Name: identification of transcription factor regulators using medium-throughput screening of arrayed libraries and a dual-luciferase-based reporter
Uploaded: 2020-03-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter at JoVE.com

Nous tenons à remercier Emily Norton et Mikaelan Cucciarre-Stuligross d’avoir participé à la préparation des vecteurs de shRNA. Ce travail a été soutenu en partie par une subvention Susan G. Komen Career Catalyst qui a été décernée à J.M.L. (#CCR17477184).

REMARQUE : Un résumé schématique de ce protocole est présenté à la figure 1.
1. Préparation de la bibliothèque vectorielle lentiviral
REMARQUE : L’écran démontré a utilisé une bibliothèque de shRNA à bord achetée sous forme de stocks de glycérol dans des plaques de 96 puits, mais les bibliothèques peuvent également être assemblées manuellement en fonction d’une liste de candidats. Les contrôles appropriés doivent...

Dans cette étude, nous démontrons une approche pour le dépistage à débit moyen des bibliothèques virales de gamme en combinaison avec un essai de journaliste transcriptionnel à double base de luciferase qui peut être employé pour identifier et tester de nouveaux régulateurs des facteurs de transcription. Il est essentiel de caractériser et d’optimiser le système de reporter pour chaque ligne cellulaire avant n’importe quel écran. Des expériences devraient être faites pour confirmer que le journaliste e...

