Name: identification of transcription factor regulators using medium-throughput screening of arrayed libraries and a dual-luciferase-based reporter
Uploaded: 2020-03-27T13:00:00
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エミリー・ノートンとミカエラン・クッチャレ・ストゥリグロスがshRNAベクターの調製を支援してくれたことに感謝します。この作品の一部は、J.M.L.(#CCR17477184)に授与されたスーザン・G・コーメンキャリア触媒助成金によって支えられました。

注 : このプロトコルの概略的な概要を図 1に示します。
1. レンチウイルスベクターライブラリー調製
注:実証済みの画面では、96ウェルプレートでグリセロールストックとして購入した配列付きshRNAライブラリを使用していましたが、ライブラリは候補のリストに基づいて手動で組み立てることもできます。適切なコントロールを?...

本研究では、転写因子の新規調節因子を同定し、試験するために使用できるデュアルルシファーゼベースの転写レポーターアッセイと組み合わせて、アレイドウイルスライブラリの中スループットスクリーニングのアプローチを実証する。どの画面の前にも、各セル行に対してレポーター システムを特徴付けて最適化することが重要です。調査対象の転写因子の活動の変化にレポーターが反...

このアッセイの目的は、ウイルスライブラリーを使用して、比較的迅速かつ安価な方法で転写因子の調節因子を同定することにある。異常な転写活性は癌と,転移1、2、3、4、5、62,3に関連しているので、癌細胞における転写因子を標的化することは有望な治療アプローチである。1,4,56しかし、転写因子は、多くの場合、薬理学的に標的化することは困難である7、多くは、成体組織8、9、109,10の正常な細胞機能に必要とされる。8異常に転写因子を活性化して病気を引き起こす癌関連経路を標的にすることは、より重篤な副作用を有する可能性を有するより実現可能なアプローチである。配列レンチウイルスおよびレトロウイルスRNAi、CRISPR/CAS9、cDNA、またはORFライブラリの商業的利用により、研究者は単一の実験で多数の遺伝子の重要性をテストすることができます。しかし、転写活性の変化に対する信頼性の高い読み出しが必要です。
ここでは、がん細胞の転写因子を調節するタンパク質を同定するための、二重ルシメラーゼベースの転写レポーターアッセイおよびアレイ化レンチウイルスライブラリーの使用について述べた。本アッセイでは、がん関連遺伝子を標的とするshRNAがレンチウイルス導入を介して哺乳動物癌細胞に送達され、細胞はプロマイシンを用いて安定な集積のために選択される。細胞は、次に、調査中の転写因子に特異的なプロモーターによって駆動されるホタルルシメラーゼを発現するレポーター構築物と、調査中の転写因子に反応しない構成的に活性なプロモーターからレニラルシメラーゼを発現する対照構造を発現させるレポーター構築物にトランスフェクトされる。我々は、YAPおよびTAZの調節因子,、カバ経路8、10、1110の重要な下流エフェクターのための概8念実証画面でこのアプローチを実証する。11YAPおよびTAZの異常な活性は、転移性カスケード11のいくつかのステップを促進し、多くの癌11、12、1312,13で観察される。11しかし、いくつかの癌細胞においてYAPおよびTAZがどのように異常に活性化されるのかはまだ完全には理解されていない。YAPとTAZはDNAを結合せず、代わりに他の転写因子によってプロモーターにリクルートされる。転写因子のTEAドメイン(TEAD)ファミリーのメンバーは、YAPおよびTAZの主要な結合パートナーであり、ほとんどのYAPおよびTAZ依存的な機能にとって重要である。我々のレポーター構築物は、YAP/TAZ-TEAD応答性プロモーターからのホタルルシメラーゼを発現しており、以前の研究では、YAP-TEADおよびTAZ-TEAD転写活性22、14、1514,15の変化を忠実に検出することを実証した。
当社のアプローチは、高速で中規模のスループットであり、スクリーニング施設、自動ロボット、またはプールされたライブラリの深いシーケンスを必要としません。コストは比較的低く、選択する多くの市販のライブラリがあります。必要な装置および試薬はほとんどの実験室で比較的標準的である。ルシファーゼベースのレポーターが存在するか、生成された場合、事実上任意の転写因子の調節因子をスクリーニングするために使用することができます。このアプローチを使用してがん細胞のshRNAをスクリーニングしますが、合理的な効率でトランスフェクトできる細胞株は、あらゆるタイプのアレイ化されたライブラリで使用できます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.0 ml 96-well deep well polypropylene plate</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1896-2000</td>
			<td>For bacterial mini-prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin - 2.50%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td>Component of trypsin-EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat bottom white assay plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3922</td>
			<td>For dual-luciferase assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin - 100 mg/ml</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>45-10835242001-EA</td>
			<td>For bacterial mini-prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto-tryptone - powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>95039</td>
			<td>Component of LB broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-luciferase reporter assay system, which include LAR II reagent (reagent A), Stop &#38; Glo substrate (reagent B substrate) and Stop &#38; Glo buffer (reagent B buffer) - Kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1960</td>
			<td>For dual-luciferase assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline w/o calcium, magnesium and phenol red - 9.6 g/L</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>TS1006</td>
			<td>For PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA - 0.5 M</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-406</td>
			<td>Component of trypsin-EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol - 100%</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td>111000200</td>
			<td>For bacterial mini-prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum - 100%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97068-085</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine bromide (Polybrene) - 8 mg/ml</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>45-H9268</td>
			<td>For virus infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone DMEM/High glucose - 4 mM L-Glutamine; 4500 mg/L glucose; sodium pyruvate</td>
			<td>GE Healthcare life sciences</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td></td>
			<td>For dual-luciferase assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine - 200 mM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 (Transfection Reagent 2) - 100%</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>L3000008</td>
			<td>For transfections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Biology Water - 100%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>02-0201-0500</td>
			<td>For dilution of shRNA vector for virus packaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl - powder</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH9286</td>
			<td>Component of LB broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td></td>
			<td>For measuring vector DNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM (Transfection Buffer) - 100%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-062</td>
			<td>For transfections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin - 10,000 Unit/ml (Penicillin); 10,000 &#181;g/ml (Streptomycin)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit - Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K210010</td>
			<td>For bacterial mini-prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin - 2.5 mg/ml</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>45-P7255</td>
			<td>For antibiotic selection after infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20 automated cell counter</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (Transfection Reagent 1) - 100%</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6365787001</td>
			<td>For virus packaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract - powder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>J850</td>
			<td>Component of LB broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P3000 (Transfection Reagent 3) - 100%</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>L3000008</td>
			<td>For transfections</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of transcription factor regulators using medium-throughput screening of arrayed libraries and a dual-luciferase-based reporter

