Name: identification of transcription factor regulators using medium-throughput screening of arrayed libraries and a dual-luciferase-based reporter
Uploaded: 2020-03-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter at JoVE.com

Gostaríamos de agradecer a Emily Norton e Mikaelan Cucciarre-Stuligross por ajudarna preparação de vetores shRNA. Este trabalho foi apoiado em parte por uma Susan G. Komen Career Catalyst Grant que concedeu a J.M.L. (#CCR17477184).

NOTA: Um resumo esquemático deste protocolo é mostrado na Figura 1.
1. Preparação da biblioteca vetorial lentiviral
NOTA: A tela demonstrada usou uma biblioteca de shRNA organizada comprada como estoque de glicerol em placas de 96 poços, mas as bibliotecas também podem ser montadas manualmente com base em uma lista de candidatos. Os controles apropriados devem ser considerados e incluídos em qualquer biblioteca. Isso inclui um shRN...

Neste estudo, demonstramos uma abordagem para a triagem de média-duração de bibliotecas virais organizadas em combinação com um ensaio de repórter transcricional baseado em duas luciferases que pode ser usado para identificar e testar novos reguladores de fatores de transcrição. É fundamental caracterizar e otimizar o sistema de repórteres para cada linha celular antes de qualquer tela. Experimentos devem ser feitos para confirmar que o repórter está respondendo à atividade alterada do fator de transcrição...

O objetivo deste ensaio é usar bibliotecas virais para identificar reguladores de fatores de transcrição de forma relativamente rápida e barata. A atividade transcricional aberrante está associada ao câncer e à metástase1,2,3,4,5,6, então direcionar fatores de transcrição em células cancerosas é uma abordagem terapêutica promissora. No entanto, fatores de transcrição são muitas vezes difíceis de atingir farmacologicamente7 e muitos são necessários para a função celular normal em tecidos adultos8,9,10. Direcionar as vias associadas ao câncer que ativam aberrrantamente fatores de transcrição para conduzir a doença é uma abordagem mais viável com potencial para ter efeitos colaterais menos graves. A disponibilidade comercial de bibliotecas RAi, CRISPR/CAS9, cDNA ou ORF, lentiona ou ré, permite aos pesquisadores testar a importância de inúmeros genes em um único experimento. No entanto, é necessária uma leitura confiável para a atividade transcricional alterada.
Aqui, descrevemos o uso de um ensaio transcricional baseado em duas luciferases e bibliotecas lentivirais organizadas para identificar proteínas que regulam fatores de transcrição em células cancerosas. Neste ensaio, as shRNAs que visam genes associados ao câncer são entregues às células cancerígenas de mamíferos através da transdução lentiviral e as células são selecionadas para integração estável usando puromicina. As células são transfeccionadas em seguida com uma construção de repórter que expressa a luciferase de vagalume impulsionada por um promotor específico para o fator de transcrição que está sendo investigado e um conjunto de controle que expressa a luciferase de Renilla de um promotor constitutivamente ativo que não responde ao fator de transcrição que está sendo investigado. Demonstramos essa abordagem com uma tela de prova de conceito para os reguladores da YAP e da TAZ, os efeitos críticos a jusante da via Hipopótamo88,10,,11. A atividade anormal de YAP e TAZ promove várias etapas da cascata metastática11 e é observada em muitos cânceres11,12,13. No entanto, como yap e TAZ se tornam aberrantemente ativados em algumas células cancerosas ainda não é totalmente compreendido. YAP e TAZ não ligam DNA, mas são recrutados para promotores por outros fatores de transcrição. Os membros da família tea domain (TEAD) de fatores de transcrição são os principais parceiros vinculantes para YAP e TAZ, e são críticos para a maioria das funções dependentes de YAP e TAZ. Nossa construção de repórter expressa a luciferase de vagalumes de um promotor yap/taz-TEAD-responsivo e estudos anteriores demonstraram que detecta fielmente alterações na atividade transcricional YAP-TEAD e TAZ-TEAD2,14,15.
Nossa abordagem é rápida, de médio porte, e não requer instalações de triagem, robôs automatizados ou sequenciamento profundo de bibliotecas agrupadas. Os custos são relativamente baixos e há inúmeras bibliotecas disponíveis comercialmente para escolher. Os equipamentos e reagentes necessários também são relativamente padrão na maioria dos laboratórios. Ele pode ser usado para rastrear reguladores de praticamente qualquer fator de transcrição se um repórter baseado em luciferase existir ou for gerado. Usamos essa abordagem para tela shRNAs em células cancerosas, mas qualquer linha celular que possa ser transfeccionada com eficiência razoável poderia ser usada com qualquer tipo de biblioteca organizada.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>2.0 ml 96-well deep well polypropylene plate</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1896-2000</td>
			<td>For bacterial mini-prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin - 2.50%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td>Component of trypsin-EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat bottom white assay plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3922</td>
			<td>For dual-luciferase assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin - 100 mg/ml</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>45-10835242001-EA</td>
			<td>For bacterial mini-prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto-tryptone - powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>95039</td>
			<td>Component of LB broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-luciferase reporter assay system, which include LAR II reagent (reagent A), Stop &#38; Glo substrate (reagent B substrate) and Stop &#38; Glo buffer (reagent B buffer) - Kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1960</td>
			<td>For dual-luciferase assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline w/o calcium, magnesium and phenol red - 9.6 g/L</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>TS1006</td>
			<td>For PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA - 0.5 M</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-406</td>
			<td>Component of trypsin-EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol - 100%</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td>111000200</td>
			<td>For bacterial mini-prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum - 100%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97068-085</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine bromide (Polybrene) - 8 mg/ml</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>45-H9268</td>
			<td>For virus infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone DMEM/High glucose - 4 mM L-Glutamine; 4500 mg/L glucose; sodium pyruvate</td>
			<td>GE Healthcare life sciences</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td></td>
			<td>For dual-luciferase assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine - 200 mM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 (Transfection Reagent 2) - 100%</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>L3000008</td>
			<td>For transfections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Biology Water - 100%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>02-0201-0500</td>
			<td>For dilution of shRNA vector for virus packaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl - powder</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH9286</td>
			<td>Component of LB broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td></td>
			<td>For measuring vector DNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM (Transfection Buffer) - 100%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-062</td>
			<td>For transfections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin - 10,000 Unit/ml (Penicillin); 10,000 &#181;g/ml (Streptomycin)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit - Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K210010</td>
			<td>For bacterial mini-prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin - 2.5 mg/ml</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>45-P7255</td>
			<td>For antibiotic selection after infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20 automated cell counter</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (Transfection Reagent 1) - 100%</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6365787001</td>
			<td>For virus packaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract - powder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>J850</td>
			<td>Component of LB broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P3000 (Transfection Reagent 3) - 100%</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>L3000008</td>
			<td>For transfections</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of transcription factor regulators using medium-throughput screening of arrayed libraries and a dual-luciferase-based reporter

