Name: combined use of tail vein metastasis assays and real-time in vivo imaging to quantify breast cancer metastatic colonization and burden in the lungs
Uploaded: 2019-12-19T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs at JoVE.co

Vi takker Emily Norton for at hjælpe med virusinfektioner og kritisk læsning af manuskriptet. Vi takker også Ryan Kanai for hjælp til at erhverve billeder af lungerne og Kate E. Tubbesing for at få hjælp til billedanalyse af de grønne metastaser i lungerne. Vi takker dyreforsknings facilitetens personale for deres støtte og for hjælp til forberedelsen af denne video. Dette arbejde blev støttet af en Susan G. Komen Career Catalyst Grant, der blev tildelt J.M.L. (#CCR17477184).

Denne protokol omfatter brug af mus og biologisk farlige materialer og kræver godkendelse fra de relevante institutionelle sikkerhedsudvalg. Alle de beskrevne in vivo arbejde her er godkendt af Albany Medical College institutionel dyrepleje og brug udvalg (IACUC).
Bemærk: for en protokol oversigt, se skematisk i figur 1.
1. emballering af alle påkrævede retrovira og lentivira
Bemærk: den beskrevne protokol...

Kritiske trin i metoden Det er afgørende at optimere antallet af injicerede celler (trin 3) for en given cellelinje og musestamme, da dette i høj grad kan påvirke antallet af metastaser, der dannes, og længden af eksperimentet. Hvis der injiceres for mange celler, eller hvis metastaser vokser for længe, kan det være svært at tælle metastaser, hvilket gør det vanskeligt at vurdere virkningerne af den genetiske manipulation. Men, hvis for få celler injiceres, få eller ingen metastaser kan dan...