転写因子は、さまざまな下流プロセスに影響を与える多数の標的遺伝子の発現を変化させ、抗癌療法の良い標的となる可能性があります。しかし、転写因子を直接標的化することはしばしば困難であり、転写因子が1つ以上の成人組織で必要な場合には副作用を引き起こす可能性がある。がん細胞の転写因子を異常に活性化する上流の調節因子を特定することは、特にこれらのタンパク質が薬物に対して容易である場合、より実現可能な代替手段を提供する。ここでは、配列中規模レンチウイルスライブラリーと、がん細胞における転写因子の新しい調節因子を同定するための二重ルシファーゼベースの転写レポーターアッセイを組み合わせることができるプロトコルについて説明する。当社のアプローチは、1回の実験で何百もの遺伝子をテストするための迅速で簡単で安価な方法を提供します。このアプローチの使用を実証するために、カバ経路の下流のエフェクターである2つの転写共活性化剤であるYes-関連タンパク質(YAP)およびPDZ結合モチーフ(TAZ)と転写共活性化剤のいくつかの調節因子を含む配列レンチウイルスRNAiライブラリのスクリーンを行った。しかし、このアプローチは、実質的に任意の転写因子または共因子のレギュレータをスクリーニングするように変更することができ、CRISPR /CAS9、cDNA、またはORFライブラリをスクリーニングするためにも使用できます。

当社のYAP/TAZ-TEADレポーターコンストラクト(pGL3-5xMCAT(SV)-492,14,15)14,15には、ホタルルシファラーゼ遺伝子を駆動する正規TEAD結合元素(MCAT)15の5つの反復を伴う最小SV-49プロモーターが含まれています(215図1)。PRL-TK制御ベクター(プロメガ)と共に細胞に共入反応さ?...

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Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter

転写因子の新しい調節因子を同定するために、我々は、二重ルシメラーゼベースの転写レポーターアッセイを用いて、配列レンチウイルスまたはレトロウイルスRNAiライブラリをスクリーニングするアプローチを開発した。このアプローチは、1回の実験で数百人の候補者をスクリーニングするための迅速かつ比較的安価な方法を提供します。

アレイ化されたライブラリの中スループットスクリーニングとデュアルルシファーゼベースレポーターを用いた転写因子レギュレータの同定

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for ...

