Name: combined use of tail vein metastasis assays and real-time in vivo imaging to quantify breast cancer metastatic colonization and burden in the lungs
Uploaded: 2019-12-19T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs at JoVE.co

نشكر اميلي نورتون للمساعدة في العدوى الفيروسية والقراءة النقدية للمخطوطة. كما نشكر رايان كاناي علي المساعدة في الحصول علي صور الرئتين والمساعدة في تحليل الصور للنقائل الخضراء في الرئتين. ونشكر موظفي مرفق البحوث الحيوانية علي دعمهم ومساعدتهم في اعداد هذا الفيديو. وكان هذا العمل مدعوما من قبل سوزان g. Komen منحه الوظيفي محفز التي منحت لj.m.l. (#CCR17477184).

وينطوي هذا البروتوكول علي استخدام الفئران والمواد البيولوجية الخطرة ويتطلب الموافقة من لجان السلامة المؤسسية المناسبة. وقد تمت الموافقة علي كل من وصفها في العمل الفيفو هنا من قبل كليه الطب الباني المؤسسة الرعاية الحيوانية واستخدام اللجنة (IACUC).
ملاحظه: للحصول علي نظره عامه...

الخطوات الهامه للأسلوب من الاهميه بمكان لتحسين عدد الخلايا التي تم حقنها (الخطوة 3) لخط خليه معينه وسلاله الماوس لان هذا يمكن ان تؤثر بشكل كبير علي عدد الانبثاث التي تشكل وطول التجربة. إذا تم حقن خلايا كثيره جدا أو الانبثاث تنمو لفتره طويلة جدا ، قد يكون من الصعب علي الانبثاث العد...

