因子通常是困难的，并可能导致不良的副作用，如果转录因子是必要的一个或多个成人组织。识别癌细胞中异常激活转录因子的上游调节器提供了一个更可行的替代方案，特别是如果这些蛋白质容易被药物。在这里，我们描述了一种协议，可用于组合阵列的中等尺度慢病毒库和基于双透明酶的转录报告器测定，以确定癌细胞转录因子的新调节器。我们的方法提供了一种快速、简单且廉价的方法，在单个实验中测试数百个基因。为了证明这种方法的使用，我们执行了一个阵列的慢病毒RNAi库的屏幕，该库包含几个调节器的Yes相关蛋白（YAP）和带PDZ结合图案（TAZ）的转录共活化器，两个转录共激活器，是Hippo通路的下游效应器。但是，这种方法可以修改为几乎所有转录因子或共因子的调节器进行筛选，也可用于筛选 CRISPR/CAS9、cDNA 或 ORF 库。

我们的YAP/TAZ-TEAD记者构造 （pGL3-5xMCAT （SV）-492，,14，,15） 包含一个最小的SV-49启动器与5个重复的规范TEAD结合元素 （MCAT）15驱动萤火虫透明酶基因 （图1）。它与PRL-TK控制载体（Promega）一起被共转入细胞中，后者表示来自产生活性HSV TK促进剂的Renilla lucife...

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Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter

为了识别新的转录因子调节器，我们开发了一种使用基于双透明酶的转录报告器测定筛选排列的慢病毒或逆转录病毒RNAi库的方法。这种方法提供了一种快速且相对便宜的方法，在单个实验中筛选数百名候选人。

使用阵列库的中等通量筛选和基于双 Luciferase 的分录报告器识别转录因子稳压器

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for ...