Le but de cet essai est d’utiliser des bibliothèques virales pour identifier les organismes de réglementation des facteurs de transcription d’une manière relativement rapide et peu coûteuse. L’activité transcriptionnelle aberrante est associée au cancer et aux métastases1,2,3,4,5,6, ainsi cibler des facteurs de transcription dans les cellules cancéreuses est une approche thérapeutique prometteuse. Cependant, les facteurs de transcription sont souvent difficiles à cibler pharmacologiquement7 et beaucoup sont nécessaires pour la fonction cellulaire normale dans les tissus adultes8,9,10. Cibler les voies associées au cancer qui activent aberrantement les facteurs de transcription pour conduire la maladie est une approche plus faisable avec le potentiel d’avoir des effets secondaires moins graves. La disponibilité commerciale des bibliothèques RNAi lentiviral et rétroviral à réseau, CRISPR/CAS9, cDNA ou ORF permet aux chercheurs de tester l’importance de nombreux gènes dans une seule expérience. Cependant, une lecture fiable pour l’activité transcriptionnelle altérée est exigée.
Ici, nous décrivons l’utilisation d’un essai de reporter transcriptionnel à double base de luciferase et de bibliothèques lentiviral à la rangée pour identifier les protéines qui régulent les facteurs de transcription dans les cellules cancéreuses. Dans cet essai, les shARN qui ciblent les gènes cancéreux sont livrés aux cellules cancéreuses des mammifères par transduction lentivirale et les cellules sont sélectionnées pour une intégration stable à l’aide de puromycine. Les cellules sont ensuite transfected avec une construction de journaliste qui exprime la luciferase de luciole conduite par un promoteur spécifique au facteur de transcription qui est étudié et une construction de contrôle qui exprime Renilla luciferase d’un promoteur constitutivement actif qui n’est pas sensible au facteur de transcription à l’étude. Nous démontrons cette approche avec un écran de preuve de concept pour les régulateurs de YAP et TAZ, les effecteurs en aval critiques de la voie Hippo8,10,11. L’activité anormale de YAP et TAZ favorise plusieurs étapes de la cascade métastatique11 et est observée dans de nombreux cancers11,12,13. Cependant, la façon dont YAP et TAZ deviennent activés aberrantement dans certaines cellules cancéreuses n’est pas encore entièrement comprise. YAP et TAZ ne lient pas l’ADN, mais sont plutôt recrutés pour les promoteurs par d’autres facteurs de transcription. Les membres de la famille de facteurs de transcription du domaine TEA (TEAD) sont les principaux partenaires contraignants de YAP et de TAZ, et sont essentiels pour la plupart des fonctions dépendantes du YAP et de la TAZ. Notre construction reporter exprime luciferase luciole d’un promoteur YAP/TAZ-TEAD-sensible et des études précédentes ont démontré qu’il détecte fidèlement les changements dans YAP-TEAD et TAZ-TEAD activité transcriptionnelle2,14,15.
Notre approche est rapide, à débit moyen, et ne nécessite pas d’installations de dépistage, de robots automatisés ou de séquençage profond des bibliothèques mises en commun. Les coûts sont relativement bas et il y a de nombreuses bibliothèques disponibles dans le commerce à choisir. L’équipement et les réactifs requis sont également relativement standard dans la plupart des laboratoires. Il peut être utilisé pour dépister les régulateurs de pratiquement n’importe quel facteur de transcription si un journaliste basé sur la luciferase existe ou est généré. Nous utilisons cette approche pour dépister les shARN dans les cellules cancéreuses, mais toute lignée cellulaire qui peut être transfected avec une efficacité raisonnable pourrait être utilisé avec n’importe quel type de bibliothèque à réseau.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>2.0 ml 96-well deep well polypropylene plate</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1896-2000</td>
			<td>For bacterial mini-prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin - 2.50%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td>Component of trypsin-EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat bottom white assay plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3922</td>
			<td>For dual-luciferase assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin - 100 mg/ml</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>45-10835242001-EA</td>
			<td>For bacterial mini-prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto-tryptone - powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>95039</td>
			<td>Component of LB broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-luciferase reporter assay system, which include LAR II reagent (reagent A), Stop &#38; Glo substrate (reagent B substrate) and Stop &#38; Glo buffer (reagent B buffer) - Kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1960</td>
			<td>For dual-luciferase assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline w/o calcium, magnesium and phenol red - 9.6 g/L</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>TS1006</td>
			<td>For PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA - 0.5 M</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-406</td>
			<td>Component of trypsin-EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol - 100%</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td>111000200</td>
			<td>For bacterial mini-prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum - 100%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97068-085</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine bromide (Polybrene) - 8 mg/ml</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>45-H9268</td>
			<td>For virus infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone DMEM/High glucose - 4 mM L-Glutamine; 4500 mg/L glucose; sodium pyruvate</td>
			<td>GE Healthcare life sciences</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td></td>
			<td>For dual-luciferase assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine - 200 mM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 (Transfection Reagent 2) - 100%</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>L3000008</td>
			<td>For transfections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Biology Water - 100%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>02-0201-0500</td>
			<td>For dilution of shRNA vector for virus packaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl - powder</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH9286</td>
			<td>Component of LB broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td></td>
			<td>For measuring vector DNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM (Transfection Buffer) - 100%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-062</td>
			<td>For transfections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin - 10,000 Unit/ml (Penicillin); 10,000 &#181;g/ml (Streptomycin)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit - Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K210010</td>
			<td>For bacterial mini-prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin - 2.5 mg/ml</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>45-P7255</td>
			<td>For antibiotic selection after infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20 automated cell counter</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (Transfection Reagent 1) - 100%</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6365787001</td>
			<td>For virus packaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract - powder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>J850</td>
			<td>Component of LB broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P3000 (Transfection Reagent 3) - 100%</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>L3000008</td>
			<td>For transfections</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of transcription factor regulators using medium-throughput screening of arrayed libraries and a dual-luciferase-based reporter