السرطان لا يزال السبب الرئيسي الثاني للوفاة في جميع انحاء العالم1 والانبثاث هو المسؤول عن غالبيه هذه الوفاات2,3. ومع ذلك ، فان الفهم المحدود للأليات الجزيئية التي تحكم الاستعمار المنتشر والنمو اللاحق أعاق تطوير علاجات فعاله للامراض المنتشرة. ويتطلب تحديد الأهداف العلاجية الجديدة فحصا لاختبار مدي تاثير التعبير المضطرب أو وظيفة الجينات المرشحة علي تكوين الأورام الخبيثة ونموها. بينما نماذج الماوس أصلي لها مزاياها ، فهي تستغرق وقتا طويلا ومكلفه لتوليد ، مما يجعلها أكثر ملاءمة للتحقق من صحة الهدف بدلا من اكتشاف الهدف. نظم نموذج زرع فيها الجينات المرشح هو قلق في الخلايا السرطانية في المختبر ومن ثم يتم تقييم الآثار علي الإمكانات المنتشرة في الجسم المصاب ، هي اقل تكلفه واعلي من الانتاجيه من أصلي النماذج. الاضافه إلى ذلك ، النواقل الفيروسية للتسليم مستقره من RNAi ، CRISPR/كاس 9 ، والجينات هي متاحه علي نطاق واسع ، مما يجعل من السهل نسبيا للاضطراب تقريبا اي جين أو جينات الفائدة في خطوط الخلايا السرطانية. ويمكن أيضا استخدام هذا النهج لفحص دور الجينات المرشحة في الاستعمار المنتشر والنمو في خطوط الخلايا السرطانية البشرية عن طريق زرع الخلايا في الفئران المناعية أو أنسنه.
نوعين من المقايسات المستخدمة لاختبار تشكيل الانبثاث بالخلايا السرطانية المزروعة في الجسم الحيوي هي فحوصات الانبثاث العفوية واختبارات الانبثاث التجريبية. في اختبارات الانبثاث العفوية4،5، يتم حقن الخلايا السرطانية في الفئران ، ويسمح لتشكيل الورم الاولي ، وبعد ذلك تشكيل الانبثاث العفوي والنمو اللاحق يتم التهاوي. قوه هذا النموذج هو ان الخلايا يجب ان تكمل جميع خطوات العملية المنتشرة من أجل تشكيل الأورام المنتشرة. ومع ذلك ، فان العديد من خطوط الخلايا السرطانية لا تنتشر بكفاءة في نماذج الانبثاث العفوية ، وأي تلاعب في الخلايا التي تؤثر علي نمو الورم الاولي يمكن ان نخلط نتائج الفحص الانبثاث. يتم استخدام اختبارات الانبثاث التجريبية ، التي يتم حقن الخلايا السرطانية مباشره في الدورة الدموية ، لتجنب هذه المزالق. وتشمل اختبارات الانبثاث التجريبية الشائعة حقن الوريد الذيل6,7,8 (وأظهرت هنا), حقن داخل الشرايين9, والمدخل الوريد حقن10.
والغرض من البروتوكول المعروض هنا هو توفير اختبار الانبثاث التجريبية التي تسمح للباحث لرصد تشكيل الانبثاث والنمو في الوقت الحقيقي ، وكذلك لقياس نقطه نهاية عدد الانبثاث وحجم في الرئتين من نفس الماوس. لتحقيق ذلك ، يتم الجمع بين التجريبية التقليدية ذيل الوريد الانبثاث الاختبارات6،7،8 مع التصوير الحيواني الحية ، وذلك باستخدام جهاز التصوير في فيفو9،11،12،13،14. الخلايا السرطانية التي تعبر عن كل من لوسيفيراز والبروتين الفلوري يتم حقنها في الفئران عبر الوريد الذيل الجانبي ومن ثم يتم استخدام جهاز التصوير في الجسم المجري لقياس التغيرات في العبء المنتشر في الرئتين مع مرور الوقت (الشكل 1). ومع ذلك ، فان الجهاز الحي في الجسم التصوير الحيواني لا يميز أو يقيس حجم النقائل الفردية. التالي ، في نهاية التجربة ، يتم استخدام مجسم الفلورسنت الفلورية لحساب عدد وقياس حجم الانبثاث الفلورسنت في الرئتين دون الحاجة إلى التماس والانسجه أو مناعي (الشكل 1). ويمكن استخدام هذا البروتوكول لاختبار كيفيه تغيير التعبير أو وظيفة الجينات مرشح يؤثر علي تكوين الانبثاث والنمو. يمكن أيضا اختبار المركبات العلاجية المحتملة مثل الجزيئات الصغيرة أو وظيفة حجب الأجسام المضادة.
لإظهار هذا النهج ، قمنا أولا باجراء دليل علي تجربه المفهوم الذي عامل النسخ المتماثل الاساسيه ، النسخ المتماثل البروتين A3 (RPA3) هو طرقت أسفل في خلايا سرطان الثدي الماوس المنتشر. ونحن نظهر ان الفئران حقن مع RPA3 الخلايا الضربة القاضية لديها عبء اقل بكثير المنتشر في كل نقطه زمنيه مقارنه مع الفئران حقن مع خلايا التحكم. ويبين تحليل الرئتين التي تحتوي علي الانبثاث ان هذا العبء المنتشر المنخفض هو نتيجة لانخفاض كبير في الاستعمار المنتشر وضعف النمو في النقائل التي تشكل. لمزيد من التدليل علي هذه التقنية ، اختبرنا ما إذا كانت الضربات المتزامنة للبروتين المرتبط بنعم (ياب) والمنشط المشترك مع عزر الربط PDZ (تاز) يضعف الاستعمار المنتشر أو النمو اللاحق. ياب و تاز هما المنشطات المشتركة ذات الصلة التي هي المستجيبين المصب الحرجة من مسار فرس النهر. نحن15,16 والبعض الآخر قد تورط ياب و تاز في الانبثاث (راجعت في17,18,19), مما يوحي بان هذه البروتينات هي الأهداف العلاجية الجيدة. باستمرار ، وجدنا ان الفئران حقن مع ياب/تاز الخلايا الضربة القاضية قد خفضت بشكل كبير العبء المنتشر. واظهر تحليل الرئتين ان الخلايا الضربة القاضية ياب/تاز شكلت العديد من الانبثاث اقل وان الانبثاث التي لم تشكل أصغر. توضح هذه التجارب كيف تسمح اختبارات الانبثاث التجريبية للباحث بان يختبر بسرعة وبطريقه غير مكلفه دور الجينات المرشحة في تكوين ونمو الورم الخبيث. وتبين أيضا كيف ان الاستخدام المشترك للتصوير الحيواني الحي والتحديد الكمي الفلوري للنقائل في الرئتين كلها يسمح للباحث بفهم الخطوات بشكل أفضل اثناء الاستعمار المنتشر.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% SDS-PAGE Gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td>Trypsin for tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat bottom white assay plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3922</td>
			<td>For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol wipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For sterolizing the injection site before tail vein injecitons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/C mice (female, 6 weeks)</td>
			<td>Taconic</td>
			<td>BALB-F</td>
			<td>For tail vein metastatic colonization and burden assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA regular</td>
			<td>VWR Ameresco</td>
			<td>97061-416</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lysis buffer</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td></td>
			<td>For collecting protien samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celltreat Syringe Filters, PES 30mm, 0.45 &#956;m</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>40-229749-CS</td>
