Name: identification of transcription factor regulators using medium-throughput screening of arrayed libraries and a dual-luciferase-based reporter
Uploaded: 2020-03-27T13:00:00
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Ringraziamo Emily Norton e Mikaelan Cucciarre-Stuligross per aver assistito nella preparazione dei vettori shRNA. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da una Susan G. Komen Career Catalyst Grant che ha assegnato a J.M.L. (#CCR17477184).

NOTA: un riepilogo schematico di questo protocollo è illustrato nella Figura 1.
1. Preparazione della libreria vettoriale lentivirale
NOTA: lo schermo dimostrato ha utilizzato una libreria di shRNA disposti acquistati come scorte di glicerolo in piastre di 96 pozze, ma le librerie possono anche essere assemblate manualmente sulla base di un elenco di candidati. Controlli appropriati devono essere considerati e inclusi in qualsiasi librer...

In questo studio, dimostriamo un approccio per lo screening a medio velocità delle librerie virali di serie in combinazione con un saggio di reporter trascrizionale a doppia luciferasi che può essere utilizzato per identificare e testare nuovi regolatori di fattori di trascrizione. È fondamentale caratterizzare e ottimizzare il sistema di reporter per ogni riga di cella prima di qualsiasi schermata. Gli esperimenti dovrebbero essere fatti per confermare che il reporter risponde all'attività alterata del fattore di tr...

