Name: combined use of tail vein metastasis assays and real-time in vivo imaging to quantify breast cancer metastatic colonization and burden in the lungs
Uploaded: 2019-12-19T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs at JoVE.co

We danken Emily Norton voor het bijstaan van virale infecties en het kritisch lezen van het manuscript. We bedanken Ryan Kanai ook voor hulp bij het verwerven van beelden van de longen en Kate E. Tubbesing voor hulp bij beeldanalyse van de groene metastasen in de longen. We danken het personeel van de dierenonderzoekfaciliteit voor hun ondersteuning en voor hulp bij de voorbereiding van deze video. Dit werk werd gesteund door een Susan G. komen Career Catalyst subsidie die werd toegekend aan J.M.L. (#CCR17477184).

Dit protocol omvat het gebruik van muizen en biogevaarlijke materialen en vereist goedkeuring van de bevoegde institutionele veiligheids comités. Alle beschreven in vivo werk hier is goedgekeurd door het Albany Medical College institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC).
Opmerking: voor een protocol overzicht, zie schematisch in Figuur 1.
1. verpakking van alle vereiste retrovirussen en linvirussen
O...

Kritieke stappen van de methode Het is van cruciaal belang om het aantal geïnjecteerde cellen te optimaliseren (stap 3) voor een bepaalde cellijn en muis stam, omdat dit het aantal metastasen dat vorm en de lengte van het experiment sterk kan beïnvloeden. Als te veel cellen worden geïnjecteerd of de metastasen te lang groeien, kunnen de metastasen moeilijk te tellen zijn, waardoor de effecten van de genetische manipulatie moeilijk te beoordelen zijn. Echter, als er te weinig cellen worden geïnject...