Kræft er fortsat den anden førende dødsårsag verdensomspændende1 og metastase er ansvarlig for de fleste af disse dødsfald2,3. En begrænset forståelse af de molekylære mekanismer, der regulerer metastatisk kolonisering og efterfølgende vækst, har imidlertid hindret udviklingen af effektive behandlinger for metastatisk sygdom. Identifikationen af nye terapeutiske mål kræver en analyse for at teste, hvordan rystet udtryk eller funktion af et kandidat-gen påvirker metastase dannelse og vækst. Mens autoktont musemodeller har deres fordele, er de tidskrævende og dyre at generere, hvilket gør dem mere velegnede til målvalidering i stedet for Målsøgning. Transplantations modelsystemer, hvor kandidat genet er rystet i kræftceller in vitro og derefter virkninger på metastatisk potentiale vurderes in vivo, er billigere og højere gennemløb end autoktone modeller. Desuden er virale vektorer for stabil levering af RNAi, crispr/CAS9, og Trans Genes er bredt tilgængelige, hvilket gør det relativt let at forstyrrer næsten ethvert gen eller gener af interesse i en Cancer cellelinjer. Denne fremgangsmåde kan også bruges til at assay rollen af kandidat gener i metastatisk kolonisering og vækst i humane Cancer cellelinjer ved at transplanteres cellerne til immunkompromitterede eller humaniserede mus.
De to typer af assays, der anvendes til at teste metastase dannelse ved transplanterede cancerceller in vivo er spontane metastase assays og eksperimentelle metastase assays. I spontane metastase assays4,5, kræftceller injiceres i mus, lov til at danne en primær tumor, og derefter spontan metastase dannelse og efterfølgende vækst er analyseret. Styrken af denne model er, at cellerne skal fuldføre alle trin i den metastatiske proces for at danne metastatiske tumorer. Men, mange kræft cellelinjer ikke metastaserer effektivt i spontane metastase modeller, og enhver manipulation af de celler, der påvirker primær tumorvækst kan tolerere resultaterne af metastase assay. Eksperimentelle metastase assays, hvor kræftceller injiceres direkte i omløb, anvendes til at undgå disse faldgruber. Almindeligt eksperimentelle metastase assays omfatter hale vene injektion6,7,8 (og påvist her), intrakardiel injektion9, og Portal vene injektion10.
Formålet med protokollen præsenteres her er at give en in vivo eksperimentel metastase assay, der giver en forsker til at overvåge metastase dannelse og vækst i realtid, samt at kvantificere slutpunktet metastase nummer og størrelse i lungerne af samme mus. For at opnå dette, traditionelle eksperimentelle hale vene metastaser assays6,7,8 kombineres med levende dyr billeddannelse, ved hjælp af en in vivo billedenhed9,11,12,13,14. Tumor celler, der stabilt udtrykker både der og et fluorescerende protein injiceres i mus via den laterale hale vene, og derefter anvendes in vivo billedenheden til at måle ændringer i metastatisk belastning i lungerne over tid (figur 1). In vivo Live Animal Imaging-enheden kan dog ikke skelne mellem eller måle størrelsen af individuelle metastaser. Ved afslutningen af forsøget anvendes et fluorescerende stereomicroskop til at tælle antallet og måle størrelsen af de fluorescerende metastaser i lungerne uden behov for skæring og histologi eller Immunhistokemi (figur 1). Denne protokol kan bruges til at teste, hvordan ændring af udtryk eller funktion af et kandidat-gen påvirker metastase dannelse og vækst. Potentielle terapeutiske forbindelser såsom små molekyler eller funktions blokerende antistoffer kan også testes.
For at demonstrere denne tilgang, vi først udført et bevis for koncept eksperiment, hvor den væsentlige replikation faktor, replikation protein a3 (RPA3) er slået ned i metastatisk mus brystkræft celler. Vi viser, at mus injiceret med RPA3 Knockdown celler har betydeligt mindre metastatisk byrde på hvert tidspunkt i forhold til mus injiceres med kontrol celler. Analyse af de metastase-holdige lunger viser, at denne reducerede metastatiske byrde er resultatet af signifikant reduceret metastatisk kolonisering og nedsat vækst af de metastaser, der dannes. For yderligere at demonstrere denne teknik, vi testede, om samtidige knock down af ja associerede protein (YAP) og transkriptional Co-aktivator med en PDZ-bindende motiv (TAZ) hæmmer metastatisk kolonisering eller efterfølgende vækst. YAP og TAZ er to relaterede transkriptionelle Co-aktivatorer, der er de kritiske downstream effektorer af Hippo pathway. Vi15,16 og andre har impliceret Yap og Taz i metastase (revideret i17,18,19), tyder på, at disse proteiner er gode terapeutiske mål. Konsekvent, vi fandt, at mus injiceres med YAP/TAZ Knockdown celler havde signifikant reduceret metastatisk byrde. Analyse af lungerne viste, at YAP/TAZ Knockdown celler dannede mange færre metastaser, og at de metastaser, der gjorde form var mindre. Disse eksperimenter viser, hvordan eksperimentelle metastase assays giver en forsker til hurtigt og billigt at teste rollen af et kandidat-gen i metastase dannelse og vækst. De viser yderligere, hvordan den kombinerede anvendelse af levende animalsk billeddannelse og fluorescerende kvantificering af metastaser i hele lunger gør det muligt for forskeren bedre at forstå trinene under metastatisk kolonisering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% SDS-PAGE Gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td>Trypsin for tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat bottom white assay plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3922</td>
			<td>For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol wipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For sterolizing the injection site before tail vein injecitons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/C mice (female, 6 weeks)</td>
			<td>Taconic</td>
			<td>BALB-F</td>
			<td>For tail vein metastatic colonization and burden assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA regular</td>
			<td>VWR Ameresco</td>
			<td>97061-416</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lysis buffer</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td></td>
			<td>For collecting protien samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celltreat Syringe Filters, PES 30mm, 0.45 &#956;m</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>40-229749-CS</td>
			<td>For filtering viral supernatant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 and euthanasia chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For euthanasing the mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-luciferase reporter assay kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1960</td>
			<td>For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&39;s phosphate buffered saline</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>TS1006</td>
			<td>For PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-406</td>
			<td>Used to dilute trypsin for tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS 100% US origin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97068-085</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fujifilm LAS-3000 gel imager</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td></td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH(14C10) Rabibit mAb</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2118</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP conjugate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>31460</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human embryonic kidney cells, HEK-293FT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R70007</td>
			<td>Cell line used for packging virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone DMEM/High clucose</td>
			<td>GE Healthcare life sciences</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B, Ultra Pure Grade</td>
			<td>VWR Ameresco</td>
			<td>97064-810</td>
			<td>For antibiotic selection of infected cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td></td>
			<td>For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imagej</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for image analysis of lung metastases: threshold set to 25 &#38; 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immuno-Blot PVDF Membrane</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1620177</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For mouse anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System (in vivo live animal imaging device)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>CLS136340</td>
			<td>For in vivo imaging of metastatic burden</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M205 FA &#38; Lecia DCF3000 G (GFP and bright field filters)</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Microscope and camera for visualing, counting and taking pcitures of metastases in the lungs; 10X magnifacation, 3.5 sec exposure, 1.4 gain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>L3000008</td>
			<td>For YAP/TAZ-TEAD reporter transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image 3.2 (image software program)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Software for IVIS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse breast cancer cells, 4T1</td>
			<td>Karmanos Cancer Institute</td>
			<td>Aslakson, CJ et al.,1992</td>
			<td>Mouse metastatic breast cance cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Gauge version 3.0</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td></td>
			<td>Software for quantifying western blot band intensity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM (transfection buffer)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-062</td>
			<td>For packaging virus and transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA protein assay kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td>For quantifying protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Phosphatase Inhibitor Mini Tablets</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32957</td>
			<td>Added to cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32953</td>
			<td>Added to cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene (hexadimethrine bromide)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>45-H9268</td>
			<td>For infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>45-P7255</td>
			<td>For antibiotic selection of infected cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent restrainer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For restraining mice during tail vein injeciton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE running buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAZ (V3886) Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4883</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBST buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20 automated cell counter</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>For counting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See Table 1 for complete list of vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89404-464</td>
			<td>For visualizing fluorescence in ZSGreen labeled cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western transfer buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XenoLight D-Luciferin K+ Salt</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>122799</td>
			<td>Substrate injected into mice for in vivo bioluminescent IVIS images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (lipid solution for transfection)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6365787001</td>
			<td>For packaging virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YAP (D8H1X) XP Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>14074</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combined use of tail vein metastasis assays and real-time in vivo imaging to quantify breast cancer metastatic colonization and burden in the lungs