Les facteurs de transcription peuvent modifier l’expression de nombreux gènes cibles qui influencent une variété de processus en aval, ce qui en fait de bonnes cibles pour les thérapies anticancéreuses. Cependant, le ciblage direct des facteurs de transcription est souvent difficile et peut causer des effets secondaires indésirables si le facteur de transcription est nécessaire dans un ou plusieurs tissus adultes. Identifier les régulateurs en amont qui activent aberrantement les facteurs de transcription dans les cellules cancéreuses offre une alternative plus faisable, en particulier si ces protéines sont faciles à droguer. Ici, nous décrivons un protocole qui peut être utilisé pour combiner les bibliothèques de lentiviral à moyenne échelle et un essai de reporter transcriptionnel à double base de luciferase pour identifier de nouveaux régulateurs des facteurs de transcription dans les cellules cancéreuses. Notre approche offre un moyen rapide, facile et peu coûteux de tester des centaines de gènes dans une seule expérience. Pour démontrer l’utilisation de cette approche, nous avons effectué un écran d’une bibliothèque RNAi lentiviral à la sélection contenant plusieurs régulateurs de protéines associées au Oui (YAP) et co-activateur transcriptionnel avec le motif de liaison PDZ (TAZ), deux co-activateurs transcriptionnels qui sont les effecteurs en aval de la voie Hippo. Toutefois, cette approche pourrait être modifiée pour dépister les organismes de réglementation de pratiquement n’importe quel facteur de transcription ou co-facteur et pourrait également être utilisée pour filtrer les bibliothèques CRISPR/CAS9, cDNA ou ORF.

Notre construction de reporter YAP/TAZ-TEAD (pGL3-5xMCAT (SV)-492,14,15) contient un promoteur SV-49 minimal avec 5 répétitions de l’élément de liaison canonique TEAD (MCAT)15 conduisant le gène luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de la luciole(f...

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Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter

Pour identifier de nouveaux régulateurs des facteurs de transcription, nous avons développé une approche pour dépister les bibliothèques de RNAi lentiviral ou rétroviral à l’écran à l’aide d’un essai de reporter transcriptionnel à double base de luciferase. Cette approche offre un moyen rapide et relativement peu coûteux de filtrer des centaines de candidats dans une seule expérience.

Identification des régulateurs des facteurs de transcription à l’aide du dépistage à débit moyen des bibliothèques à débit moyen et d’un reporter à double luciferase

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for ...

