Name: combined use of tail vein metastasis assays and real-time in vivo imaging to quantify breast cancer metastatic colonization and burden in the lungs
Uploaded: 2019-12-19T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs at JoVE.co

Wir danken Emily Norton für die Unterstützung bei Virusinfektionen und die kritische Lektüre des Manuskripts. Wir danken auch Ryan Kanai für die Hilfe beim Erfassen von Bildern der Lunge und Kate E. Tubbesing für Hilfe bei der Bildanalyse der grünen Metastasen in der Lunge. Wir danken den Mitarbeitern der Tierforschungseinrichtung für die Unterstützung und unterstützung bei der Erstellung dieses Videos. Diese Arbeit wurde von einem Susan G. Komen Career Catalyst Grant unterstützt, der J.M.L. (#CCR17477184) verliehen wurde.

Dieses Protokoll umfasst die Verwendung von Mäusen und biogefährlichen Stoffen und bedarf der Zustimmung der zuständigen institutionellen Sicherheitsausschüsse. Alle hier beschriebenen In-vivo-Arbeiten werden vom institutionellen Tierpflege- und Nutzungsausschuss des Albany Medical College (IACUC) genehmigt.
HINWEIS: Eine Protokollübersicht finden Sie im Schaltplan in Abbildung 1.
1. Verpackung aller erforderlichen Retroviren und Len...

Kritische Schritte der Methode Es ist wichtig, die Anzahl der injizierten Zellen (Schritt 3) für eine bestimmte Zelllinie und Mausdehnung zu optimieren, da dies die Anzahl der Metastasen, die sich bilden, und die Länge des Experiments stark beeinflussen kann. Wenn zu viele Zellen injiziert werden oder die Metastasen zu lange wachsen, können die Metastasen schwer zu zählen sein, was die Auswirkungen der genetischen Manipulation schwer einschätzen kann. Wenn jedoch zu wenige Zellen injiziert werden...