Kanker blijft de tweede leidende doodsoorzaak wereldwijd1 en metastase is verantwoordelijk voor de meerderheid van deze sterfgevallen2,3. Een beperkt begrip van de moleculaire mechanismen die de gemetastaseerde kolonisatie en de daaropvolgende groei beheersen, heeft echter de ontwikkeling van effectieve behandelingen voor gemetastaseerde ziekte belemmerd. De identificatie van nieuwe therapeutische doelstellingen vereist een assay om te testen hoe verontrust expressie of functie van een kandidaatgen invloed heeft op metastase vorming en groei. Hoewel autochtone Mouse-modellen hun voordelen hebben, zijn ze tijdrovend en duur om te genereren, waardoor ze geschikter zijn voor doel validatie in plaats van doel detectie. Transplantatie modelsystemen waarbij het aspirant-gen in kankercellen in vitro wordt verstoord en vervolgens effecten op gemetastaseerd potentieel worden beoordeeld in vivo, zijn minder duur en hoger doorvoer dan autochtone modellen. Bovendien zijn virale vectoren voor stabiele levering van RNAi, CRISPR/CAS9 en transgenen op grote schaal beschikbaar, waardoor het relatief gemakkelijk is om vrijwel elk gen of genen van belang in een kankercellijnen te perturb. Deze aanpak kan ook worden gebruikt om de rol van kandidaatgenen bij gemetastaseerde kolonisatie en groei in menselijke kankercellijnen te testen door de cellen in immuungecompromitteerde of gehumaniseerde muizen te verplanten.
De twee soorten assays die worden gebruikt om metastase vorming te testen door getransplanteerde kankercellen in vivo zijn spontane metastase-assays en experimentele metastase-assays. In spontane metastase testen4,5, kankercellen worden geïnjecteerd in muizen, toegestaan om een primaire tumor te vormen, en vervolgens spontane metastasen vorming en daaropvolgende groei worden getest. De sterkte van dit model is dat de cellen alle stappen van het metastatische proces moeten voltooien om gemetastaseerde tumoren te vormen. Echter, veel kanker cellijnen niet metastaseren efficiënt in spontane metastase modellen, en elke manipulatie van de cellen die invloed hebben op primaire tumorgroei kan de resultaten van de metastase assay Verwar. Experimentele metastase-assays, waarin kankercellen direct in omloop worden geïnjecteerd, worden gebruikt om deze valkuilen te voorkomen. Gemeenschappelijke experimentele metastase-assays omvatten de staart ader injectie6,7,8 (en gedemonstreerd hier), intracardiale injectie9, en portaal ader injectie10.
Het doel van het hier gepresenteerde protocol is om een in vivo experimentele metastase test te bieden die een onderzoeker in staat stelt om metastase vorming en groei in real time te monitoren, alsook om het aantal en de grootte van het eindpunt in de longen van dezelfde muis te kwantificeren. Om dit te bereiken, wordt de traditionele experimentele staart ader metastase assays6,7,8 gecombineerd met levende dieren beeldvorming, met behulp van een in vivo beeldapparaat9,11,12,13,14. Tumor cellen met een stabiel uitdrukken van beide plaats en een fluorescerend eiwit worden geïnjecteerd in muizen via de laterale staart ader en vervolgens wordt het in vivo beeldapparaat gebruikt om veranderingen in de gemetastaseerde belasting in de longen na verloop van tijd te meten (Figuur 1). De in vivo levende dier beeldvormings inrichting kan echter de grootte van individuele metastasen niet onderscheiden of meten. Zo wordt aan het einde van het experiment een fluorescerende stereomicroscoop gebruikt om het aantal te tellen en de grootte van de fluorescerende metastasen in de longen te meten zonder de noodzaak voor snijden en histologie of immunohistochemie (Figuur 1). Dit protocol kan worden gebruikt om te testen hoe het veranderen van de uitdrukking of functie van een kandidaatgen invloed heeft op metastase vorming en groei. Potentiële therapeutische verbindingen zoals kleine moleculen of functie blokkerende antilichamen kunnen ook worden getest.
Om deze aanpak te demonstreren, hebben we eerst een proof of concept experiment uitgevoerd waarin de essentiële replicatiefactor, replicatie eiwit a3 (RPA3) is neergeslagen in gemetastaseerde muizen borstkankercellen. We laten zien dat muizen die geïnjecteerd zijn met RPA3 knockdown cellen significant minder gemetastaseerde last hebben op elk tijdstip in vergelijking met muizen die met controle cellen worden geïnjecteerd. Analyse van de metastasen-bevattende longen toont aan dat deze verlaagde gemetastaseerde belasting het resultaat is van significant gereduceerde gemetastaseerde kolonisatie en verminderde groei van de uitzaaiingen die vormen. Om deze techniek verder aan te tonen, hebben we getest of gelijktijdige knock-down van Ja-geassocieerde eiwitten (YAP) en transcriptionele co-Activator met een PDZ-bindend motief (TAZ) de metastatische kolonisatie of daaropvolgende groei belemmert. YAP en TAZ zijn twee gerelateerde transcriptionele co-Activators die de kritische stroomafwaartse Effectors van de Hippo pathway zijn. We15,16 en anderen hebben betrokken Yap en taz in metastasen (beoordeeld in17,18,19), wat suggereert dat deze eiwitten goede therapeutische doelen zijn. Consequent, ontdekten we dat muizen geïnjecteerd met YAP/TAZ knockdown cellen aanzienlijk verminderde gemetastaseerd Last. Analyse van de longen toonde aan dat de YAP/TAZ knockdown cellen veel minder metastasen vormden en dat de metastasen die vorm kregen kleiner waren. Deze experimenten laten zien hoe experimentele metastase testen een onderzoeker in staat stellen om snel en goedkoop de rol van een kandidaat-gen in metastase vorming en groei te onderzoeken. Ze laten verder zien hoe het gecombineerde gebruik van levende dierlijke beeldvorming en fluorescerende kwantificering van metastasen in hele longen de onderzoeker in staat stelt om de stappen tijdens gemetastaseerde kolonisatie beter te begrijpen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% SDS-PAGE Gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td>Trypsin for tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat bottom white assay plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3922</td>
			<td>For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol wipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For sterolizing the injection site before tail vein injecitons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/C mice (female, 6 weeks)</td>
			<td>Taconic</td>
			<td>BALB-F</td>
			<td>For tail vein metastatic colonization and burden assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA regular</td>
			<td>VWR Ameresco</td>
			<td>97061-416</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lysis buffer</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td></td>
			<td>For collecting protien samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celltreat Syringe Filters, PES 30mm, 0.45 &#956;m</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>40-229749-CS</td>
			<td>For filtering viral supernatant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 and euthanasia chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For euthanasing the mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-luciferase reporter assay kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1960</td>
			<td>For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&39;s phosphate buffered saline</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>TS1006</td>
			<td>For PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-406</td>
			<td>Used to dilute trypsin for tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS 100% US origin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97068-085</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fujifilm LAS-3000 gel imager</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td></td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH(14C10) Rabibit mAb</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2118</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP conjugate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>31460</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human embryonic kidney cells, HEK-293FT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R70007</td>
			<td>Cell line used for packging virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone DMEM/High clucose</td>
			<td>GE Healthcare life sciences</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B, Ultra Pure Grade</td>
			<td>VWR Ameresco</td>
			<td>97064-810</td>
			<td>For antibiotic selection of infected cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td></td>
			<td>For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imagej</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for image analysis of lung metastases: threshold set to 25 &#38; 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immuno-Blot PVDF Membrane</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1620177</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For mouse anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System (in vivo live animal imaging device)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>CLS136340</td>
			<td>For in vivo imaging of metastatic burden</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M205 FA &#38; Lecia DCF3000 G (GFP and bright field filters)</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Microscope and camera for visualing, counting and taking pcitures of metastases in the lungs; 10X magnifacation, 3.5 sec exposure, 1.4 gain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>L3000008</td>
			<td>For YAP/TAZ-TEAD reporter transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image 3.2 (image software program)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Software for IVIS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse breast cancer cells, 4T1</td>
			<td>Karmanos Cancer Institute</td>
			<td>Aslakson, CJ et al.,1992</td>
			<td>Mouse metastatic breast cance cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Gauge version 3.0</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td></td>
			<td>Software for quantifying western blot band intensity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM (transfection buffer)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-062</td>
			<td>For packaging virus and transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA protein assay kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td>For quantifying protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Phosphatase Inhibitor Mini Tablets</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32957</td>
			<td>Added to cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32953</td>
			<td>Added to cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene (hexadimethrine bromide)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>45-H9268</td>
			<td>For infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>45-P7255</td>
			<td>For antibiotic selection of infected cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent restrainer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For restraining mice during tail vein injeciton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE running buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAZ (V3886) Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4883</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBST buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20 automated cell counter</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>For counting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See Table 1 for complete list of vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89404-464</td>
			<td>For visualizing fluorescence in ZSGreen labeled cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western transfer buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XenoLight D-Luciferin K+ Salt</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>122799</td>
			<td>Substrate injected into mice for in vivo bioluminescent IVIS images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (lipid solution for transfection)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6365787001</td>
			<td>For packaging virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YAP (D8H1X) XP Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>14074</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combined use of tail vein metastasis assays and real-time in vivo imaging to quantify breast cancer metastatic colonization and burden in the lungs