该协议可用于筛选排列的扁病毒或逆转录病毒测定库，以确定癌细胞中转录因子的新调节器。该技术的主要优点是，它快速、中吞吐量和价格低廉，并且使用大多数调查人员通常都能接触到的设备和试剂。为了扩大和纯化库中的每一个扁病毒载体，首先在96井深井板的每个井中加入1.3毫升的Luria肉汤，每毫升安皮西林100微克。每口井都接种两微升甘油，在37摄氏度和每分钟225转下进行夜间孵育。第二天，将每种细菌培养成单独的1.5毫升微离心管进行离心。根据制造商的说明，使用适当的细菌迷你试剂盒来净化每个病媒。对于准备好的库中每个载体，用1倍10至第五个293FT细胞播种24井板的一个井，并在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育细胞24小时。为了准备一个转染混合物，这将设置在库的每个载体，首先将每个扁病毒载体的最终浓度为50南克每微升与无核酸酶水。将每次稀释的五微升转移到 96 孔 PCR 板的单个孔中。通过混合1.25微升倍x转染试剂一与23.75微升倍x预热转染缓冲液，进行转染超级混合。在室温下孵育转染超级混合物五分钟。然后添加 125 南图倍 x 的 psPAX2 和 125 南图倍 x 的 VSVG 到超级混合与温和的移液。立即将超级混合物加入PCR条的每个管，并使用多通道移液器将混合物的25微升转移到稀释病毒载体的每个井中。在室温下孵育20分钟后，使用多通道移液器将每个转染混合物的30微升从每井转移到先前准备的24井板中相应的293FT细胞中。孵育细胞24小时，然后用500微升的新鲜完整生长培养培养本替换每井的培养，在细胞培养箱中再进行24小时孵化。第二天，使用多通道移液器从每口井收集病毒上流剂，将每个上流水液的220微升收集到一个新的96孔板中的两口井中，生成一个排列的病毒上流液板。为了准备感染的 A375 细胞，在库中每个病毒载体的每井 0.5 毫升完整生长介质中，将 10 倍到第 5 个细胞的种子在 24 井板中。包括一个额外的井，不会感染，作为药物选择的控制。在细胞培养箱中孵育24小时后，将冷冻排列的扁病毒中先型至上经温度解冻，然后用200微升生长介质将准备的细胞培养板的生长介质替换为200微升的生长培养基，并辅以每毫升多纤维素20微克。使用多通道移液器，将 200 微升病毒上流液从每 96 井转移到 24 井板的每个井中。将细胞返回细胞培养箱24至48小时。在孵育结束时，用500微升的生长介质和紫霉素补充，将细胞返回细胞培养箱48小时。在选择48小时纯霉素后，将细胞分成三到四组，使单个组中的所有井的细胞密度相似，并将200微升的尝试辛-EDTA添加到每组一个代表性的井中，在37摄氏度下进行5分钟的孵育。一旦细胞分离，用400微升的生长介质中和尝试素，并计算每个三辛化井的细胞数量。将每个细胞悬浮液稀释到每毫升浓度的2倍10至第5个细胞，生长培养基辅以紫霉素，从每个井中播种500微升细胞，进入新的24井板中的相同井位。使用每个代表性井的计数估计每个组中每个剩余井中的细胞数后，向每井添加适当的 trypsin-EDTA 体积，以实现每毫升浓度 10 倍到第六个细胞。在试液化过程中，使用多通道移液器将400微升生长介质加用紫霉素，加入到新24孔板的相应井中。一旦细胞分离，轻轻混合每一个井的内容，并转移100微升每个细胞悬浮液到适当的相应的井在新的24井板。然后将细胞返回细胞培养箱24小时。要用双荧光酶处理器结构转染细胞，请准备转染稀释混合物，如表中所示。要准备记者稀释混合物，混合每个试剂的体积乘以转染的总数加上几个额外的体积。接下来，将转染稀释混合物与记者稀释混合物混合，在室温下孵育所得溶液15分钟，产生转染混合物。在孵育过程中，用250微升PBS冲洗细胞培养板的每口井，并在每口井中加入447微升的新鲜完整生长介质。然后使用多通道移液器将53微升的转染混合物分发到细胞培养板的每个井中。将板在37摄氏度和5%的二氧化碳24小时。为了测量荧光素酶活性，用去电化水稀释百西解酶活性试剂盒中的5X无源解液缓冲液，并解冻试剂盒中所需的试剂A和试剂B缓冲液。当试剂准备就绪后，用75微升无源解液将每井中的上流液更换，并在室温下孵育板30分钟，偶尔摇晃。在孵育过程中，用解冻试剂B缓冲液将试剂盒B基板稀释至1至50浓度。在孵化结束时，在四口控制井中加入30微升无源解液缓冲液，并将30微升的解盐从每口井转移到96孔平底白化检测板的重复井中。当所有莱酸盐都镀上时，使用多通道移液器向每个井中添加 50 微升试剂 A，并使用板读卡器读取萤火虫荧光素酶信号。然后使用多通道移液器将 50 微升试剂 B 添加到每个井中，并使用板读卡器读取 Renilla 荧光素酶信号。正如预期的那样，YAP2SA 增加萤火虫荧光酶活性，但与控制载体相比，不会增加雷尼拉荧光酶活性。相比之下，YAP2SA S94A不会增加萤火虫荧光素酶活性。重要的是，YAP2SA不会改变缺少 MCAT TEAD 绑定元素的最小启动子结构的活动。在与 YAP-TAZ-TEAD 记者结构相染的细胞中，串联的 YAP 和 TAZ 短发夹显著降低萤火虫荧光素酶水平，但对短发夹的非靶向控制不然。相比之下，在与最小处理器结构相染的细胞中，YAP-TAZ 短发夹RNA不会显著改变萤火虫荧光素酶水平。每个井中的 Renilla 信号也未因短发夹非靶向控制或 YAP-TAZ 短发夹 RNA 而显著改变。正如预期的那样，针对 YAP 和 TAZ、SARC 或 PI3 激酶的短发夹RNA显著减少 YAP-TAZ-TEAD 活性。短发夹RNA针对ATM，CDH1，CSK，ERBB2和凝胶素每个增加正常化萤火虫荧光石酶水平与已发表的研究表明，这些蛋白质是雅普和/或TAZ。尽管 ATR、CCNE2 和 ERBB4 在其他细胞类型中已确立作用，但针对这些基因的短发夹 RNA 不会显著改变 A375 细胞中规范化萤火虫荧光素酶水平。在此屏幕之后，应使用其他读数验证识别稳压器的转录因子活性。还应确认检测对已识别的稳压器的有效敲解。在使用传染性扁病毒时，请谨慎使用并遵循安全准则，尤其是在病毒具有人类传染性时。

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