Name: identification of transcription factor regulators using medium-throughput screening of arrayed libraries and a dual-luciferase-based reporter
Uploaded: 2020-03-27T13:00:00
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Wir danken Emily Norton und Mikaelan Cucciarre-Stuligross für die Unterstützung bei der Herstellung von shRNA-Vektoren. Diese Arbeit wurde teilweise von einem Susan G. Komen Career Catalyst Grant unterstützt, der J.M.L. (#CCR17477184) verliehen wurde.

HINWEIS: Eine schematische Zusammenfassung dieses Protokolls ist in Abbildung 1dargestellt.
1. Lentivirale Vektorbibliotheksvorbereitung
HINWEIS: Der demonstrierte Bildschirm verwendete eine angeordnete shRNA-Bibliothek, die als Glycerinbestände in 96-Well-Platten gekauft wurde, aber Bibliotheken können auch manuell basierend auf einer Kandidatenliste zusammengestellt werden. Entsprechende Kontrollen sollten in Betracht gezogen und in j...

In dieser Studie zeigen wir einen Ansatz für das Medium-Throughput-Screening von arrayed viralen Bibliotheken in Kombination mit einem auf Dual-Luciferase basierenden Transkriptionsreporter-Assay, der verwendet werden kann, um neuartige Regulatoren von Transkriptionsfaktoren zu identifizieren und zu testen. Es ist wichtig, das Reportersystem für jede Zelllinie vor jedem Bildschirm zu charakterisieren und zu optimieren. Es sollten Experimente durchgeführt werden, um zu bestätigen, dass der Reporter auf die veränderte...