Metastase is de belangrijkste oorzaak van kanker-gerelateerde sterfgevallen en er zijn beperkte therapeutische opties voor patiënten met gemetastaseerde ziekte. De identificatie en het testen van nieuwe therapeutische doelstellingen die de ontwikkeling van betere behandelingen voor gemetastaseerde ziekten zullen vergemakkelijken, vereisen preklinische in vivo-modellen. Gedemonstreerd hier is een syngene muismodel voor borstkanker gemetastaseerde kolonisatie en daaropvolgende groei. Gemetastaseerde kankercellen worden stabiel met virale vectoren gecodeerd Firefly plaats en zsgreen eiwitten. Kandidaatgenen worden vervolgens stabiel gemanipuleerd in Luciferase/ZsGreen-uitdrukken van kankercellen en vervolgens worden de cellen via de laterale staart ader geïnjecteerd in muizen om gemetastaseerde kolonisatie en groei te assay. Een in vivo imaging-apparaat wordt vervolgens gebruikt om de Bioluminescentie of fluorescentie van de tumorcellen in de levende dieren te meten om veranderingen in de gemetastaseerde last na verloop van tijd te kwantificeren. De uitdrukking van het fluorescerende eiwit maakt het mogelijk het aantal en de grootte van metastasen in de longen aan het einde van het experiment te kwantificeren zonder dat er een snij-of histologische kleuring nodig is. Deze aanpak biedt een relatief snelle en eenvoudige manier om de rol van kandidaatgenen in gemetastaseerde kolonisatie en groei te testen, en biedt veel meer informatie dan de traditionele metastase-assays van de staart ader. Met deze aanpak tonen we aan dat gelijktijdige knock-down van Ja geassocieerde eiwitten (YAP) en transcriptionele co-Activator met een PDZ-bindend motief (TAZ) in borstkankercellen leidt tot een verminderde metastatische last in de longen en dat deze lagere last het resultaat is van een significant verminderde gemetastaseerde kolonisatie en verminderde groei van metastasen.