Metastase er hovedårsagen til kræftrelaterede dødsfald, og der er begrænsede terapeutiske muligheder for patienter med metastatisk sygdom. Identifikation og afprøvning af nye terapeutiske mål, der vil lette udviklingen af bedre behandlinger for metastatisk sygdom, kræver prækliniske in vivo-modeller. Demonstreret her er en og musemodel for bestemmelse brystkræft metastatisk kolonisering og efterfølgende vækst. Metastatiske kræftceller er stabilt transduceret med virale vektorer kodning Firefly der og zsgreen proteiner. Kandidat gener er derefter stabilt manipuleret i luciferase/ZsGreen-udtrykker kræftceller og derefter cellerne injiceres i mus via den laterale hale vene til at assay metastatisk kolonisering og vækst. En in vivo Billeddannende anordning anvendes derefter til at måle tumor cellernes bioluminescens eller fluorescens i de levende dyr for at kvantificere ændringer i metastatisk byrde over tid. Udtrykket af det fluorescerende protein gør det muligt at kvantificere antallet og størrelsen af metastaser i lungerne ved afslutningen af forsøget uden behov for skæring eller histologisk farvning. Denne tilgang giver en relativt hurtig og nem måde at teste rollen af kandidat gener i metastatisk kolonisering og vækst, og giver en hel del mere information end traditionelle hale vene metastase assays. Ved hjælp af denne tilgang viser vi, at samtidig Knockdown af ja associeret protein (YAP) og transkriptional Co-aktivator med et PDZ-bindende motiv (TAZ) i brystkræft celler fører til reduceret metastatisk byrde i lungerne, og at denne reducerede byrde er resultatet af signifikant forringet metastatisk kolonisering og reduceret vækst af metastaser.