Der Zweck dieses Assays ist es, virale Bibliotheken zu verwenden, um Regulatoren von Transkriptionsfaktoren relativ schnell und kostengünstig zu identifizieren. Aberrante Transkriptionsaktivität ist mit Krebs und Metastasen1,2,3,4,5,6, so Targeting Transkriptionsfaktoren in Krebszellen ist ein vielversprechender therapeutischer Ansatz verbunden. Jedoch, Transkriptionsfaktoren sind oft schwierig, pharmakologisch7 und viele sind für die normale zelluläre Funktion in erwachsenen Geweben8,9,10erforderlich. Die Krebswege, die Abschreibfaktoren zur Krankheitsantrieb aktivieren, ist ein praktikablerer Ansatz mit dem Potenzial, weniger schwere Nebenwirkungen zu haben. Die kommerzielle Verfügbarkeit von arrayierten lentiviralen und retroviralen RNAi-, CRISPR/CAS9-, cDNA- oder ORF-Bibliotheken ermöglicht es Forschern, die Bedeutung zahlreicher Gene in einem einzigen Experiment zu testen. Es ist jedoch eine zuverlässige Auslesung für geänderte Transkriptionsaktivitäten erforderlich.
Hier beschreiben wir die Verwendung eines auf Dual-Luciferase basierenden Transkriptions-Reporter-Assays und arrayed lentiviralen Bibliotheken, um Proteine zu identifizieren, die Transkriptionsfaktoren in Krebszellen regulieren. In diesem Test werden shRNAs, die auf krebsassoziierte Gene abzielen, über lentivirale Transduktion an Säugetierkrebszellen abgegeben und Zellen für eine stabile Integration mit Puromycin ausgewählt. Die Zellen werden als nächstes mit einem Reporterkonstrukt transfiziert, das gnädige Luziferase ausdrückt, die von einem Promotor angetrieben wird, der spezifisch für den Transkriptionsfaktor ist, der untersucht wird, und einem Kontrollkonstrukt, das Renilla luziferase von einem konstitutiven aktiven Promotor ausdrückt, der nicht auf den untersuchten Transkriptionsfaktor reagiert. Wir demonstrieren diesen Ansatz mit einem Proof-of-Concept-Bildschirm für Diebesregler von YAP und TAZ, den kritischen Nachgeschalteten Effektoren des Hippo-Signalwegs8,10,11. Abnormale Aktivität von YAP und TAZ fördert mehrere Schritte der metastasierenden Kaskade11 und wird bei vielen Krebsarten beobachtet11,12,13. Wie YAP und TAZ in einigen Krebszellen abwegig aktiviert werden, ist jedoch noch nicht vollständig geklärt. YAP und TAZ binden keine DNA, sondern werden durch andere Transkriptionsfaktoren an Promoter rekrutiert. Mitglieder der TEA-Domain-Familie (TEAD) der Transkriptionsfaktoren sind die wichtigsten Bindungspartner für YAP und TAZ und für die meisten YAP- und TAZ-abhängigen Funktionen von entscheidender Bedeutung. Unser Reporterkonstrukt drückt Gofagifuifase aus einem YAP/TAZ-TEAD-responsiven Promotor aus und frühere Studien haben gezeigt, dass es Veränderungen in YAP-TEAD und TAZ-TEAD Transkriptionsaktivitätgetreuerkennt 2,14,15.
Unser Ansatz ist schnell, mittlerer Durchsatz und erfordert keine Screening-Einrichtungen, automatisierte Roboter oder eine tiefe Sequenzierung von gepoolten Bibliotheken. Die Kosten sind relativ gering und es gibt zahlreiche kommerziell verfügbare Bibliotheken zur Auswahl. Die erforderlichen Geräte und Reagenzien sind auch in den meisten Laboratorien relativ Standard. Es kann verwendet werden, um für Regulatoren von praktisch jedem Transkriptionsfaktor zu überprüfen, wenn ein luziferase-basierter Reporter existiert oder generiert wird. Wir verwenden diesen Ansatz, um shRNAs in Krebszellen zu überprüfen, aber jede Zelllinie, die mit angemessener Effizienz transfiziert werden kann, könnte mit jeder Art von arrayed Bibliothek verwendet werden.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>2.0 ml 96-well deep well polypropylene plate</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1896-2000</td>
			<td>For bacterial mini-prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin - 2.50%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td>Component of trypsin-EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat bottom white assay plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3922</td>
			<td>For dual-luciferase assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin - 100 mg/ml</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>45-10835242001-EA</td>
			<td>For bacterial mini-prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto-tryptone - powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>95039</td>
			<td>Component of LB broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-luciferase reporter assay system, which include LAR II reagent (reagent A), Stop &#38; Glo substrate (reagent B substrate) and Stop &#38; Glo buffer (reagent B buffer) - Kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1960</td>
			<td>For dual-luciferase assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline w/o calcium, magnesium and phenol red - 9.6 g/L</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>TS1006</td>
			<td>For PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA - 0.5 M</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-406</td>
			<td>Component of trypsin-EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol - 100%</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td>111000200</td>
			<td>For bacterial mini-prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum - 100%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97068-085</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine bromide (Polybrene) - 8 mg/ml</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>45-H9268</td>
			<td>For virus infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone DMEM/High glucose - 4 mM L-Glutamine; 4500 mg/L glucose; sodium pyruvate</td>
			<td>GE Healthcare life sciences</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td></td>
			<td>For dual-luciferase assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine - 200 mM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 (Transfection Reagent 2) - 100%</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>L3000008</td>
			<td>For transfections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Biology Water - 100%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>02-0201-0500</td>
			<td>For dilution of shRNA vector for virus packaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl - powder</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH9286</td>
			<td>Component of LB broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td></td>
			<td>For measuring vector DNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM (Transfection Buffer) - 100%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-062</td>
			<td>For transfections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin - 10,000 Unit/ml (Penicillin); 10,000 &#181;g/ml (Streptomycin)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit - Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K210010</td>
			<td>For bacterial mini-prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin - 2.5 mg/ml</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>45-P7255</td>
			<td>For antibiotic selection after infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20 automated cell counter</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (Transfection Reagent 1) - 100%</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6365787001</td>
			<td>For virus packaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract - powder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>J850</td>
			<td>Component of LB broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P3000 (Transfection Reagent 3) - 100%</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>L3000008</td>
			<td>For transfections</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of transcription factor regulators using medium-throughput screening of arrayed libraries and a dual-luciferase-based reporter