Fatores de transcrição podem alterar a expressão de numerosos genes-alvo que influenciam uma variedade de processos a jusante tornando-os bons alvos para terapias anticâncer. No entanto, direcionar diretamente os fatores de transcrição é muitas vezes difícil e pode causar efeitos colaterais adversos se o fator de transcrição for necessário em um ou mais tecidos adultos. Identificar reguladores a montante que ativam aberrrantamente fatores de transcrição em células cancerosas oferece uma alternativa mais viável, particularmente se essas proteínas são fáceis de drogar. Aqui, descrevemos um protocolo que pode ser usado para combinar bibliotecas lentivirais de média escala e um ensaio de repórter transcricional baseado em dupla luciferase para identificar novos reguladores de fatores de transcrição em células cancerosas. Nossa abordagem oferece uma maneira rápida, fácil e barata de testar centenas de genes em um único experimento. Para demonstrar o uso desta abordagem, realizamos uma tela de uma biblioteca RNAi lentiviral organizada contendo vários reguladores de proteína associada a Sim (YAP) e co-ativador transcricional com motivo de ligação PDZ (TAZ), dois co-ativadores transcritores que são os efeitos a jusante da via Hipopótamo. No entanto, essa abordagem pode ser modificada para os reguladores de praticamente qualquer fator de transcrição ou co-fator e também pode ser usada para tela de bibliotecas CRISPR/CAS9, cDNA ou ORF.

Nosso construto de repórter YAP/TAZ-TEAD (pGL3-5xMCAT (SV)-492,14,15) contém um promotor SV-49 mínimo com 5 repetições do elemento de ligação CANônico TEAD (MCAT)15 que conduz o gene da luciferase de vagalume(Figura 1). É co-transfetado em células juntamente com o vetor de controle PRL-TK (Promega), que expressa a luciferase de R...

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Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter

Para identificar novos reguladores de fatores de transcrição, desenvolvemos uma abordagem para tela de bibliotecas RNAi lentivirais ou retrovirais usando um ensaio de repórter transcricional baseado em dupla luciferase. Esta abordagem oferece uma maneira rápida e relativamente barata de selecionar centenas de candidatos em um único experimento.