Krebs bleibt die zweithäufigste Todesursache weltweit1 und Metastasen sind für die Mehrheit dieser Todesfälle verantwortlich2,3. Ein begrenztes Verständnis der molekularen Mechanismen, die die metastasierende Kolonisation und das anschließende Wachstum steuern, hat jedoch die Entwicklung wirksamer Behandlungen für metastasierende Krankheiten behindert. Die Identifizierung neuartiger therapeutischer Ziele erfordert einen Test, um zu testen, wie gestörte Expression oder Funktion eines Kandidatengens die Metastasenbildung und das Wachstum beeinflusst. Autochthone Mausmodelle haben zwar ihre Vorteile, sind aber zeitaufwändig und teuer zu generieren, wodurch sie besser für die Zielvalidierung als für die Zielermittlung geeignet sind. Transplantationsmodellsysteme, bei denen das Kandidatengen in vitro in Krebszellen gestört wird und dann Die Auswirkungen auf das metastasierende Potenzial in vivo bewertet werden, sind kostengünstiger und höherer Durchsatz als autochthone Modelle. Darüber hinaus sind virale Vektoren für die stabile Lieferung von RNAi, CRISPR/CAS9 und Transgenen weit verbreitet, was es relativ einfach macht, praktisch jedes Gen oder Gene zu stören, die an einer Krebszelllinie interessiert sind. Dieser Ansatz kann auch verwendet werden, um die Rolle von Kandidatengenen bei der metastasierenden Besiedlung und dem Wachstum menschlicher Krebszelllinien zu untersuchen, indem die Zellen in immungeschwächte oder humanisierte Mäuse transplantiert werden.
Die beiden Arten von Assays, die verwendet werden, um die Metastasenbildung durch transplantierte Krebszellen in vivo zu testen, sind spontane Metastasen-Assays und experimentelle Metastasen-Assays. In spontanen Metastasen-Assays4,5werden Krebszellen in Mäuse injiziert, erlaubt, einen Primärtumor zu bilden, und dann werden spontane Metastasenbildung und anschließendes Wachstum untersucht. Die Stärke dieses Modells besteht darin, dass die Zellen alle Schritte des metastasierenden Prozesses ausführen müssen, um metastasierende Tumoren zu bilden. Jedoch, viele Krebszelllinien nicht effizient in spontanen Metastasen-Modelle metastasieren, und jede Manipulation der Zellen, die primäre Tumorwachstum beeinflusst, kann die Ergebnisse der Metastasierung Assay verwirren. Experimentelle Metastasen-Assays, bei denen Krebszellen direkt in den Kreislauf injiziert werden, werden verwendet, um diese Fallstricke zu vermeiden. Häufige experimentelle Metastasen-Assays sind die Schwanzveneninjektion6,7,8 (und hier gezeigt), intrakardiale Injektion9und Portalveneninjektion10.
Der Zweck des hier vorgestellten Protokolls ist es, einen in vivo experimentellen Metastasen-Assay bereitzustellen, der es einem Forscher ermöglicht, die Metastasenbildung und das Wachstum in Echtzeit zu überwachen, sowie die Anzahl und Größe von Endpunktmetastasen in der Lunge derselben Maus zu quantifizieren. Um dies zu erreichen, werden traditionelle experimentelle Schwanzvenenmetastasen6,7,8 mit Live-Tierbildgebung kombiniert, mit einem in vivo Bildgebungsgerät9,11,12,13,14. Tumorzellen, die sowohl Luziferase als auch ein fluoreszierendes Protein stabil exezieren, werden über die laterale Schwanzvene in Mäuse injiziert und dann wird das in vivo Bildgebungsgerät verwendet, um Veränderungen der metastasierenden Belastung in der Lunge im Laufe der Zeit zu messen (Abbildung 1). Das in vivo Live-Tierbildbildgerät kann jedoch die Größe einzelner Metastasen nicht unterscheiden oder messen. So wird am Ende des Experiments ein fluoreszierendes Stereomikroskop verwendet, um die Anzahl zu zählen und die Größe der fluoreszierenden Metastasen in der Lunge zu messen, ohne dass Schnittund und Histologie oder Immunhistochemie erforderlich sind (Abbildung 1). Dieses Protokoll kann verwendet werden, um zu testen, wie die Veränderung der Expression oder Funktion eines Kandidatengens die Metastasenbildung und das Wachstum beeinflusst. Mögliche therapeutische Verbindungen wie kleine Moleküle oder funktionsblockierende Antikörper können ebenfalls getestet werden.
Um diesen Ansatz zu demonstrieren, führten wir zunächst ein Proof-of-Concept-Experiment durch, bei dem der wesentliche Replikationsfaktor, das Replikationsprotein A3 (RPA3), in metastasierenden Maus-Brustkrebszellen niedergeschlagen wird. Wir zeigen, dass Mäuse, die mit RPA3-Knockdown-Zellen injiziert werden, zu jedem Zeitpunkt eine signifikant geringere metastasierende Belastung aufweisen als Mäuse, die mit Kontrollzellen injiziert werden. Die Analyse der metastasierenden Lunge zeigt, dass diese reduzierte metastasierende Belastung das Ergebnis einer signifikant reduzierten metastasierenden Kolonisation und eines beeinträchtigten Wachstums der metastasierenden Metastasen ist. Um diese Technik weiter zu demonstrieren, haben wir getestet, ob der gleichzeitige Abschlag von Yes-assoziiertem Protein (YAP) und Transkriptions-Co-Aktivator mit einem PDZ-bindenden Motiv (TAZ) die metastasierende Kolonisation oder das nachfolgende Wachstum beeinträchtigt. YAP und TAZ sind zwei verwandte Transkriptions-Coaktivatoren, die die kritischen downstream-Effektoren des Hippo-Pfads sind. Wir15,16 und andere haben YAP und TAZ in Metastasen verwickelt (rezensiert in17,18,19), was darauf hindeutet, dass diese Proteine gute therapeutische Ziele sind. Konsequenterweise fanden wir heraus, dass Mäuse, die mit YAP/TAZ-Knockdown-Zellen injiziert wurden, die metastasierende Belastung signifikant reduziert hatten. Die Analyse der Lunge zeigte, dass die YAP/TAZ-Knockdown-Zellen viel weniger Metastasen bildeten und dass die Metastasen, die sich bildeten, kleiner waren. Diese Experimente zeigen, wie experimentelle Metastasen-Assays es einem Forscher ermöglichen, schnell und kostengünstig die Rolle eines Kandidatengens bei der Metastasenbildung und dem Wachstum zu testen. Sie zeigen ferner, wie der kombinierte Einsatz von Live-Tierbildgebung und fluoreszierender Quantifizierung von Metastasen in ganzen Lungen es dem Forscher ermöglicht, die Schritte während der metastasierenden Besiedlung besser zu verstehen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% SDS-PAGE Gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td>Trypsin for tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat bottom white assay plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3922</td>
			<td>For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol wipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For sterolizing the injection site before tail vein injecitons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/C mice (female, 6 weeks)</td>
			<td>Taconic</td>
			<td>BALB-F</td>
			<td>For tail vein metastatic colonization and burden assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA regular</td>
			<td>VWR Ameresco</td>
			<td>97061-416</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lysis buffer</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td></td>
			<td>For collecting protien samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celltreat Syringe Filters, PES 30mm, 0.45 &#956;m</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>40-229749-CS</td>
			<td>For filtering viral supernatant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 and euthanasia chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For euthanasing the mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-luciferase reporter assay kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1960</td>
			<td>For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&39;s phosphate buffered saline</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>TS1006</td>
			<td>For PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-406</td>
			<td>Used to dilute trypsin for tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS 100% US origin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97068-085</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fujifilm LAS-3000 gel imager</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td></td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH(14C10) Rabibit mAb</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2118</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP conjugate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>31460</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human embryonic kidney cells, HEK-293FT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R70007</td>
			<td>Cell line used for packging virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone DMEM/High clucose</td>
			<td>GE Healthcare life sciences</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B, Ultra Pure Grade</td>
			<td>VWR Ameresco</td>
			<td>97064-810</td>
			<td>For antibiotic selection of infected cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td></td>
			<td>For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imagej</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for image analysis of lung metastases: threshold set to 25 &#38; 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immuno-Blot PVDF Membrane</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1620177</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For mouse anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System (in vivo live animal imaging device)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>CLS136340</td>
			<td>For in vivo imaging of metastatic burden</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M205 FA &#38; Lecia DCF3000 G (GFP and bright field filters)</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Microscope and camera for visualing, counting and taking pcitures of metastases in the lungs; 10X magnifacation, 3.5 sec exposure, 1.4 gain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>L3000008</td>
			<td>For YAP/TAZ-TEAD reporter transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image 3.2 (image software program)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Software for IVIS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse breast cancer cells, 4T1</td>
			<td>Karmanos Cancer Institute</td>
			<td>Aslakson, CJ et al.,1992</td>
			<td>Mouse metastatic breast cance cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Gauge version 3.0</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td></td>
			<td>Software for quantifying western blot band intensity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM (transfection buffer)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-062</td>
			<td>For packaging virus and transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA protein assay kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td>For quantifying protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Phosphatase Inhibitor Mini Tablets</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32957</td>
			<td>Added to cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32953</td>
			<td>Added to cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene (hexadimethrine bromide)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>45-H9268</td>
			<td>For infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>45-P7255</td>
			<td>For antibiotic selection of infected cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent restrainer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For restraining mice during tail vein injeciton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE running buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAZ (V3886) Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4883</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBST buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20 automated cell counter</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>For counting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See Table 1 for complete list of vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89404-464</td>
			<td>For visualizing fluorescence in ZSGreen labeled cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western transfer buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XenoLight D-Luciferin K+ Salt</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>122799</td>
			<td>Substrate injected into mice for in vivo bioluminescent IVIS images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (lipid solution for transfection)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6365787001</td>
			<td>For packaging virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YAP (D8H1X) XP Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>14074</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combined use of tail vein metastasis assays and real-time in vivo imaging to quantify breast cancer metastatic colonization and burden in the lungs