For at demonstrere ovenstående fremgangsmåde udførte vi et proof of concept-eksperiment, hvor en kritisk Replikerings faktor, RPA3 blev slået ned i en metastatisk mus brystkarcinom cellelinje (4t122). Mens protokollen beskriver mærkning cellerne med både der og fluorescerende proteiner forud for genetisk manipulation, vi brugte en modificeret tilgang, fordi RNAi vektorer også levere zsgreen (figur 2a). For det første var 4t1 celler stabilt tra...

Watch this Scientific Journal Video about Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs at JoVE.co

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Den beskrevne fremgangsmåde kombinerer eksperimentelle hale vene metastase assays med in vivo levende dyr billeddannelse at tillade real-time overvågning af brystkræft metastase dannelse og vækst i tillæg til kvantificering af metastase antal og størrelse i lungerne.

Kombineret brug af hale vene metastase assays og Real-Time in vivo billeddannelse at kvantificere brystkræft metastatisk kolonisering og byrde i lungerne

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Vores protokol kan bruges til hurtigt og nemt at teste rollen som kandidat gen i metastatisk kolonisering og vækst. Protokollen giver også realtime overvågning af metastase, dannelse og vækst, samt kvantificering af metastase antal og størrelse i de samme dyr uden behov for resektion eller histologisk farvning. Plade fire T1 celler ved 150, 000 celler pr brønd i en 12-brønd plade i komplette vækstmedier.Inkubere ved 37 grader Celsius 5% kuldioxid natten over. Den næste dag, aspirere vækstmedier fra cellerne. Der tilsættes 500 mikroliter luciferase viral supernatant og 500 mikroliter fluorescerende protein viral supernatant for samtidig at inficere cellerne med både luciferase og fluorescerende protein virale supernatanter.Derefter tilsættes en mikroliter på otte milligram pr. milliliter hexadimethrinebromid og inkuberes ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i 24 til 48 timer. Trypsinize de fire T1 celler med 500 mikroliter trypsin. Efter to til fem minutter overføres alle cellerne til en seks centimeter høj i fire milliliter markeringsmedier, hvorved trypsinen slukkes.Efter udvælgelsen er færdig, bekræfte, at de inficerede fire T1 celler udtrykker ZsGreen fluorescerende protein ved hjælp af en omvendt fluorescerende mikroskop ved 50 til 100 gange forstørrelse. Også bekræfte, at de inficerede fire T1 celler udtrykker luciferase ved hjælp af en kommercielt tilgængelig luciferase aktivitet kit. Fortsæt med at udføre optimering af in vivo eksperimentelle design som beskrevet i tekstprotokollen.Aspirer mediet og skyl cellepladerne med 1X PBS. Trypsinize cellerne med fem milliliter trypsin pr 15 centimeter plade i to til fem minutter og overføre alle cellerne til et konisk rør. Vask resterende celler fra vævskulturskålen med nok komplette vækstmedier til at slukke trypsinen.Tilsæt vask til samme koniske rør. Tæl cellerne ved hjælp af en automatisk celletæller for at bestemme det samlede cellenummer. Dernæst centrifuge cellerne på 122 gange G i tre minutter, og aspirere supernatant.Re-suspendere cellerne i 1X PBS ved den ønskede koncentration. Her sprøjtes 25.000 celler ind i hver mus og 100 mikroliter PBS. Så de re-suspenderet celler er på 250, 000 celler pr milliliter.Hold cellesuspensionerne på isen indtil injektionen. Arbejde i en hætte på dyret facilitet, forsigtigt men grundigt blandes cellerne ved at vende røret eller ved hjælp af en en milliliter sprøjte for at sikre, at de er ensartet re-suspenderet. Nu indlæse en en milliliter Luer Lock sprøjte med celle suspension og udvise overskydende luftbobler.Placer en halv tomme 30 gauge nål på sprøjten med facet op og udvise luftbobler. Forsigtigt placere musen i en gnaver fastholdelsesplads. Den laterale hale vene skal være synlige og udvidede.Hvis ikke, forsigtigt klemme bunden af halen og dyppe halen i varmt vand fra hanen til at spile venerne. Brug en alkohol tørre til at rense halen, derefter indsætte nålen i halen vene, facet side op, og injicere 100 mikroliter af celle suspension. Hvis nålen indsættes korrekt i venen, skal den nemt glide lidt frem og tilbage, og der bør ikke være modstand, når stemplet skubbes.Vellykkede injektioner bør også resultere i en flush, hvor den blå farve vene bliver hvid i et par sekunder efter injektionen. Fjern langsomt nålen, og brug en steril gaze, tryk på injektionsstedet for at stoppe enhver blødning. Returner musen til sit bur og overvåge i 15 minutter for at sikre fuld helbredelse.Tænd for in vivo live dyrebilleddannelsesenheden, åbn billedsoftwaren, og log på. Klik på initialiseringsknappen, og vent på, at maskinen initialiserer. Rediger synsfeltet til D.Brug første gang skal du redigere