このプロトコルは、配列レンチウイルスまたはレトロウイルスアッセイライブラリをスクリーニングして、癌細胞における転写因子の新しい調節因子を同定するために使用することができる。この技術の主な利点は、高速、中規模のスループット、および安価であり、ほとんどの研究者が一般的にアクセスできる機器や試薬を使用することです。ライブラリ内の各レンチウイルスベクターを拡大して精製するには、まず96ウェル深井戸プレートの各ウェルにアンピシリン1ミリリットル当たり100マイクログラムを添加したルリアスープ1.3ミリリットルを加えます。37°Cで一晩インキュベーションし、毎分225回転のためにグリセロールストックの2マイクロリットルで各井戸を接種します。翌日、各細菌培養物を個々の1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移し、遠心分離を行う。メーカーの指示に従って適切な細菌のminiprepキットで各ベクターを精製します。準備されたライブラリ内の各ベクターについて、24ウェルプレートの井戸を10〜5番目の293FT細胞で種付けし、摂氏37度で、24時間の二酸化炭素を5%でインキュベートします。ライブラリー内の各ベクターに対して設定されるトランスフェクション混合物を調製するために、まずレンチウイルスベクターをヌクレアーゼを含まない水でマイクロリットル当たり50ナノグラムの最終濃度に溶出する。各希釈液の5マイクロリットルを96ウェルPCRプレートの個々のウェルに移します。トランスフェクション・リザーク1の1.25マイクロリットルxを、23.75マイクロリットルx倍前に加温したトランスフェクションバッファーと混合してトランスフェクションスーパーミックスを作ります。トランスフェクションスーパーミックスを室温で5分間インキュベートします。その後、穏やかなピペットでスーパーミックスにpsPAX2の125ナノグラム倍xとVSVGの125ナノグラム倍xを追加します。すぐにPCRストリップの各チューブにスーパーミックスをアリコートし、希釈されたウイルスベクターの各ウェルに混合物の25マイクロリットルを転送するためにマルチチャネルピペットを使用しています。室温で20分間のインキュベーションの後、マルチチャネルピペットを使用して、各ウェルから各トランスフェクション混合物の30マイクロリットルを、以前に調製した24ウェルプレート内の293FT細胞の対応するウェルに移します。細胞培養インキュベーター内のさらに24時間インキュベーションのために、各ウェルの培地を500マイクロリットルの新鮮な完全な成長培地に置き換える前に、24時間培養します。翌日、マルチチャンネルピペットを使用して、各上澄みのウイルス上清とアリコート220マイクロリットルの各上澄み物を新しい96ウェルプレートの2つのウェルに集め、アレイ化されたウイルス上清プレートを生成します。A375細胞を感染に備えるために、24ウェルプレートに10回10~5番目の細胞を、ライブラリー内のウイルスベクターごとに完全増殖培地1個あたり0.5ミリリットルで播種する。薬物選択のコントロールとして機能するように感染しない余分な井戸を含める.細胞培養インキュベーターで24時間培養した後、調製した細胞培養プレートの各ウェルからの成長培地をポリブレンの1ミリリットル当たり20マイクログラムで補う200マイクロリットルの成長培地に置き換える前に、凍結アレイレンチウイルス上清を室温に設定して解凍する。マルチチャンネルピペットを使用して、各96ウェルから24ウェルプレートの各ウェルにウイルス上清の200マイクロリットルを転送します。細胞を24〜48時間培養インキュベーターに戻す。インキュベーションの終了時に、各ウェルの培地を、ピューロマイシンを添加した500マイクロリットルの増殖培地に交換し、細胞を細胞培養インキュベーターにさらに48時間戻します。48時間のピューロマイシン選択に続いて、単一のグループのすべてのウェルが同様の細胞密度を有するように細胞を3つまたは4つのグループに分類し、37°Cで5分間の各グループから1つの代表井戸に200マイクロリットルのトリプシン-EDTAを加える。細胞が剥離したら、ピューロマイシンを添加した400マイクロリットルの成長培地でトリプシンを中和し、トリプシン化した各トリプシンから細胞の数を数える。各細胞懸濁液を、ピューロマイシンと種子500マイクロリットルの細胞を各ウェルから新しい24ウェルプレートの同じウェル位置に補充して、1ミリリットル当たり5番目の細胞に2倍に希釈します。各代表ウェルからのカウントを使用して各グループに残っている各ウェルの細胞数を推定した後、各ウェルにトリプシン-EDTAの適切な量を加え、ミリリットル濃度当たり6番目の細胞に10倍を達成する。