Lo scopo di questo saggio è quello di utilizzare librerie virali per identificare i regolatori di fattori di trascrizione in modo relativamente rapido e poco costoso. L'attività trascrizionale aberrante è associata al cancro e alla metastasi1,2,3,4,5,6, quindi prendere di mira i fattori di trascrizione nelle cellule tumorali è un promettente approccio terapeutico. Tuttavia, i fattori di trascrizione sono spesso difficili da indirizzare farmacologicamente7 e molti sono necessari per la normale funzione cellulare nei tessuti adulti8,9,10. Puntare sulle vie associate al cancro che attivano aberrante i fattori di trascrizione per guidare la malattia è un approccio più fattibile con il potenziale di avere effetti collaterali meno gravi. La disponibilità commerciale di librerie di RNAi lentivirali e retrovirali con matrice, CRISPR/CAS9, cDNA o ORF consente ai ricercatori di testare l'importanza di numerosi geni in un singolo esperimento. Tuttavia, è necessaria una lettura affidabile per l'attività trascrizionale alterata.
Qui, descriviamo l'uso di un saggio di saggio di prosaggio di un giornalista trascrizionale a doppia luciferasi e di librerie lentivirali di matrice per identificare le proteine che regolano i fattori di trascrizione nelle cellule tumorali. In questo saggio, gli shRNA che colpiscono i geni associati al cancro vengono consegnati alle cellule tumorali dei mammiferi tramite la trasduzione lentivirale e le cellule vengono selezionati per un'integrazione stabile utilizzando la micina. Le cellule vengono successivamente trascate con un costrutto reporter che esprime luciferasi di lucciole guidate da un promotore specifico per il fattore di trascrizione che viene studiato e un costrutto di controllo che esprime Renilla luciferasi da un promotore di vulcaniamente attivo che non risponde al fattore di trascrizione in fase di studio. Dimostriamo questo approccio con uno schermo proof-of-concept per i regolatori di YAP e TA, gli eftrattieri critici a valle del percorso Hippo8,10,11. L'attività anomala di YAP e TAz promuove diversi passaggi della cascata metastatica11 ed è osservata in molti tumori11,12,13. Tuttavia, il modo in cui YAP e TAa diventano attivati aberrantemente in alcune cellule tumorali non è ancora completamente compreso. YAP e TAA non legano il DNA, ma vengono reclutati per promuovere da altri fattori di trascrizione. I membri della famiglia di fattori di trascrizione del dominio TEA (TEAD) sono i principali partner di associazione per YAP e TAA e sono fondamentali per la maggior parte delle funzioni dipendenti da YAP e TAz. Il nostro costrutto reporter esprime luciferasi di lucciole da parte di un promotore yAP/TAz-TEAD-responsive e studi precedenti hanno dimostrato che rileva fedelmente i cambiamenti nell'attività trascrizionale YAP-TEAD2,14,15.
Il nostro approccio è rapido, medio-velocità, e non richiede strutture di screening, robot automatizzati, o sequenziamento profondo di librerie in pool. I costi sono relativamente bassi e ci sono numerose librerie disponibili in commercio tra cui scegliere. Le attrezzature e i reagenti necessari sono relativamente standard nella maggior parte dei laboratori. Può essere utilizzato per lo screening per i regolatori di praticamente qualsiasi fattore di trascrizione se un reporter basato su luciferate esiste o viene generato. Usiamo questo approccio per vagliare gli shRNA nelle cellule tumorali, ma qualsiasi linea cellulare che può essere trasfetata con una ragionevole efficienza potrebbe essere utilizzata con qualsiasi tipo di libreria in serie.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>2.0 ml 96-well deep well polypropylene plate</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1896-2000</td>
			<td>For bacterial mini-prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin - 2.50%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td>Component of trypsin-EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat bottom white assay plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3922</td>
			<td>For dual-luciferase assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin - 100 mg/ml</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>45-10835242001-EA</td>
			<td>For bacterial mini-prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto-tryptone - powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>95039</td>
			<td>Component of LB broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-luciferase reporter assay system, which include LAR II reagent (reagent A), Stop &#38; Glo substrate (reagent B substrate) and Stop &#38; Glo buffer (reagent B buffer) - Kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1960</td>
			<td>For dual-luciferase assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline w/o calcium, magnesium and phenol red - 9.6 g/L</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>TS1006</td>
			<td>For PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA - 0.5 M</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-406</td>
			<td>Component of trypsin-EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol - 100%</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td>111000200</td>
			<td>For bacterial mini-prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum - 100%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97068-085</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine bromide (Polybrene) - 8 mg/ml</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>45-H9268</td>
			<td>For virus infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone DMEM/High glucose - 4 mM L-Glutamine; 4500 mg/L glucose; sodium pyruvate</td>
			<td>GE Healthcare life sciences</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td></td>
			<td>For dual-luciferase assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine - 200 mM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 (Transfection Reagent 2) - 100%</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>L3000008</td>
			<td>For transfections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Biology Water - 100%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>02-0201-0500</td>
			<td>For dilution of shRNA vector for virus packaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl - powder</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH9286</td>
			<td>Component of LB broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td></td>
			<td>For measuring vector DNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM (Transfection Buffer) - 100%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-062</td>
			<td>For transfections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin - 10,000 Unit/ml (Penicillin); 10,000 &#181;g/ml (Streptomycin)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit - Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K210010</td>
			<td>For bacterial mini-prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin - 2.5 mg/ml</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>45-P7255</td>
			<td>For antibiotic selection after infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20 automated cell counter</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (Transfection Reagent 1) - 100%</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6365787001</td>
			<td>For virus packaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract - powder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>J850</td>
			<td>Component of LB broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P3000 (Transfection Reagent 3) - 100%</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>L3000008</td>
			<td>For transfections</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of transcription factor regulators using medium-throughput screening of arrayed libraries and a dual-luciferase-based reporter