eksponeringsindstillingerne ved at klikke på rediger, indstillinger, anskaffelse og automatisk eksponering.Skift den maksimale eksponeringstid fra standard 60 sekunder til 300 sekunder, og klik okay. Læg en en milliliter sprøjte med D-luciferin, derefter tilføje en halv tomme 30 gauge nål til sprøjten og udvise luftbobler. Mål og optag massen af en bedøvet mus.Begrænse musen ved at klemme scruff af halsen ved hjælp af tommelfingeren og pointer fingre og gribe halen mellem pinky finger og bunden af hånden. Inverter musen i en 45 graders vinkel med hovedet pegende nedad. Sæt nålen, skråt side op, i musens venstre side IP-rum.Bekræft adgang til IP-rummet ved at trække en lille diskenhed tilbage. Der bør ikke være farve i bunden af nålen, når du trækker tilbage i IP-rummet. Injicer den passende mængde D-luciferin til en dosis på 150 mg/kg.Umiddelbart efter D-luciferin administration, starte en timer. Placer musen fladt på ryggen i billeddannelse enhed med næsen i næsen kegle, og sikre, at den ene halvdel til to og en halv procent isofluran administreres. Klik på lysstof- og fotoboksene.Skift eksponeringstiden til automatisk, og klik derefter på hentning i anskaffelseskontrolpanelet. Efter billeddannelse skal musen vende tilbage til buret og overvåge i 15 minutter for at sikre fuld helbredelse. Efter aktiv dødshjælp, som beskrevet i tekstprotokollen, isolere og fjerne lungerne fra hver mus og skyl i 1X PBS at fjerne overskydende blod.Anskaf billeder af ZsGreen metastaser i lapperne ved 10X i Brightfield og fluorescens ved hjælp af et fluorescerende stereoscope med et GFP-bredbåndsfilter. Brug billedanalysesoftware til at kvantificere størrelsen og antallet af metastaser fra billederne. Hvis du vil behandle og analysere data fra de billeder, der er anskaffet med in vivo live dyrebilledenheden, skal du åbne alle billedfiler for hver mus i billedsoftwaren.Sørg for, at enhederne er i udstråling for bioluminescerende data og effektivitet for fluorescerende data ved at klikke på pilen øverst til venstre i billedvinduet og ændre den til den relevante enhed. Brug billedet fra sidste tidspunkt til at oprette et område af interesse eller et investeringsafkast ved først at klikke på investeringsafkastetværktøjer i værktøjspaletvinduet. Indsæt derefter et investeringsafkast ved at klikke på pilen og vælge et.Klik på kanten af investeringsafkastet og flytte den over til brystet af musen. Juster størrelsen på investeringsafkastet, så det dækker musens brystkasse og udelukker ikke signal. Klik derefter på målafrene, og kopiér eller skriv rånummeret i et Excel-ark.Afbild og analyser dataene som beskrevet i tekstprotokollen. Højreklik i billedfilen for at kopiere investeringsafkastet, indsæt det derefter i billedfiler fra de andre tidspunkter, og klik på målafrene. Retroviral vektor udtrykke tandem miR-30-baserede shRNAs rettet mod både YAP og TAZ reducerer YAP og skat protein udtryk og transskriptionel aktivitet i fire T1 celler.Fire T1 luciferase celler blev stabilt transduced med en ZsGreen udtrykke version af denne tandem YAP / TAZ shRNA vektor eller en kontrolleret miR-30-baserede shRNA. Bioluminescerende billeder viser, at den hastighed, hvormed metastatisk byrde steg, var betydeligt hurtigere hos de mus, der blev injiceret med kontrolceller sammenlignet med mus injiceret med YAP/TAZ knockdown-celler. Et plot af log10 omdannet luciferase signal målt for hver mus i løbet af forsøget viser også, at hastigheden var hurtigere i mus injiceres med kontrolceller sammenlignet med mus injiceres med YAP / TAZ knockdown celler.Betydeligt færre metastaser dannet i mus injiceres med YAP / TAZ knockdown celler sammenlignet med mus med kontrolceller, når tælles manuelt. Den samme tendens blev observeret, når du bruger billedet analyse software. Ikke alene har mange flere metastaser form i kontrolmus, men de var generelt større.Konsekvent, den metastatiske byrde i lungerne blev også drastisk reduceret ved YAP / TAZ knockdown. Vellykket injektion af lige mange raske celler i hver mus er afgørende for at sikre data af høj kvalitet. Husk at udvise forsigtighed og følge sikkerhedsretningslinjer, når du arbejder med infektiøse retrovirus og lentivirus, især hvis virus er menneskelige infektiøse.Denne teknik har givet os mulighed for at illustrere roller kandidat gener og metastatisk kolonisering og vækst, der giver en måde at identificere og teste nye terapeutiske mål for behandling af metastatisk sygdom. Efter denne procedure kan metastaser indeholdende lunger analyseres yderligere ved immunfluorescerende eller histologisk farvning for at undersøge, hvordan det ændrede gen påvirker metastaser og identificerer andre proteiner, der kan være involveret.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis

Intra-iliaca Artery Injection til effektiv og selektiv Modellering af mikroskopiske knoglemetastaser

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely ...

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Cokultur Analyser til Undersøgelse makrofag og Mikroglia Stimulering af glioblastoma Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

Advanced Animal Model af kolorektal Metastase i Lever: Imaging teknikker og Ejendomsstyrelsen mod metastatiske kloner

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Ved hjælp af Functional Genomics Screening at identificere potentielt nyt lægemiddel mod cancer Cell sfæroide Cultures

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

En Portal Vein Injection Model at studere levermetastaser af brystkræft

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

Praktiske overvejelser i studere metastatisk lunge kolonisering i Osteosarcoma ved hjælp af pulmonale metastaser Assay

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Micromanipulation af cirkulerende tumor celler til downstream Molekylær analyse og metastatisk potentiel vurdering

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Patologisk analyse af lungemetasase Efter Lateral Hale-Vene Injektion af tumorceller

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

Brug computer-baseret billedanalyse til at forbedre kvantificeringen af lungemetastase i 4T1 Breast Cancer Model

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

Modeling Brain Metastasis Via Tail-Vein Injection of Inflammatory Breast Cancer Cells

Modellering af hjernemetastase via haleveneinjektion af inflammatoriske brystkræftceller

Metastatic spread to the brain is a common and devastating manifestation of many types of cancer. In the United States alone, about 200,000 patients are ...