Transkriptionsfaktoren können die Expression zahlreicher Zielgene verändern, die eine Vielzahl von nachgelagerten Prozessen beeinflussen und sie zu guten Zielen für Krebstherapien machen. Jedoch, direkt auf Transkriptionsfaktoren ist oft schwierig und kann Nebenwirkungen verursachen, wenn der Transkriptionsfaktor in einem oder mehreren erwachsenen Geweben notwendig ist. Die Identifizierung vorgelagerter Regulatoren, die Transkriptionsfaktoren in Krebszellen abnorm aktivieren, bietet eine praktikablere Alternative, insbesondere wenn diese Proteine leicht zu medikamentieren sind. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das verwendet werden kann, um arrayed mittelgroße lentivirale Bibliotheken und eine dual-luciferase-basierte Transkriptionsreporter-Assay zu kombinieren, um neue Regulatoren von Transkriptionsfaktoren in Krebszellen zu identifizieren. Unser Ansatz bietet eine schnelle, einfache und kostengünstige Möglichkeit, Hunderte von Genen in einem einzigen Experiment zu testen. Um die Verwendung dieses Ansatzes zu demonstrieren, führten wir einen Bildschirm einer arrayed lentiviralEN RNAi-Bibliothek durch, die mehrere Regulatoren von Yes-associated protein (YAP) und transkriptionskoaktivator mit PDZ-Bindungsmotiv (TAZ) enthält, zwei transkriptionelle Co-Aktivatoren, die die nachgeschalteten Effektoren des Hippo-Signalwegs sind. Dieser Ansatz könnte jedoch geändert werden, um regler für praktisch jeden Transkriptionsfaktor oder Co-Faktor zu überprüfen und könnte auch zum Screenen von CRISPR/CAS9-, cDNA- oder ORF-Bibliotheken verwendet werden.

Unser YAP/TAZ-TEAD Reporterkonstrukt (pGL3-5xMCAT (SV)-492,14,15) enthält einen minimalen SV-49 Promoter mit 5 Wiederholungen des kanonischen TEAD-Bindungselements (MCAT)15, das das Gahngluciferase-Gen antreibt ( Abbildung1). Es wird zusammen mit dem PRL-TK-Kontrollvektor (Promega), der Renilla luziferase aus dem konstitutiv aktiven ...

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Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter

Um neue Regulatoren von Transkriptionsfaktoren zu identifizieren, entwickelten wir einen Ansatz für die Bildschirmanordnung von lentiviralen oder retroviralen RNAi-Bibliotheken unter Verwendung eines auf Dual-Luciferase basierenden Transkriptions-Reporter-Assays. Dieser Ansatz bietet eine schnelle und relativ kostengünstige Möglichkeit, Hunderte von Kandidaten in einem einzigen Experiment zu überprüfen.

Identifizierung von Transkriptionsfaktor-Regulierern mit Medium-Throughput-Screening von Arrayed Libraries und einem Dual-Luciferase-basierten Reporter

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for ...