Ce protocole peut être utilisé pour filtrer les bibliothèques d’analyse lentiviral ou rétroviral rangées afin d’identifier de nouveaux régulateurs des facteurs de transcription dans les cellules cancéreuses. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle est rapide, à débit moyen et peu coûteuse, et qu’elle utilise de l’équipement et des reagents couramment accessibles à la plupart des chercheurs. Pour agrandir et purifier chaque vecteur lentiviral de la bibliothèque, ajoutez d’abord 1,3 millilitres de bouillon Luria complétés par 100 microgrammes par millilitre d’ampicilline à chaque puits d’une plaque de puits profonde de 96 puits.Inoculer chaque puits avec deux microlitres de stock de glycérol pour une incubation d’une nuit à 37 degrés Celsius et 225 révolutions par minute. Le lendemain, transférez chaque culture bactérienne dans des tubes individuels de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre pour centrifugation. Purifiez chaque vecteur avec un kit de miniprep bactérien approprié selon les instructions du fabricant.Pour chaque vecteur de la bibliothèque préparée, ensemencer un puits d’une plaque de 24 puits avec une fois 10 à la cinquième cellule 293FT et incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 24 heures. Pour préparer un mélange de transfection qui sera mis en place pour chaque vecteur de la bibliothèque, étiez d’abord chaque vecteur lentiviral à une concentration finale de 50 nanogrammes par microlitre avec de l’eau sans nucléase. Transférer cinq microlitres de chaque dilution dans des puits individuels d’une plaque PCR de 96 puits.Faire un super mix transfection en mélangeant 1,25 microlitres fois x de réacoupage de transfection avec 23,75 microlitres fois x de tampon transfection préchauffé. Incuber le super mélange transfection à température ambiante pendant cinq minutes. Ajoutez ensuite 125 nanogrammes x de psPAX2 et 125 nanogrammes x de VSVG au super mix avec pipetting doux.Immédiatement aliquot le super mélange dans chaque tube d’une bande PCR et utiliser une pipette multicanal pour transférer 25 microlitres du mélange dans chaque puits de vecteur viral dilué. Après une incubation de 20 minutes à température ambiante, utilisez une pipette multicanal pour transférer 30 microlitres de chaque mélange de transfection de chaque puits dans un puits correspondant de 293 FT dans la plaque de 24 puits précédemment préparée. Incuber les cellules pendant 24 heures avant de remplacer le milieu de chaque puits par 500 microlitres de milieu de croissance complet frais pour une autre incubation de 24 heures dans l’incubateur de culture cellulaire.Le lendemain, utilisez une pipette multicanal pour recueillir le supernatant viral de chaque puits et aliquot 220 microlitres de chaque supernatant dans deux puits dans une nouvelle plaque de 96 puits pour générer une plaque virale surnatante rangée. Pour préparer les cellules A375 à l’infection, semer une fois 10 à la cinquième cellule dans une plaque de 24 puits dans 0,5 millilitres de milieu de croissance complet par puits pour chaque vecteur viral de la bibliothèque. Inclure un puits supplémentaire qui ne sera pas infecté pour servir de contrôle pour la sélection des médicaments.Après une incubation de 24 heures dans l’incubateur de culture cellulaire, décongeler le supernatant lentiviral uni congelé réglé à température ambiante avant de remplacer le milieu de croissance de chaque puits de la plaque de culture cellulaire préparée par 200 microlitres de milieu de croissance complétés par 20 microgrammes par millilitre de polybrene. À l’aide d’une pipette multicanal, transférer 200 microlitres de supernatant viral de chaque puits de 96 à chaque puits de la plaque de 24 puits. Retourner les cellules dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 24 à 48 heures.À la fin de l’incubation, remplacer le milieu de chaque puits par 500 microlitres de milieu de croissance complétés par de la puromycine et retourner les cellules à l’incubateur de culture cellulaire pendant 48 heures supplémentaires. Après la sélection de puromycine de 48 heures, trier les cellules en trois ou quatre groupes de sorte que tous les puits d’un seul groupe ont une densité cellulaire similaire et ajouter 200 microlitres de trypsine-EDTA à un puits représentatif de chaque groupe pour une incubation de cinq minutes à 37 degrés Celsius. Une fois que les cellules se sont détachées, neutralisez la trypsine avec 400 microlitres de milieu de croissance complétés par de la puromycine et comptez le nombre de cellules de chaque puits trypsinisé.Diluer chaque suspension cellulaire à deux fois 10 à la cinquième cellule par concentration millilitre avec un milieu de croissance complété par de la puromycine et des graines 500 microlitres de cellules de chaque puits dans la même position de puits dans une nouvelle plaque de 24 puits. Après avoir utilisé les dénombrements de chaque puits représentatif pour estimer le nombre de cellules dans chaque puits restant dans chaque groupe, ajouter le volume approprié de trypsine-EDTA à chaque puits pour atteindre une fois 10 à la sixième cellule par concentration millilitre. Pendant la trypsinisation, utilisez une pipette multicanal pour ajouter 400 microlitres de milieu de croissance complétés par de la puromycine aux puits correspondants appropriés dans la nouvelle plaque de 24 puits.Une fois que les cellules se sont détachées, mélanger délicatement le contenu de chaque puits et transférer 100 microlitres de chaque suspension cellulaire au puits correspondant approprié dans la nouvelle plaque de 24 puits. Retournez ensuite les cellules à l’incubateur de culture cellulaire pendant 24 