Om de bovenstaande aanpak te demonstreren, hebben we een proof of concept experiment uitgevoerd waarin een kritische replicatiefactor, RPA3 werd neergeslagen in een metastatische muis borstkanker cellijn (4T122). Terwijl het protocol beschrijft het labelen van de cellen met zowel plaats en fluorescentie eiwitten voorafgaand aan genetische manipulatie, we gebruikten een gemodificeerde aanpak omdat de RNAi vectoren ook zsgreen leveren (Figuur 2a). Ten e...

Watch this Scientific Journal Video about Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs at JoVE.co

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

De beschreven aanpak combineert experimentele staart ader metastase assays met in vivo levende dierlijke beeldvorming zodat real-time monitoring van borstkanker metastase vorming en groei in aanvulling op de kwantificering van metastasen aantal en grootte in de longen.

Gecombineerd gebruik van staart ader metastase assays en real-time in vivo beeldvorming om borstkanker te kwantificeren gemetastaseerde kolonisatie en last in de longen

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Ons protocol kan worden gebruikt om snel en eenvoudig de rol van elk kandidaat-gen te testen in gemetastaseerde kolonisatie en groei. Het protocol maakt het ook mogelijk om realtime monitoring van metastase, vorming en groei mogelijk te maken, evenals kwantificering van metastasenummer en grootte bij dezelfde dieren zonder dat resectie of histologische kleuring nodig is. Plaat vier T1 cellen op 150.000 cellen per put in een 12-well plaat in complete groeimedia.Incubeer bij 37 graden Celsius 5%kooldioxide 's nachts. De volgende dag, aspirate de groeimedia uit de cellen. Voeg 500 microliters luciferase virale supernatant en 500 microliter fluorescerend eiwit virale supernatant om tegelijkertijd infecteren de cellen met zowel de luciferase en fluorescerende eiwit virale supernatants.Voeg vervolgens een microliter van acht milligram per milliliter hexadimethrine bromide en incubaal toe bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide gedurende 24 tot 48 uur. Probeer de vier T1-cellen met 500 microliter trypsine. Na twee tot vijf minuten, breng alle cellen naar een schaal van zes centimeter in vier milliliter van selectiemedia, waardoor het blussen van de trypsine.Nadat de selectie is voltooid, bevestig dan dat de geïnfecteerde vier T1-cellen ZsGreen fluorescerend eiwit uitdrukken met behulp van een omgekeerde fluorescerende microscoop bij 50 tot 100 keer vergroting. Bevestig ook dat de geïnfecteerde vier T1-cellen luciferase uitdrukken met behulp van een commercieel verkrijgbaar luciferase activity kit. Ga over tot het optimaliseren van het in vivo experimentele ontwerp zoals beschreven in het tekstprotocol.Spoel de media aan en spoel de celplaten af met 1X PBS. Probeer de cellen met vijf milliliter trypsine per 15 centimeter plaat gedurende twee tot vijf minuten en breng alle cellen over naar een conische buis. Was de resterende cellen uit de weefselkweekschotel met voldoende volledige groeimedia om de trypsine te doven.Voeg de was toe aan dezelfde conische buis. Tel de cellen met behulp van een geautomatiseerde celteller om het totale celnummer te bepalen. Vervolgens centrifugeren de cellen op 122 keer G gedurende drie minuten, en aspirate de supernatant.Schort de cellen opnieuw op in 1X PBS bij de gewenste concentratie. Hier worden 25.000 cellen geïnjecteerd in elke muis en 100 microliter PBS. Dus de opnieuw opgehangen cellen zitten op 250.000 cellen per milliliter.Houd de celsuspensies op ijs tot de injectie. Werken in een kap op de dierenfaciliteit, voorzichtig maar grondig meng de cellen door het omkeren van de buis of met behulp van een een milliliter spuit om ervoor te zorgen dat ze gelijkmatig opnieuw worden opgehangen. Laad nu een luer lock spuit van één milliliter Luer Lock met de celoping en verdrijf overtollige luchtbellen.Plaats een halve inch 30 meter naald op de spuit met de schuine kant omhoog en verdrijven luchtbellen. Plaats de muis voorzichtig in een knaagdier restrainer. De laterale staartader moet zichtbaar en verwijd zijn.Zo niet, knijp dan voorzichtig de basis van de staart en dompel de staart in warm leidingwater om de aderen te verwijden. Gebruik een alcohol doekje om de staart schoon te maken, steek de naald in de staartader, schuine kant omhoog, en injecteren 100 microliter van celsuspensie. Als de naald goed in de ader wordt gestoken, moet deze gemakkelijk iets naar voren en naar achteren schuiven en mag er geen weerstand zijn wanneer de zuiger wordt geduwd.Succesvolle injecties moeten ook resulteren in een flush waarbij de blauwe kleur van de ader een paar seconden na de injectie wit wordt. Verwijder langzaam de naald, en met behulp van een steriel gaas, druk uitoefenen op de injectieplaats om eventuele bloedingen te stoppen. Breng de muis terug naar zijn kooi en controleer gedurende 15 minuten om volledig herstel te garanderen.Schakel het in vivo live animal imaging-apparaat in, open de beeldsoftware en log in. Klik op de initialiserende knop en wacht tot de machine is geïnitialiseerd. Wijzig het gezichtsveld in D.Voor het eerst gebruik, bewerk belichtingsinstellingen door te klikken op