			<td>For filtering viral supernatant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 and euthanasia chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For euthanasing the mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-luciferase reporter assay kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1960</td>
			<td>For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&39;s phosphate buffered saline</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>TS1006</td>
			<td>For PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-406</td>
			<td>Used to dilute trypsin for tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS 100% US origin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97068-085</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fujifilm LAS-3000 gel imager</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td></td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH(14C10) Rabibit mAb</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2118</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP conjugate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>31460</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human embryonic kidney cells, HEK-293FT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R70007</td>
			<td>Cell line used for packging virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone DMEM/High clucose</td>
			<td>GE Healthcare life sciences</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B, Ultra Pure Grade</td>
			<td>VWR Ameresco</td>
			<td>97064-810</td>
			<td>For antibiotic selection of infected cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td></td>
			<td>For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imagej</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for image analysis of lung metastases: threshold set to 25 &#38; 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immuno-Blot PVDF Membrane</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1620177</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For mouse anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System (in vivo live animal imaging device)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>CLS136340</td>
			<td>For in vivo imaging of metastatic burden</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M205 FA &#38; Lecia DCF3000 G (GFP and bright field filters)</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Microscope and camera for visualing, counting and taking pcitures of metastases in the lungs; 10X magnifacation, 3.5 sec exposure, 1.4 gain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>L3000008</td>
			<td>For YAP/TAZ-TEAD reporter transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image 3.2 (image software program)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Software for IVIS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse breast cancer cells, 4T1</td>
			<td>Karmanos Cancer Institute</td>
			<td>Aslakson, CJ et al.,1992</td>
			<td>Mouse metastatic breast cance cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Gauge version 3.0</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td></td>
			<td>Software for quantifying western blot band intensity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM (transfection buffer)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-062</td>
			<td>For packaging virus and transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA protein assay kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td>For quantifying protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Phosphatase Inhibitor Mini Tablets</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32957</td>
			<td>Added to cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32953</td>
			<td>Added to cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene (hexadimethrine bromide)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>45-H9268</td>
			<td>For infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>45-P7255</td>
			<td>For antibiotic selection of infected cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent restrainer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For restraining mice during tail vein injeciton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE running buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAZ (V3886) Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4883</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBST buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20 automated cell counter</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>For counting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See Table 1 for complete list of vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89404-464</td>
			<td>For visualizing fluorescence in ZSGreen labeled cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western transfer buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XenoLight D-Luciferin K+ Salt</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>122799</td>
			<td>Substrate injected into mice for in vivo bioluminescent IVIS images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (lipid solution for transfection)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6365787001</td>
			<td>For packaging virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YAP (D8H1X) XP Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>14074</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combined use of tail vein metastasis assays and real-time in vivo imaging to quantify breast cancer metastatic colonization and burden in the lungs