heures. Pour transfecter les cellules avec les constructions du journaliste à double luciferase, préparez le mélange de dilution de la transfection tel qu’indiqué dans le tableau.Pour préparer le mélange de dilution reporter, mélanger les volumes de chaque reagent multiplié par le nombre total de transfections plus plusieurs volumes supplémentaires. Ensuite, mélanger le mélange de dilution transfection avec le mélange de dilution reporter et incuber la solution résultante à température ambiante pendant 15 minutes pour produire le mélange de transfection. Pendant l’incubation, rincer chaque puits de la plaque de culture cellulaire avec 250 microlitres de PBS et ajouter 447 microlitres de milieu de croissance complet frais à chaque puits.Ensuite, utilisez une pipette multicanal pour distribuer 53 microlitres de mélange de transfection à chaque puits de la plaque de culture cellulaire. Placez la plaque à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 24 heures. Pour mesurer l’activité de la luciferase, diluer le tampon de lyse passive 5X de la trousse d’activité de luciferase à une dilution d’un à cinq avec de l’eau déionisée et décongeler les volumes nécessaires de tampon réageni A et de tampon réapprovisionnement B du kit.Lorsque les reagents sont prêts, remplacer le supernatant dans chaque puits par 75 microlitres de tampon de lyse passive et incuber la plaque pendant 30 minutes à température ambiante par des secousses occasionnelles. Pendant l’incubation, diluer le substrat B du réaccente 50X du kit à une concentration d’un à 50 avec tampon B décongelé. À la fin de l’incubation, ajouter 30 microlitres de tampon de lyse passive à quatre puits de contrôle vierges et transférer 30 microlitres de lysate de chaque puits dans des puits en double d’une plaque blanche à fond plat de 96 puits.Lorsque tout le lysate a été plaqué, utilisez une pipette multicanal pour ajouter 50 microlitres de réaccente A à chaque puits et lire le signal luciferase firefly avec un lecteur de plaque. Ensuite, utilisez une pipette multicanal pour ajouter 50 microlitres de réaccente B à chaque puits et lire le signal Renilla luciferase avec un lecteur de plaque. Comme prévu, YAP2SA augmente l’activité de luciferase de luciferase mais pas l’activité de Luciferase de Renilla par rapport au vecteur de lutte.En revanche, YAP2SA S94A n’augmente pas l’activité luciferase firefly. Fait important, YAP2SA ne modifie pas l’activité d’une construction de promoteur minimal qui n’a pas les éléments de liaison MCAT TEAD. Dans les cellules transfectées avec la construction de journaliste YAP-TAZ-TEAD, le tandem YAP et TAZ cheveux courts considérablement réduit les niveaux de luciferase luciferase firefly, mais le contrôle de contrôle de non-ciblage en épingle à cheveux courte ne le fait pas.En revanche, dans les cellules transfectées avec la construction minimale de journaliste, l’ARN court d’épingle à cheveux de YAP-TAZ ne modifie pas significativement des niveaux de luciferase de luciferase de firefly. Le signal Renilla dans chaque puits n’est pas non plus modifié de manière significative par le contrôle de non-ciblage en épingle à cheveux courte ou l’ARN en épingle à cheveux courte YAP-TAZ. Comme prévu, les ARN à épingle à cheveux courtes ciblant yap et TAZ, SARC ou PI3 kinase réduit considérablement l’activité YAP-TAZ-TEAD.Les ARN à épingle à cheveux courtes ciblant les ATM, CDH1, CSK, ERBB2 et gelsolin ont chacun augmenté les niveaux normalisés de luciferase de l’effiole de feu conformément aux études publiées montrant que ces protéines étaient YAP et/ou TAZ. En dépit des rôles établis pour ATR, CCNE2, et ERBB4 dans d’autres types de cellules, les ARN courts d’épingle à cheveux ciblant ces gènes ne changent pas significativement les niveaux normalisés de luciferase de lucifère de luciferase dans les cellules d’A375. À la suite de cet écran, l’identification des régulateurs doit être validée à l’aide d’autres lectures pour leur activité de facteur de transcription.Le renversement effectif de l’organisme de réglementation identifié par l’essai devrait également être confirmé. N’oubliez pas de faire preuve de prudence et de suivre les directives de sécurité lorsque vous travaillez avec des lentivirus infectieux, en particulier si les virus sont infectieux pour l’homme.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification

Section des pansements mammaires complets pour l&#39;identification des lésions

Normal mammary gland development may be altered by exposure to environmental toxicants and pharmaceutical products, excessive exposure to hormones, and ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

Médicament à base de cytométrie en flux système de contrôle pour l’Identification de petites molécules qui favorisent la différenciation cellulaire des cellules souches de glioblastome

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

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Imagerie cellulaire de la TGF-β/Smad3 signalisation Pathway In Vitro et In Vivo à l’aide d’un adénovirus journaliste système en direct

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Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...

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Recent advances in cancer research has illustrated the highly complex nature of cancer metastasis. Multiple genes or genes networks have been found to be ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

Un flux de travail de dépistage rapide pour identifier la thérapie combinée potentielle pour le GBM à l’aide de cellules souches de gliome dérivées du patient

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...