bewerken, voorkeuren, acquisitie en automatische belichting.Wijzig de maximale belichtingstijd van de standaard 60 seconden naar 300 seconden en klik op oke. Laad een een milliliter spuit met D-luciferin, voeg dan een halve inch 30 meter naald aan de spuit en verdrijven luchtbellen. Meet en noteren de massa van een verdoofde muis.Beperk de muis door knijpen de scruff van de nek met behulp van de duim en aanwijzer vingers en grijpen de staart tussen de pink vinger en de basis van de hand. Keer de muis in een hoek van 45 graden met zijn hoofd naar beneden. Plaats de naald, schuine kant omhoog, in de linker IP-ruimte aan de linkerkant van de muis.Bevestig de toegang tot de IP-ruimte door een klein volume terug te trekken. Er mag geen kleur aan de basis van de naald zijn bij het terugtrekken in de IP-ruimte. Injecteer het juiste volume D-luciferin voor een dosis van 150 milligram per kilogram.Onmiddellijk na D-luciferin administratie, start een timer. Plaats de muis plat op zijn rug in de beeldvorming apparaat met zijn neus in de neus kegel, en zorg ervoor dat de helft tot twee en een half procent isoflurane wordt toegediend. Klik op de lichtgevende en fotovakken.Wijzig de belichtingstijd in automatisch en klik op acquire in het configuratiescherm van de acquisitie. Na beeldvorming keert u de muis terug naar zijn kooi en controleert u gedurende 15 minuten om volledig herstel te garanderen. Na euthanasie, zoals beschreven in het tekstprotocol, isoleer en verwijder de longen van elke muis en spoel in 1X PBS om overtollig bloed te verwijderen.Verwerf beelden van ZsGreen metastasen in de lobben op 10X in Brightfield en fluorescentie met behulp van een fluorescerende stereoscoop met een GFP brede band filter. Gebruik software voor beeldanalyse om de grootte en het aantal metastasen van de afbeeldingen te kwantificeren. Als u de gegevens van de afbeeldingen wilt verwerken en analyseren die zijn verkregen met het in vivo live animal imaging-apparaat, opent u alle afbeeldingsbestanden voor elke muis in de beeldsoftware.Zorg ervoor dat de eenheden in straling zijn voor bioluminescente gegevens en efficiëntie voor fluorescerende gegevens door op de pijl linksboven in het afbeeldingsvenster te klikken en deze te wijzigen in de juiste eenheid. Gebruik de afbeelding vanaf het laatste keerpunt om een interessegebied of ROI te maken door eerst op ROI-gereedschappen te klikken in het venster gereedschapspalet. Voeg vervolgens één ROI in door op de pijl te klikken en er een te selecteren.Klik op de rand van de ROI en verplaats deze naar de borst van de muis. Pas de grootte van de ROI aan, zodat het de borst van de muis bedekt en het signaal niet uitsluit. Klik vervolgens op ROI's meten en kopieer of typ het onbewerkte nummer in een Excel-blad.Plot en analyseer de gegevens zoals beschreven in het tekstprotocol. Klik met de rechtermuisknop in het afbeeldingsbestand om de ROI te kopiëren, plak deze vervolgens in afbeeldingsbestanden van de andere tijdstippen en klik op ROIs meten. Retrovirale vector uitdrukken tandem miR-30-gebaseerde shRNAs gericht op zowel YAP en TAZ vermindert YAP en belasting eiwitexpressie en transcriptie activiteit in vier T1 cellen.Vier T1 luciferase cellen werden stabiel getransduceerd met een ZsGreen expressing versie van deze tandem YAP / TAZ shRNA vector of een gecontroleerde miR-30-gebaseerde shRNA. Bioluminescente beelden tonen aan dat de snelheid waarmee de uitgezaaide last aanzienlijk sneller was bij de muizen geïnjecteerd met controlecellen in vergelijking met de muizen geïnjecteerd met YAP / TAZ knockdown cellen. Een plot van de log10 getransformeerd luciferase signaal gemeten voor elke muis in de loop van het experiment toont ook aan dat de snelheid was sneller in de muizen geïnjecteerd met de controlecellen in vergelijking met de muizen geïnjecteerd met YAP / TAZ knockdown cellen.Aanzienlijk minder metastasen gevormd in de muizen geïnjecteerd met de YAP / TAZ knockdown cellen in vergelijking met muizen met controlecellen wanneer handmatig geteld. Dezelfde trend werd waargenomen bij het gebruik van de beeldanalyse software. Niet alleen vormden zich veel meer uitzaaiingen in de controlemuizen, maar ze waren over het algemeen groter.Consequent, de uitgezaaide last in de longen werd ook drastisch verminderd door YAP / TAZ knockdown. Succesvolle injectie van gelijke aantallen gezonde cellen in elke muis is van cruciaal belang om gegevens van hoge kwaliteit te garanderen. Vergeet niet voorzichtig te zijn en veiligheidsrichtlijnen te volgen bij het werken met besmettelijke retrovirussen en lentivirussen, vooral als de virussen menselijk besmettelijk zijn.Deze techniek heeft ons in staat gesteld om de rol van kandidaat-genen en gemetastaseerde kolonisatie en groei te illustreren, waardoor een manier is om nieuwe therapeutische doelen voor de behandeling van uitgezaaide ziekten te identificeren en te testen. Na deze procedure kunnen uitzaaiingen die longen bevatten verder worden geanalyseerd door immunofluorescent of histologische kleuring om te onderzoeken hoe het veranderde gen metastasen beïnvloedt en andere eiwitten te identificeren die betrokken kunnen zijn.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis

Intra-iliaca Injectie voor Efficiënte en Selectieve Modellering van Microscopisch botmetastase

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely ...

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Coculture Testen om te studeren macrofagen en microglia Stimulatie van glioblastoma Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

Geavanceerde diermodel van colorectale metastase in de lever: Imaging technieken en eigenschappen van gemetastaseerde Clones

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Gebruik makend van Functional Genomics Screening om potentieel nieuwe drug targets in Cancer Cell Sferoïde Cultures Identificeer

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Een poortader Injection Model op de studie van de lever metastase van borstkanker

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

Praktische overwegingen bij het bestuderen van uitgezaaide longkanker kolonisatie in met behulp van de pulmonaire metastase Assay Osteosarcoom

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Micromanipulatie van circulerende tumor cellen voor downstream moleculaire analyse en gemetastaseerde potentiële beoordeling

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Pathologische analyse van longmetastase na laterale staartaderinjectie van tumorcellen

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

Computergebaseerde beeldanalyse gebruiken om de kwantificering van longmetastase in het 4T1 Breast Cancer Model te verbeteren

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

Modeling Brain Metastasis Via Tail-Vein Injection of Inflammatory Breast Cancer Cells

Modellering van hersenmetastase via staartaderinjectie van inflammatoire borstkankercellen

Metastatic spread to the brain is a common and devastating manifestation of many types of cancer. In the United States alone, about 200,000 patients are ...