Dieses Protokoll kann verwendet werden, um arrayed lentivirale oder retrovirale Assay-Bibliotheken zu überprüfen, um neuartige Regulatoren von Transkriptionsfaktoren in Krebszellen zu identifizieren. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass sie schnell, mittlerer Durchsatz und kostengünstig ist und geräte und Reagenzien verwendet, die für die meisten Forscher allgemein zugänglich sind. Um jeden lentiviralen Vektor in der Bibliothek zu erweitern und zu reinigen, fügen Sie zunächst 1,3 Milliliter Luria-Brühe hinzu, ergänzt mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin in jeden Brunnen einer 96-Well-Tiefenbrunnenplatte.Impfen Sie jeden Brunnen mit zwei Mikroliter Glyzerin-Lager für eine nächtliche Inkubation bei 37 Grad Celsius und 225 Umdrehungen pro Minute. Übertragen Sie am nächsten Tag jede Bakterienkultur in einzelne 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhren zur Zentrifugation. Reinigen Sie jeden Vektor mit einem geeigneten bakteriellen Miniprep-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.Für jeden Vektor in der vorbereiteten Bibliothek einen Brunnen einer 24-Well-Platte mit einem mal 10 bis fünften 293FT-Zellen säen und die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 24 Stunden inkubieren. Um ein Transfektionsgemisch vorzubereiten, das für jeden Vektor in der Bibliothek eingerichtet wird, wird zunächst jeder lentivirale Vektor zu einer Endkonzentration von 50 Nanogramm pro Mikroliter mit nukleasefreiem Wasser deute. Übertragen Sie fünf Mikroliter jeder Verdünnung in einzelne Brunnen einer 96-Well-PCR-Platte.Machen Sie eine Transfektion Super-Mix durch Mischen 1,25 Mikroliter mal x Transfektion Reagenz eins mit 23,75 Mikroliter mal x vorgewärmten Transfektionpuffer. Inkubieren Sie die Transfektion Super-Mix bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Dann fügen Sie 125 Nanogramm mal x psPAX2 und 125 Nanogramm mal x VSVG in den Supermix mit sanfter Pipettierung.Sofort aliquot die Super-Mix in jede Röhre eines PCR-Streifen und verwenden Sie eine Mehrkanal-Pipette, um 25 Mikroliter der Mischung in jeden Brunnen des verdünnten viralen Vektor zu übertragen. Nach einer 20-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur mit einer Mehrkanalpipette 30 Mikroliter jedes Transfektionsgemisches aus jedem Brunnen in einen entsprechenden Brunnen von 293FT-Zellen in der zuvor vorbereiteten 24-Well-Platte übertragen. Inkubieren Sie die Zellen für 24 Stunden, bevor Sie das Medium in jedem Brunnen durch 500 Mikroliter frisches komplettes Wachstumsmedium für eine weitere 24-Stunden-Inkubation im Zellkultur-Inkubator ersetzen.Verwenden Sie am nächsten Tag eine Mehrkanalpipette, um den viralen Überstand aus jedem Brunnen zu sammeln und 220 Mikroliter jedes Überstands in zwei Brunnen in einer neuen 96-Well-Platte zu sammeln, um eine angeordnete virale Überstandplatte zu erzeugen. Um A375-Zellen auf eine Infektion vorzubereiten, samen Sie einmal 10 bis fünf Zellen in einer 24-Well-Platte in 0,5 Milliliter vollständigem Wachstumsmedium pro Brunnen für jeden viralen Vektor in der Bibliothek. Fügen Sie einen zusätzlichen Brunnen, der nicht infiziert werden, um als Kontrolle für die Medikamentenauswahl dienen.Nach einer 24-stündigen Inkubation im Zellkultur-Inkubator tauen Sie den gefrorenen, auf Raumtemperatur eingestellten lentierten Lentiviral-Überflieger auf, bevor das Wachstumsmedium aus jedem Brunnen der vorbereiteten Zellkulturplatte durch 200 Mikroliter Wachstumsmedium ersetzt wird, ergänzt um 20 Mikrogramm pro Milliliter Polybren. Übertragen Sie mit einer Mehrkanalpipette 200 Mikroliter viralen Überstand von jedem 96-Brunnen auf jeden Brunnen der 24-Well-Platte. Geben Sie die Zellen für 24 bis 48 Stunden in den Zellkultur-Inkubator zurück.Am Ende der Inkubation, ersetzen Sie das Medium in jedem Brunnen mit 500 Mikroliter Wachstumsmedium mit Puromycin ergänzt und die Zellen in den Zellkultur-Inkubator für weitere 48 Stunden zurück. Nach der 48-stündigen Puromycin-Auswahl sortieren Sie die Zellen in drei oder vier Gruppen, so dass alle Brunnen in einer einzigen Gruppe eine ähnliche Zelldichte haben, und fügen Sie 200 Mikroliter Trypsin-EDTA zu einem repräsentativen Gut aus jeder Gruppe für eine fünfminütige Inkubation bei 37 Grad Celsius hinzu. Sobald sich die Zellen gelöst haben, neutralisieren Sie das Trypsin mit 400 Mikroliter Wachstumsmedium mit Puromycin ergänzt und zählen die Anzahl der Zellen aus jedem Trypsinized gut.Verdünnen Sie jede Zellsuspension auf eine zwei mal 10 bis die fünfte Zelle pro Milliliter Konzentration mit Wachstumsmedium mit Puromycin und Samen 500 Mikroliter Zellen aus jedem Brunnen in die gleiche Brunnenposition in einer neuen 24-Well-Platte ergänzt. Nach der Verwendung der Zählungen aus jedem repräsentativen Brunnen, um die Zellzahl in