Identificação de reguladores de fatores de transcrição usando triagem de média-duração de bibliotecas arrayed e um repórter baseado em dupla-luciferase

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for ...

Este protocolo pode ser usado para selecionar bibliotecas de ensaios lentiviral ou retroviral para identificar novos reguladores de fatores de transcrição em células cancerosas. As principais vantagens dessa técnica são que ela é rápida, média e barata, e que utiliza equipamentos e reagentes comumente acessíveis à maioria dos investigadores. Para expandir e purificar cada vetor lentiviral na biblioteca, adicione primeiro 1,3 mililitros de caldo de Luria complementados com 100 microgramas por mililitro de ampicillina a cada poço de uma placa de poço de 96 poços profundos.Inocular cada poço com dois microliters de estoque de glicerol para uma incubação durante a noite a 37 graus Celsius e 225 revoluções por minuto. No dia seguinte, transfira cada cultura de bactérias para tubos individuais de microcentrífugo de 1,5 mililitro para centrifugação. Purifique cada vetor com um kit de miniprep bacteriano apropriado de acordo com as instruções do fabricante.Para cada vetor na biblioteca preparada, semente um poço de uma placa de 24 poços com uma vezes 10 a quinta células de 293FT e incubar as células a 37 graus Celsius e 5% dióxido de carbono por 24 horas. Para preparar uma mistura de transfecção que será montada para cada vetor da biblioteca, primeiro elute cada vetor lentiviral para uma concentração final de 50 nanogramas por microliter com água livre de nuclease. Transfira cinco microliters de cada diluição em poços individuais de uma placa PCR de 96 poços.Faça uma super mistura de transfecção misturando 1,25 microliters vezes x de reagente de transfecção um com 23,75 microliters vezes x de tampão de transfecção pré-aquecido. Incubar a super mistura de transfecção à temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, adicione 125 nanogramas vezes x de psPAX2 e 125 nanogramas vezes x de VSVG à super mistura com tubulação suave.Alíquota imediatamente a super mistura em cada tubo de uma tira PCR e use uma pipeta multicanal para transferir 25 microliters da mistura para cada poço de vetor viral diluído. Após uma incubação de 20 minutos à temperatura ambiente, use uma pipeta multicanal para transferir 30 microliters de cada mistura de transfecção de cada poço para um poço correspondente de células de 293FT na placa de 24 poços previamente preparada. Incubar as células por 24 horas antes de substituir o meio em cada poço por 500 microliters de meio de crescimento completo fresco para outra incubação de 24 horas na incubadora de cultura celular.No dia seguinte, use uma pipeta multicanal para coletar o supernanato viral de cada poço e alíquota de 220 microliters de cada supernante em dois poços em uma nova placa de 96 poços para gerar uma placa supernante viral. Para preparar células A375 para infecção, sementes uma vez 10 para as quintas células em uma placa de 24 poços em 0,5 mililitros de meio de crescimento completo por poço para cada vetor viral na biblioteca. Inclua um poço extra que não será infectado para servir como um controle para a seleção de medicamentos.Após uma incubação de 24 horas na incubadora de cultura celular, descongele o supernanato lentiviral congelado definido para a temperatura ambiente antes de substituir o meio de crescimento de cada poço da placa de cultura celular preparada com 200 microliters de meio de crescimento complementados com 20 microgramas por mililitro de polibrene. Usando uma pipeta multicanal, transfira 200 microliters de supernanato viral de cada 96 bem para cada poço da placa de 24 poços. Devolva as células à incubadora de cultura celular por 24 a 48 horas.Ao final da incubação, substitua o meio em cada poço por 500 microliters de meio de crescimento suplementados com puramicina e devolva as células à incubadora de cultura celular por mais 48 horas. Após a seleção de 48 horas de puramicina, classifique as células em três ou quatro grupos de tal forma que todos os poços de um único grupo tenham uma densidade celular semelhante e adicionem 200 microliters de trypsin-EDTA a um bem representativo de cada grupo para uma incubação de cinco minutos a 37 graus Celsius. Uma vez que as células tenham se destacado, neutralize a trippsina com 400 microliters de meio de crescimento suplementados com puramicina e conte o número de células de cada bem experimentpsinizado.Diluir cada suspensão celular para duas vezes 10 a quinta células por concentração mililitro com meio de crescimento suplementado com puromicina e sementes 500 microliters de cada poço para a mesma posição bem em uma nova placa de 24 poços. Depois de usar as