الانبثاث هو السبب الرئيسي للوفيات المرتبطة بالسرطان ، وهناك خيارات علاجيه محدوده للمرضي الذين يعانون من مرض منتشر. تحديد واختبار الأهداف العلاجية الجديدة التي من شانها ان تسهل تطوير علاجات أفضل للمرض المنتشر يتطلب السريرية في نماذج الجسم الطبيعي. يظهر هنا نموذج الماوس المتزامن لسلخ سرطان الثدي الاستعمار المنتشر والنمو اللاحق. الخلايا السرطانية المنتشرة محوله بشكل ثابت مع ناقلات الفيروسية ترميز لوسيفيراز اليراع و zsgreen البروتينات. ثم يتم التلاعب بالجينات المرشحة بثبات في luciferase/ZsGreen-التعبير عن الخلايا السرطانية ومن ثم يتم حقن الخلايا في الفئران عبر الوريد الذيل الجانبي لفحص الاستعمار المنتشر والنمو. ثم يستخدم جهاز تصوير في الجسم الحي لقياس التلالؤ الإحيائي أو الفلوري للخلايا السرطانية في الاحياء الحيوانية من أجل قياس التغيرات في العبء المنتشر علي مر الزمن. التعبير عن البروتين الفلوري يسمح عدد وحجم الانبثاث في الرئتين ليتم تحديدها كميا في نهاية التجربة دون الحاجة إلى التقطيع أو تلطيخ النسيجية. يوفر هذا النهج طريقه سريعة وسهله نسبيا لاختبار دور الجينات المرشحة في الاستعمار المنتشر والنمو ، ويوفر قدرا كبيرا من المعلومات أكثر من الاختبارات التقليدية لورم خبيث في الوريد الخلفي. باستخدام هذا النهج ، ونحن نظهر ان الضربة القاضية في وقت واحد من نعم البروتين المرتبطة (ياب) والمنشط المشترك مع عزر PDZ ملزمه (تاز) في خلايا سرطان الثدي يؤدي إلى انخفاض عبء المنتشر في الرئتين وان هذا العبء المخفض هو نتيجة لضعف كبير في الاستعمار المنتشر وانخفاض نمو الانبثاث.