I fattori di trascrizione possono alterare l'espressione di numerosi geni bersaglio che influenzano una varietà di processi a valle, rendendoli buoni bersagli per le terapie anti-cancro. Tuttavia, il targeting diretto dei fattori di trascrizione è spesso difficile e può causare effetti collaterali negativi se il fattore di trascrizione è necessario in uno o più tessuti adulti. Identificare i regolatori a monte che attivano aberrantei i fattori di trascrizione nelle cellule tumorali offre un'alternativa più fattibile, in particolare se queste proteine sono facili da sottofare. In questo articolo, descriviamo un protocollo che può essere utilizzato per combinare librerie di lentivirali di media portata in serie e un saggio di reporter trascrizionale a doppia luciferasi per identificare nuovi regolatori dei fattori di trascrizione nelle cellule tumorali. Il nostro approccio offre un modo rapido, semplice ed economico per testare centinaia di geni in un unico esperimento. Per dimostrare l'uso di questo approccio, abbiamo eseguito uno schermo di una libreria di RNAi lentivirale con array con diversi regolatori di proteine associate sì (YAP) e co-attivatore trascrizionale con motivo legante PD , due co-attivatori trascrizionali che sono gli effetti a valle del percorso di Ippona. Tuttavia, questo approccio potrebbe essere modificato per lo screening per i regolatori di praticamente qualsiasi fattore di trascrizione o co-fattore e potrebbe anche essere utilizzato per lo screening delle librerie CRISPR/CAS9, cDNA o ORF.

Il nostro costrutto reporter YAP/TAz-TEAD (pGL3-5xMCAT (SV)-492,14,15) contiene un promotore SV-49 minimo con 5 ripetizioni dell'elemento di legame TEAD canonico (MCAT)15 che guida il gene luciferasi della lucciola ( Figura1). È co-transfettato in cellule insieme al vettore di controllo PRL-TK (Promega), che esprime Renilla luciferat...

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Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter

Per identificare nuovi regolatori dei fattori di trascrizione, abbiamo sviluppato un approccio per lo screening delle librerie di arumani lentivirali o retrovirali con array utilizzando un saggio di reporter trascrizionale basato sulla doppia luciferasi. Questo approccio offre un modo rapido e relativamente poco costoso per vagliare centinaia di candidati in un unico esperimento.

Identificazione dei regolatori dei fattori di trascrizione mediante lo screening a media velocità di lettura di librerie in serie e un reporter basato su Dual-Luciferase

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for ...