jedem verbleibenden Brunnen in jeder Gruppe zu schätzen, fügen Sie das entsprechende Volumen von Trypsin-EDTA zu jedem Brunnen hinzu, um eine ein mal 10 bis die sechste Zelle pro Milliliter Konzentration zu erreichen. Verwenden Sie während der Trypsinisierung eine Mehrkanalpipette, um 400 Mikroliter Wachstumsmedium, ergänzt mit Puromycin, in die entsprechenden brunnen in der neuen 24-Well-Platte hinzuzufügen.Sobald sich die Zellen gelöst haben, mischen Sie vorsichtig den Inhalt jedes Brunnens und übertragen Sie 100 Mikroliter jeder Zellsuspension in den entsprechenden Korbrunnen in der neuen 24-Well-Platte. Dann kehren Sie die Zellen für 24 Stunden in den Zellkultur-Inkubator zurück. Um die Zellen mit den Dual-Luciferase-Reporterkonstrukten zu transfekieren, bereiten Sie die in der Tabelle angegebene Transfektionsverdünnungsmischung vor.Um die Verdünnungsmischung des Reporters vorzubereiten, mischen Sie die Volumina jedes Reagenzes multipliziert mit der Gesamtzahl der Transfektionen plus mehreren zusätzlichen Volumina. Als nächstes mischen Sie die Transfektionsverdünnungsmischung mit dem Reporter-Verdünnungsgemisch und inkubieren Sie die resultierende Lösung bei Raumtemperatur für 15 Minuten, um die Transfektionsmischung zu produzieren. Während der Inkubation spülen Sie jeden Brunnen der Zellkulturplatte mit 250 Mikroliter PBS ab und fügen Sie jedem Brunnen 447 Mikroliter frisches komplettes Wachstumsmedium hinzu.Verwenden Sie dann eine Mehrkanalpipette, um 53 Mikroliter Transfektionsmischung auf jeden Brunnen der Zellkulturplatte zu verteilen. Legen Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 24 Stunden. Um die Luziferaseaktivität zu messen, verdünnen Sie den 5X passiven Lysepuffer aus dem Luziferase-Aktivitätskit bei einer Ein-zu-Fünf-Verdünnung mit entionisiertem Wasser und tauen Sie die notwendigen Volumina von Reagenz A und Reagenz B-Puffer aus dem Kit auf.Wenn die Reagenzien fertig sind, ersetzen Sie den Überstand in jedem Brunnen durch 75 Mikroliter passiver Lysepuffer und inkubieren Sie die Platte 30 Minuten bei Raumtemperatur mit gelegentlichem Schütteln. Während der Inkubation das 50-fache Reagenz-B-Substrat aus dem Kit auf eine Ein-50-Konzentration mit aufgetautem Reagenz-B-Puffer verdünnen. Am Ende der Inkubation 30 Mikroliter passiver Lysepuffer zu vier leeren Kontrollbrunnen hinzufügen und 30 Mikroliter Lysat aus jedem Brunnen in doppelte Brunnen einer 96-well flachen weißen Arschplatte übertragen.Wenn das gesamte Lysat plattiert ist, verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 50 Mikroliter Reagenz A zu jedem Brunnen hinzuzufügen und das Firefly-Luzifferase-Signal mit einem Plattenleser zu lesen. Verwenden Sie dann eine Mehrkanalpipette, um 50 Mikroliter Reagenz B zu jedem Brunnen hinzuzufügen und das Renilla-Luziferase-Signal mit einem Plattenleser zu lesen. Wie erwartet, YAP2SA erhöht Galleifeaktivität Aktivität, aber nicht Renilla Luziferase Aktivität im Vergleich zum Kontrollvektor.Im Gegensatz dazu erhöht YAP2SA S94A die Aktivität der Galleifeferase nicht. Wichtig ist, dass YAP2SA die Aktivität eines minimalen Promotorkonstrukts, dem die MCAT TEAD-Bindungselemente fehlen, nicht ändert. In Zellen, die mit dem YAP-TAZ-TEAD-Reporterkonstrukt transfiziert wurden, reduzierten die Tandem-Kurzhaarnadeln YAP und TAZ die Guplifly-Luziferase-Spiegel signifikant, die Kontrolle der kurzhaarigen Nicht-Targeting-Kontrolle jedoch nicht.Im Gegensatz dazu verändert die YAP-TAZ Kurzhaarnadel-RNA in Zellen, die mit dem minimalen Reporterkonstrukt transfiziert sind, den Galleifuifasespiegel nicht signifikant. Das Renilla-Signal in jedem Brunnen wird auch nicht signifikant durch die kurze Haarnadel-Nicht-Targeting-Kontrolle oder die YAP-TAZ-Kurzhaarnadel-RNA verändert. Wie erwartet reduzieren kurze Haarnadel-RNAs, die auf YAP und TAZ, SARC oder PI3-Kinase abzielen, die YAP-TAZ-TEAD-Aktivität erheblich.Kurze Haarnadel RNAs für ATM, CDH1, CSK, ERBB2, und Gelsolin jeweils erhöhte normalisierte Glühwürmchen Luziferase Spiegel im Einklang mit veröffentlichten Studien, die zeigen, dass diese Proteine YAP und /oder TAZ waren. Trotz etablierter Rollen für ATR, CCNE2 und ERBB4 in anderen Zelltypen, kurze Haarnadel-RNAs, die auf diese Gene abzielen, verändern nicht signifikant normalisierte Gob-Luziferase-Spiegel in A375-Zellen. Im Anschluss an diesen Bildschirm sollten die Identifizierungsregulatoren anhand anderer Auslesungen für ihre Transkriptionsfaktoraktivität validiert werden.Der effektive Abbau des identifizierten Reglers durch den Test sollte ebenfalls bestätigt werden. Denken Sie daran, Vorsicht walten zu lassen und Sicherheitsrichtlinien zu befolgen, wenn Sie mit infektiösen Lentiviren arbeiten, insbesondere wenn die Viren infektiös sind.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification

Sektion Mammary Gland Ganze Mounts für Läsion Identifizierung

Normal mammary gland development may be altered by exposure to environmental toxicants and pharmaceutical products, excessive exposure to hormones, and ...

Forschung

Krebsforschung

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

Flow Cytometry-based Drug Screening-System für die Identifizierung von kleinen Molekülen, die zelluläre Differenzierung von Stammzellen Glioblastom zu fördern

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

Live Cell Imaging of the TGF-	&beta;/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

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Live Cell Imaging der TGF-β/Smad3 Signalisierung Pathway In Vitro und In Vivo mit einem Adenovirus-Reporter-System

Transforming Growth Factor &#946; (TGF-&#946;) signaling regulates many important functions required for cellular homeostasis and is commonly found ...

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array (HMCA)-based Plates

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Analyse der Krebs Zellinvasion und anti-metastatischen Drogen-Screening mit Hydrogel Micro-Kammer Array (HMCA)-basierte Platten

Cancer metastasis is known to cause 90% of cancer lethality. Metastasis is a multistage process which initiates with the penetration/invasion of tumor ...

Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells

Isolierung von exosomenangereicherten extrazellulären Vesikeln, die Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor aus embryonalen Stammzellen tragen

Embryonic stem cells (ESCs) are pluripotent stem cells capable of self-renewal and differentiation into all types of embryonic cells. Like many other cell ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

Etablierung und Charakterisierung von kleinen Darm Neuroendokrinen Tumor Sphäriden

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

Kartierung der Struktur-Funktions-Beziehungen ungeordneter onkogener Transkriptionsfaktoren mittels Transkriptomanalyse

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

Identifizierung von EGFR- und RAS-Inhibitoren mittels Caenorhabditis elegans

The changes in the plasma membrane localization of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and its downstream effector RAS have been implicated in ...

Discovery of Metastatic Regulators using a Rapid and Quantitative Intravital Chick Chorioallantoic Membrane Model

Entdeckung metastasierender Regulatoren mit einem schnellen und quantitativen intravitalen Chick Chorioallantoic Membrane Model

Recent advances in cancer research has illustrated the highly complex nature of cancer metastasis. Multiple genes or genes networks have been found to be ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

Ein schneller Screening-Workflow zur Identifizierung einer potenziellen Kombinationstherapie für GBM unter Verwendung von vom Patienten abgeleiteten Gliomstammzellen

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...