لإظهار النهج المذكور أعلاه ، قمنا باجراء دليل علي تجربه المفهوم الذي عامل النسخ المتماثل الحرجة ، RPA3 وقد أسقطت في خط خليه سرطان الثدي المنتشرة الفئران (4T122). في حين ان البروتوكول يصف وصف الخلايا مع كل من لوسيفيراز والبروتينات الفلورية قبل التلاعب الوراثية ، استخدمنا نهج معدله ...

Watch this Scientific Journal Video about Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs at JoVE.co

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

النهج الموصوف يجمع بين اختبارات الانبثاث الوريد الذيل التجريبية مع في الجسم الحية التصوير الحيواني للسماح الرصد في الوقت الحقيقي لتكوين ورم خبيث سرطان الثدي والنمو بالاضافه إلى التحديد الكمي للعدد الانبثاث وحجم في الرئتين.

الجمع بين استخدام الذيل الوريد الانبثاث الاختبارات والوقت الحقيقي في التصوير فيفو لقياس سرطان الثدي الاستعمار المنتشر والعبء في الرئتين

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

يمكن استخدام بروتوكولنا لاختبار دور أي جين مرشح في الاستعمار والنمو السريع والسهل. كما يسمح البروتوكول بالرصد الفعلي للنقائل والتشكيل والنمو، بالإضافة إلى القياس الكمي لعدد الانبثاث والحجم في نفس الحيوانات دون الحاجة إلى استئصالها أو تلطيخ النسيج. لوحة أربع خلايا T1 في 150، 000 خلية في بئر في لوحة 12-جيدا في وسائل الإعلام النمو الكامل.احتضان في 37 درجة مئوية 5٪ ثاني أكسيد الكربون بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، تُفطّن وسائل الإعلام من الخلايا. إضافة 500 ميكرولترات من لوسيفراز الفيروسية مفتاح و 500 ميكرولترات من البروتين الفلورسنت الفيروسية الفائقة لتصيب الخلايا في وقت واحد مع كل من لوسيفيراز والفلورسنت البروتين الفيروسية.ثم، إضافة ميكرولتر واحد من ثمانية ملليغرام لكل ملليلتر بروميد سداسي عشري واحتضان في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 إلى 48 ساعة. تريبسينيز الخلايا الأربع T1 مع 500 ميكرولترات من التربسين. بعد دقيقتين إلى خمس دقائق، نقل جميع الخلايا إلى طبق ستة سنتيمترات في أربعة ملليلتر من وسائل الإعلام اختيار، وبالتالي إخماد التربسين.بعد اكتمال الاختيار، تأكد من أن الخلايا الأربع المصابة T1 تعبر عن البروتين الفلوري ZsGreen باستخدام مجهر فلوري مقلوب في 50 إلى 100 مرة التكبير. تأكد أيضا من أن الخلايا الأربع المصابة T1 تعبر عن لوسيفراز باستخدام مجموعة أنشطة لوسيفراز المتاحة تجاريا. المضي قدما في تنفيذ التحسين من في التصميم التجريبي في الجسم الحي كما هو موضح في بروتوكول النص.استلهمي الوسائط وشطفي لوحات الخلايا بـ 1X PBS. تبسينيزي الخلايا مع خمسة ملليلتر من التربسين لكل 15 لوحة سنتيمتر لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق ونقل جميع الخلايا إلى أنبوب مخروطي. غسل الخلايا المتبقية من طبق ثقافة الأنسجة مع ما يكفي من وسائل الإعلام نمو كامل لإخماد التربسين.أضف الغسيل إلى نفس الأنبوب المخروطي. عد الخلايا باستخدام عداد خلية تلقائي لتحديد إجمالي عدد الخلايا. بعد ذلك، الطرد المركزي الخلايا في 122 مرة G لمدة ثلاث دقائق، ويتبخر المابير.إعادة تعليق الخلايا في 1X PBS في التركيز المطلوب. هنا، يتم حقن 25،000 خلية في كل فأر و 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني. إذاً الخلايا التي أعيد تعليقها هي 250,000 خلية لكل ملليلترإبقاء تعليق الخلية على الجليد حتى الحقن. العمل في غطاء محرك السيارة في منشأة الحيوان، بلطف ولكن خلط الخلايا بدقة عن طريق عكس أنبوب أو باستخدام حقنة ملليلتر واحد لضمان أن يتم إعادة تعليق بشكل موحد. الآن، تحميل حقنة واحدة ملليلتر لور لوك مع تعليق الخلية وطرد فقاعات الهواء الزائدة.ضع إبرة قياس نصف بوصة 30 على الحقنة مع شطبة وطرد فقاعات الهواء. ضع الفأر برفق في تقييد القوارض. وينبغي أن يكون الوريد الجانبي الخلفي مرئياً ومتوسعاً.إذا لم يكن كذلك، قرصة بلطف قاعدة الذيل وتراجع الذيل في ماء الصنبور الدافئ لتمدد الأوردة. استخدام مسح الكحول لتنظيف الذيل، ثم أدخل الإبرة في الوريد الذيل، شطب الجانب حتى، وحقن 100 ميكرولترات من تعليق الخلية. إذا تم إدخال الإبرة بشكل صحيح في الوريد، فإنه ينبغي أن تنزلق بسهولة قليلا إلى الأمام والخلف، ويجب أن لا تكون هناك مقاومة عندما يتم دفع المكبس.وينبغي أن تؤدي الحقن الناجحة أيضا في تدفق اللون الأزرق في الوريد يتحول الأبيض لبضع ثوان بعد الحقن. إزالة ببطء الإبرة، واستخدام الشاش العقيم، وتطبيق الضغط على موقع الحقن لوقف أي نزيف. العودة إلى قفص الماوس ورصد لمدة 15 دقيقة لضمان الشفاء الكامل.