Questo protocollo può essere utilizzato per schermare librerie di saggi lentivirali o retrovirali per identificare nuovi regolatori dei fattori di trascrizione nelle cellule tumorali. I principali vantaggi di questa tecnica sono che è rapida, media e poco costosa e che utilizza attrezzature e reagenti comunemente accessibili alla maggior parte degli investigatori. Per espandere e purificare ogni vettore lentivirale nella libreria, aggiungere prima 1,3 millilitri di brodo di Luria integrati con 100 microgrammi per millilitro di ampicillina ad ogni pozzo di una piastra di pozzo profonda 96 pozzi.Inoculare ogni bene con due microlitri di materiale glicerolo per un'incubazione notturna a 37 gradi Celsius e 225 giri al minuto. Il giorno successivo, trasferire ogni coltura batterica in singoli tubi di microcentrifugo da 1,5 millilitri per la centrifugazione. Purificare ogni vettore con un kit di miniprep batterico appropriato secondo le istruzioni del produttore.Per ogni vettore nella libreria preparata, seminare un pozzo di una piastra di 24 po 'con una per 10 alla quinta cellule 293FT e incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 24 ore. Per preparare una miscela di trasfezione che verrà impostata per ogni vettore nella libreria, prima elutare ogni vettore lentivirale ad una concentrazione finale di 50 nanogrammi per microlitro con acqua priva di nucleasi. Trasferire cinque microlitri di ogni diluizione in singoli pozzi di una piastra PCR a 96 pozzoli.Fai un super mix di trasfezione mescolando 1,25 microlitri per x di reagente di trasfezione uno con 23,75 microlitri per x di tampone di trasfezione preri warmed. Incubare il super mix di trasfezione a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi aggiungere 125 nanogrammi per x di psPAX2 e 125 nanogrammi per x di VSVG al super mix con pipettazione delicata.Aliquotare immediatamente il super mix in ogni tubo di una striscia PCR e utilizzare una pipetta multicanale per trasferire 25 microlitri della miscela in ogni pozzo di vettore virale diluito. Dopo un'incubazione di 20 minuti a temperatura ambiente, utilizzare una pipetta multicanale per trasferire 30 microlitri di ogni miscela di trasfezione da ogni pozzo in un pozzo corrispondente di celle 293FT nella piastra da 24 po porcili precedentemente preparata. Incubare le cellule per 24 ore prima di sostituire il mezzo in ogni pozzo con 500 microlitri di mezzo di crescita completo fresco per un'altra incubazione 24 ore su 24 nell'incubatore di coltura cellulare.Il giorno dopo, utilizzare una pipetta multicanale per raccogliere il supernatante virale da ogni pozzo e aliquota 220 microlitri di ogni supernatante in due pozzi in una nuova piastra da 96 po 'per generare una piastra supernatante virale arrayed. Per preparare le cellule A375 per l'infezione, seminare una volta 10 alla quinta colonna in una piastra di 24 po 'in 0,5 millilitri di mezzo di crescita completo per pozzo per ogni vettore virale nella libreria. Includere un pozzo extra che non verrà infettato per fungere da controllo per la selezione dei farmaci.Dopo un'incubazione 24 ore su 24 nell'incubatore di coltura cellulare, scongelare il supernatante lentivirale congelato impostato a temperatura ambiente prima di sostituire il mezzo di crescita da ogni pozzo della piastra di coltura cellulare preparata con 200 microlitri di mezzo di crescita integrati con 20 microgrammi per millilitro di polibrene. Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire 200 microlitri di supernatante virale da ogni 96 bene ad ogni pozzo della piastra da 24 porri. Riportare le cellule nell'incubatore di coltura cellulare per 24-48 ore.Al termine dell'incubazione, sostituire il mezzo in ogni pozzo con 500 microlitri di mezzo di crescita integrati con puromicina e riportare le cellule nell'incubatore di coltura cellulare per altre 48 ore. Dopo la selezione di puromicina di 48 ore, ordinare le cellule in tre o quattro gruppi in modo che tutti i pozzi di un singolo gruppo abbiano una densità cellulare simile e aggiungere 200 microlitri di tripside-EDTA a un pozzo rappresentativo di ogni gruppo per un'incubazione di cinque minuti a 37 gradi Celsius. Una volta che le cellule si sono staccate, neutralizzare la tripina con 400 microlitri di terreno di crescita integrati con puromicina e contare il numero di cellule da ogni pozzo tripsinizzato.Diluire ogni sospensione cellulare a una concentrazione di due volte 10-quinta cella per millilitro con mezzo di crescita integrato con puromicina e semi 500 microlitri di cellule da ogni pozzo nella stessa posizione del pozzo in una nuova piastra da 24 pozzetti. Dopo aver utilizzato bene i conteggi di ciascun rappresentante per stimare il numero di cellule in ogni pozzo rimanente in ciascun gruppo, aggiungere ad ogni