contagens de cada representante bem para estimar o número de células em cada grupo restante, adicione o volume apropriado de trypsin-EDTA a cada poço para alcançar uma vez 10 para a sexta célula por concentração mililitro. Durante a trippsinização, use uma pipeta multicanal para adicionar 400 microliters de meio de crescimento suplementados com puramicina aos poços correspondentes apropriados na nova placa de 24 poços.Uma vez que as células tenham se destacado, misture suavemente o conteúdo de cada poço e transfira 100 microliters de cada suspensão celular para o poço correspondente apropriado na nova placa de 24 poços. Em seguida, devolva as células à incubadora de cultura celular por 24 horas. Para transfetar as células com as construções de repórter de dupla luciferase, prepare a mistura de diluição de transfecção conforme indicado na tabela.Para preparar a mistura de diluição do repórter, misture os volumes de cada reagente multiplicado pelo número total de transfecções mais vários volumes extras. Em seguida, misture a mistura de diluição transfecção com a mistura de diluição repórter e incubar a solução resultante à temperatura ambiente por 15 minutos para produzir a mistura de transfecção. Durante a incubação, enxágue cada poço da placa de cultura celular com 250 microliters de PBS e adicione 447 microliters de meio de crescimento completo fresco a cada poço.Em seguida, use uma pipeta multicanal para distribuir 53 microliters de mistura de transfecção para cada poço da placa de cultura celular. Coloque a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 24 horas. Para medir a atividade da luciferase, diluir o tampão de lise passiva 5X do kit de atividade da luciferase em uma diluição de um a cinco com água deionizada e descongelar os volumes necessários do reagente A e do tampão de reagente B do kit.Quando os reagentes estiverem prontos, substitua o supernascer em cada poço por 75 microliters de tampão de lise passiva e incubar a placa por 30 minutos em temperatura ambiente com agitação ocasional. Durante a incubação, diluir o substrato B do reagente 50X do kit para uma concentração de um a 50 com tampão B desintoxicante. No final da incubação, adicione 30 microliters de tampão de lise passiva a quatro poços de controle em branco e transfira 30 microliters de lysate de cada poço em poços duplicados de uma placa de ensaio branco de fundo plano de 96 poços.Quando todo o lisato tiver sido emplacado, use uma pipeta multicanal para adicionar 50 microliters de reagente A a cada poço e ler o sinal de luciferase de vagalume com um leitor de placas. Em seguida, use uma pipeta multicanal para adicionar 50 microliters de reagente B a cada poço e ler o sinal de luciferase Renilla com um leitor de placas. Como esperado, o YAP2SA aumenta a atividade de luciferase de vagalume, mas não a atividade de luciferase renilla em comparação com o vetor de controle.Em contrapartida, o YAP2SA S94A não aumenta a atividade de luciferase de vagalume. É importante ressaltar que o YAP2SA não altera a atividade de uma construção de promotor mínima que carece dos elementos de vinculação MCAT TEAD. Em células transfectadas com a construção de repórter YAP-TAZ-TEAD, os pinos de cabelo curtos tandem YAP e TAZ reduziram significativamente os níveis de luciferase de vagalume, mas o controle de curto grampo não direcionado não.Em contraste, nas células transfeinadas com a construção mínima de repórteres, o RNA de grampo curto YAP-TAZ não altera significativamente os níveis de luciferase de vagalume. O sinal de Renilla em cada poço também não é significativamente alterado pelo controle de não-direcionamento do grampo de cabelo curto ou pelo RNA de pino de cabelo curto YAP-TAZ. Como esperado, rnAs de grampo de cabelo curto visando YAP e TAZ, SARC ou PI3 quinase reduz significativamente a atividade YAP-TAZ-TEAD.RNAs de grampo de cabelo curto visando ATM, CDH1, CSK, ERBB2 e gelsolina aumentaram cada um os níveis de luciferase normalizado de vagalume consistentes com estudos publicados mostrando que essas proteínas eram YAP e/ou TAZ. Apesar das funções estabelecidas para ATR, CCNE2 e ERBB4 em outros tipos de células, as RNAs de grampo de cabelo curto direcionadas a esses genes não mudam significativamente os níveis de luciferase de vagalume normalizada em células A375. Após esta tela, os reguladores de identificação devem ser validados usando outras leituras para sua atividade de fator de transcrição.A derrubada efetiva do regulador identificado pelo ensaio também deve ser confirmada. Lembre-se de ter cuidado e seguir as diretrizes de segurança ao trabalhar com lentivírus infecciosos, especialmente se os vírus forem infecciosos humanos.

Research

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