قم بتشغيل جهاز التصوير الحي لحية vivo، وفتح برنامج الصور، وتسجيل الدخول. انقر فوق الزر تهيئة وانتظر حتى يتم تهيئة الجهاز. تغيير حقل العرض إلى D.For لأول مرة استخدام، تحرير إعدادات التعريض الضوئي بالنقر على تحرير، تفضيلات، الحصول، والتعرض التلقائي.تغيير الحد الأقصى لوقت التعرض من الافتراضي 60 ثانية إلى 300 ثانية وانقر فوق "موافق". تحميل حقنة ملليلتر واحد مع D-luciferin، ثم إضافة إبرة قياس نصف بوصة 30 إلى الحقنة وطرد فقاعات الهواء. قياس وتسجيل كتلة الماوس المُجلّد.تقييد الماوس عن طريق معسر scruff من الرقبة باستخدام أصابع الإبهام والمؤشر واستيعاب الذيل بين الإصبع الخنصر وقاعدة اليد. عكس الماوس في زاوية 45 درجة مع رأسه مشيرا إلى أسفل. أدخل الإبرة، مشطرة الجانب لأعلى، في مساحة IP الجانب الأيسر للماوس.تأكيد الإدخال في مساحة IP عن طريق سحب وحدة تخزين صغيرة. لا ينبغي أن يكون هناك لون في قاعدة الإبرة عند سحب مرة أخرى في الفضاء IP. حقن الحجم المناسب من D-luciferin لجرعة من 150 ملليغرام لكل كيلوغرام.مباشرة بعد إدارة D-luciferin، بدء جهاز ضبط الوقت. ضع مسطحة الماوس على ظهرها في جهاز التصوير مع أنفه في مخروط الأنف، وتأكد من أن يتم إعطاء واحد إلى نصف إلى اثنين ونصف في المئة isoflurane. انقر على مربعات الإنارة والصورة.تغيير وقت التعرض إلى تلقائي، ثم انقر فوق الحصول على في لوحة التحكم الامتلاك. بعد التصوير، ارجع الفأر إلى قفصه وراقبه لمدة 15 دقيقة لضمان الشفاء التام. بعد القتل الرحيم، كما هو موضح في بروتوكول النص، عزل وإزالة الرئتين من كل فأر وشطف في برنامج تلفزيوني 1X لإزالة الدم الزائد.الحصول على صور من الانبثاث ZsGreen في الفصوص في 10X في برايتفيلد وفلوريسنس باستخدام منظار الفلورسنت مع مرشح الفرقة واسعة GFP. استخدام برنامج تحليل الصور لتحديد حجم وعدد الانبثاث من الصور. لمعالجة وتحليل البيانات من الصور المكتسبة مع جهاز التصوير الحي لحية في في، فتح جميع ملفات الصور لكل فأرة في برنامج الصورة.تأكد من أن الوحدات في إشعاع للبيانات الإنارة الحيوية والكفاءة لبيانات الفلورسنت بالنقر فوق السهم في أعلى يسار نافذة الصورة وتغييره إلى الوحدة المناسبة. استخدم الصورة من نقطة الوقت الأخيرة لإنشاء منطقة ذات أهمية، أو عائد الاستثمار، من خلال النقر أولاً على أدوات عائد الاستثمار في نافذة لوحة الأدوات. ثم قم بإدراج عائد استثمار واحد بالنقر فوق السهم وتحديد أحد.انقر على حدود العائد على الاستثمار ونقله إلى صدر الماوس. ضبط حجم العائد على الاستثمار بحيث يغطي الصدر من الماوس ولا يستبعد إشارة. ثم انقر فوق قياس ROIs ونسخ أو اكتب الرقم الخام في ورقة Excel.رسم وتحليل البيانات كما هو موضح في بروتوكول النص. انقر بزر الماوس الأيمن في ملف الصورة لنسخ العائد على الاستثمار ، ثم لصقه في ملفات الصور من النقاط الزمنية الأخرى وانقر فوق قياس ROIs. ناقلات الفيروس الرجعية التعبير عن جنبا إلى جنب مير-30 القائم على shRNAs تستهدف كل من YAP وTAZ يقلل من يعب وضريبة التعبير عن البروتين والنشاط النسخي في أربع خلايا T1.تم نقل أربع خلايا لوكافيراز T1 بشكل ثابت مع نسخة ZsGreen التعبير عن هذا الناقل YAP / TAZ SHRNA جنبا إلى جنب أو رنا مير-30 تسيطر عليها القائم على shRNA. تظهر الصور الإنارة الحيوية أن المعدل الذي زاد به العبء النقيلي كان أسرع بكثير في الفئران التي تم حقنها بالخلايا التحكمية مقارنة بالفئران التي تم حقنها بالخلايا النازلة YAP/TAZ. مؤامرة من log10 تحول إشارة لوسيفيراز تقاس لكل ماوس على مدى التجربة يظهر أيضا أن معدل كان أسرع في الفئران حقن مع خلايا التحكم مقارنة مع الفئران حقن مع الخلايا ضربة قاضية YAP / TAZ.عدد أقل بكثير من الانبثاث التي تشكلت في الفئران حقن مع الخلايا الضربة القاضية YAP / TAZ مقارنة مع الفئران مع خلايا التحكم عند عدها يدويا. ولوحظ نفس الاتجاه عند استخدام برنامج تحليل الصور. لم يقتصر الأمر على أن العديد من الانبثاثات أكثر شكل في الفئران التحكم، لكنها كانت عموما أكبر.باستمرار، تم أيضا تخفيض العبء النقيلي في الرئتين بشكل كبير من قبل YAP / TAZ الضربة القاضية. الحقن الناجح لأعداد متساوية من الخلايا السليمة في كل فأر أمر بالغ الأهمية لضمان بيانات عالية الجودة. تذكر أن نحذر واتبع إرشادات السلامة عند العمل مع الفيروسات الرجعية المعدية وفيروسات العدس، خاصة إذا كانت الفيروسات معدية بشرية.وقد سمحت لنا هذه التقنية لتوضيح أدوار الجينات المرشحة والإستعماء والنمو النقيلي، مما يوفر طريقة لتحديد واختبار الأهداف العلاجية الجديدة لعلاج الأمراض النقيلي. بعد هذا الإجراء، يمكن تحليل الانبثاث التي تحتوي على الرئتين عن طريق التلطيخ المناعي أو النسيجي للتحقق من كيفية تأثير الجين المعدل على الانبثاث وتحديد البروتينات الأخرى التي قد تكون متورطة.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis

داخل الحرقفي حقن الشريان للنمذجة فعالة وانتقائية مجهرية العظام الانبثاث

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely ...

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Coculture فحوصات لدراسة البلاعم والخلايا الدبقية الصغيرة تحفيز من ورم أرومي دبقي الغزو

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

المتقدم نموذج حيواني من القولون والمستقيم ورم خبيث في الكبد: تقنيات التصوير وخصائص النقيلي النسخ

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

الاستفادة من علم الجينوم وظيفية الفرز لتحديد أهداف المخدرات رواية يحتمل في الثقافات كروي الخلية السرطانية

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

والوريد البابي حقن نموذج لدراسة الكبد الانبثاث من سرطان الثدي

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

الاعتبارات العملية في دراسة الاستعمار الرئة المنتشر في أوستيوساركوما باستخدام مقايسة خبيث الرئوية

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

التحليل الجزئي للخلايا السرطانية المتداولة للتحليل الجزيئي المصب والتقييم المحتمل المنتشر

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

التحليل المرضي لنقائل الرئة بعد الحقن الجانبي الوريد الذيل من الخلايا السرطانية

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

استخدام تحليل الصور القائم على الكمبيوتر لتحسين القياس الكمي لنقائل الرئة في نموذج سرطان الثدي 4T1

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

Modeling Brain Metastasis Via Tail-Vein Injection of Inflammatory Breast Cancer Cells

نمذجة ورم خبيث في الدماغ عن طريق حقن الوريد الخلفي لخلايا سرطان الثدي الالتهابية

Metastatic spread to the brain is a common and devastating manifestation of many types of cancer. In the United States alone, about 200,000 patients are ...