pozzo il volume appropriato di tripside-EDTA per ottenere una concentrazione di una volta e 10 alla sesta cella per millilitro. Durante la tripsininazione, utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 400 microlitri di mezzo di crescita integrati con puromicina ai pozzi corrispondenti appropriati nella nuova piastra da 24 pozza.Una volta staccate le cellule, mescolare delicatamente il contenuto di ogni pozzo e trasferire 100 microlitri di ogni sospensione cellulare all'apposito pozzo corrispondente nella nuova piastra da 24 pozzi. Quindi riportare le cellule nell'incubatore di coltura cellulare per 24 ore. Per trasfetto le cellule con i costrutti del reporter a doppia luciferasi, preparare la miscela di diluizione della trasfezione come indicato nella tabella.Per preparare la miscela di diluizione del reporter, mescolare i volumi di ogni reagente moltiplicati per il numero totale di transfettezioni più diversi volumi extra. Quindi, mescolare la miscela di diluizione di trasfezione con la miscela di diluizione del reporter e incubare la soluzione risultante a temperatura ambiente per 15 minuti per produrre la miscela di trasfezione. Durante l'incubazione, sciacquare ogni pozzo della piastra di coltura cellulare con 250 microlitri di PBS e aggiungere 447 microlitri di mezzo di crescita fresco completo ad ogni pozzo.Quindi utilizzare una pipetta multicanale per distribuire 53 microlitri di miscela di trasfezione ad ogni pozzo della piastra di coltura cellulare. Posizionare la piastra a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 24 ore. Per misurare l'attività della luciferasi, diluire il tampone dilisi passiva 5X dal kit di attività della luciferasi in una diluizione uno-a-cinque con acqua deionizzata e scongelare i volumi necessari di reagente A e tampone B reagente dal kit.Quando i reagenti sono pronti, sostituire il supernatante in ogni pozzo con 75 microlitri di tampone di lisi passiva e incubare la piastra per 30 minuti a temperatura ambiente con scuotimenti occasionali. Durante l'incubazione, diluire il substrato B del reagente 50X dal kit a una concentrazione uno-a-50 con tampone B del reagente scongelato. Al termine dell'incubazione, aggiungere 30 microlitri di tampone di lisi passiva a quattro pozzi di controllo vuoti e trasferire 30 microlitri di lisato da ciascun pozzo in pozzi duplicati di una piastra di dosaggio bianca inferiore piatta da 96 po '.Quando tutto il lisato è stato placcato, utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 50 microlitri di reagente A a ciascun pozzo e leggere il segnale luciferasi lucciola con un lettore di piastre. Quindi utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 50 microlitri di reagente B ad ogni pozzo e leggere il segnale Renilla luciferasi con un lettore di piastre. Come previsto, YAP2SA aumenta l'attività della luciferasi della lucciola ma non l'attività della renilla luciferasi rispetto al vettore di controllo.Al contrario, YAP2SA S94A non aumenta l'attività della luciferasi lucciola. È importante sottolineare che YAP2SA non altera l'attività di un costrutto promotore minimo privo degli elementi di associazione MCAT TEAD. Nelle cellule trasfette con il costrutto reporter YAP-TAZ-TEAD, i tornanti corti YAP e TAZ tandem hanno ridotto significativamente i livelli di luciferasi della lucciola, ma il controllo del tornante corto di controllo non mira non lo fa.Al contrario, nelle cellule trasfette con il costrutto minimal reporter, l'RNA a forcina corta YAP-TAZ non altera significativamente i livelli di luciferasi lucciola. Anche il segnale Renilla in ogni pozzo non è significativamente alterato dal controllo corto del tornante non mirato o dall'RNA a forcina corta YAP-TAZ. Come previsto, gli RNA a tornanti corti rivolti a YAP e TAZ, SARC o PI3 chinasi riducono significativamente l'attività YAP-TAZ-TEAD.Gli RNA a forcina corta rivolti a ATM, CDH1, CSK, ERBB2 e gelsolina aumentano ciascuno livelli normalizzati di luciferasi lucciola coerenti con gli studi pubblicati che mostrano che queste proteine erano YAP e /o TAZ. Nonostante i ruoli stabiliti per ATR, CCNE2 ed ERBB4 in altri tipi di cellule, gli RNA a tornanti corti che prendono di mira questi geni non cambiano significativamente i livelli normalizzati di luciferasi lucciola nelle cellule A375. Seguendo questa schermata, i regolatori identificativi devono essere convalidati utilizzando altre letture per la loro attività del fattore di trascrizione.Dovrebbe essere confermato anche l'efficace abbattimento del regolatore identificato da parte del saggio. Ricordarsi di usare cautela e di seguire le linee guida di sicurezza quando si lavora con lentivirus infettivi, in particolare se i virus sono infettivi per l'uomo.

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