トリプシンの間に、新しい24ウェルプレートの適切な対応する井戸にピューロマイシンを添加した成長培地の400マイクロリットルを加えるためにマルチチャネルピペットを使用する。細胞が剥離したら、各ウェルの内容物を穏やかに混合し、各細胞懸濁液の100マイクロリットルを新しい24ウェルプレートの適切な対応ウェルに移します。その後、細胞を細胞培養インキュベーターに24時間戻す。デュアルルシファーゼレポーターコンストラクトで細胞をトランスフェクトするには、表に示すようにトランスフェクション希釈混合物を調製します。レポーター希釈混合物を調製するには、トランスフェクションの合計数といくつかの余分なボリュームを掛けた各試薬の量を混合します。次に、トランスフェクション希釈混合物をレポーター希釈混合物と混合し、得られた溶液を室温で15分間インキュベートし、トランスフェクション混合物を製造する。インキュベーション中に、250マイクロリットルのPBSで細胞培養プレートの各ウェルをすすい、各ウェルに447マイクロリットルの新鮮な完全な成長培地を加えます。次いで、マルチチャネルピペットを使用して、53マイクロリットルのトランスフェクションミックスを細胞培養プレートの各ウェルに分配する。プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%を24時間置きます。ルシファーゼ活性を測定するために、ルシファーゼ活性キットから5X受動溶解バッファーを脱イオン水で1~5回希釈し、キットから必要な量の試薬Aおよび試薬Bバッファーを解凍します。試薬の準備ができたら、各ウェルの上澄み液を受動リシスバッファーの75マイクロリットルに交換し、時折揺れで室温で30分間プレートをインキュベートします。インキュベーション中に、キットから50X試薬B基板を解凍した試薬Bバッファーで1~50濃度に希釈します。インキュベーションの最後に、4つのブランクコントロールウェルに30マイクロリットルの受動的なライシスバッファーを加え、各ウェルから30マイクロリットルのライセートを96ウェルフラットボトムホワイトアッセイプレートの重複ウェルに移します。すべてのライセートがメッキされたら、マルチチャンネルピペットを使用して各ウェルに50マイクロリットルの試薬Aを加え、プレートリーダーでホタルルシファーゼ信号を読み取ります。その後、マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルに50マイクロリットルの試薬Bを加え、プレートリーダーでレニラルシファーゼ信号を読み取ります。予想通り、YAP2SAは、コントロールベクターと比較して、ホタルルシファーゼ活性を増加させるが、レニラルシファーゼ活性を増加させる。これに対し、YAP2SA S94Aはホタルルシファーゼ活性を増加しません。重要なことに、YAP2SAはMCAT TEAD結合要素を欠く最小限のプロモーター構築物の活性を変化させるものではない。YAP-TAZ-TEADレポーターコンストラクトにトランスフェクトされた細胞では、タンデムYAPおよびTAZショートヘアピンはホタルルシファーゼラーゼレベルを有意に低下させたが、コントロールショートヘアピン非ターゲティングコントロールはそうではない。対照的に、最小レポーターコンストラクトにトランスフェクトされた細胞において、YAP-TAZショートヘアピンRNAはホタルルシファーゼのレベルを有意に変化させるわけではない。各ウェルのレニラシグナルは、短いヘアピン非ターゲティングコントロールまたはYAP-TAZショートヘアピンRNAによっても有意に変化しない。予想通り、YAPおよびTAZ、SARCまたはPI3キナーゼを標的とする短いヘアピンRNAは、YAP-TAZ-TEAD活性を有意に低下させる。ATM、CDH1、CSK、ERBB2、およびゲルソリンを標的とする短いヘアピンRNAは、それぞれ正規化ホタルルシメラーゼレベルを増加させ、これらのタンパク質がYAPおよび/またはTAZであることを示す公表された研究と一致した。ATR、CCNE2、ERBB4の役割は他の細胞タイプでも確立されているにもかかわらず、これらの遺伝子を標的とする短いヘアピンRNAは、A375細胞における正規化ホタルルシフラーゼレベルを有意に変化させない。この画面に続いて、レギュレータの識別は、転写因子活性のための他の読み出しを使用して検証する必要があります。アッセイによって同定されたレギュレータの有効なノックダウンも確認されるべきである。感染性レンチウイルスを扱う際には注意して安全ガイドラインに従うことを忘れないでください, ウイルスが人間の感染性である場合は特に.

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