Metastasen sind die Hauptursache für krebsbedingte Todesfälle und es gibt nur begrenzte therapeutische Möglichkeiten für Patienten mit metastasierenden Erkrankungen. Die Identifizierung und Erprobung neuartiger therapeutischer Ziele, die die Entwicklung besserer Behandlungen für metastasierende Erkrankungen erleichtern, erfordert präklinische In-vivo-Modelle. Gezeigt wird hier ein syngenes Mausmodell zur Assaying-Metatonisierung von Brustkrebs und anschließendem Wachstum. Metastasierende Krebszellen werden stabil mit viralen Vektoren transduziert, die Glögfeuer-Luziferase und ZsGreen-Proteine kodieren. Kandidatengene werden dann in luziferase/ZsGrün-exezierenden Krebszellen stabil manipuliert und dann werden die Zellen über die laterale Schwanzvene in Mäuse injiziert, um metastasierende Besiedlung und Wachstum zu assay. Ein In-vivo-Bildgebungsgerät wird dann verwendet, um die Biolumineszenz oder Fluoreszenz der Tumorzellen bei den lebenden Tieren zu messen, um Veränderungen der metastasierenden Belastung im Laufe der Zeit zu quantifizieren. Die Expression des fluoreszierenden Proteins ermöglicht es, die Anzahl und Größe der Metastasen in der Lunge am Ende des Experiments zu quantifizieren, ohne dass eine Schnitt- oder histologische Färbung erforderlich ist. Dieser Ansatz bietet eine relativ schnelle und einfache Möglichkeit, die Rolle von Kandidatengenen bei der metastasierenden Kolonisation und dem Wachstum zu testen, und bietet viel mehr Informationen als herkömmliche Schwanzvenenmetastasasasen. Mit diesem Ansatz zeigen wir, dass der gleichzeitige Knockdown von Yes assoziiertem Protein (YAP) und Transkriptions-Co-Aktivator mit einem PDZ-bindenden Motiv (TAZ) in Brustkrebszellen zu einer reduzierten metastasierenden Belastung in der Lunge führt und dass diese reduzierte Belastung das Ergebnis einer signifikant beeinträchtigten metastasierenden Kolonisation und eines reduzierten Wachstums von Metastasen ist.

Um den obigen Ansatz zu demonstrieren, führten wir ein Proof-of-Concept-Experiment durch, bei dem ein kritischer Replikationsfaktor, RPA3, in einer metastasierenden Maus-Mammakarzinom-Zelllinie niedergeschlagen wurde (4T122). Während das Protokoll beschreibt, dass die Zellen vor der genetischen Manipulation sowohl mit Luziferase als auch mit fluoreszierenden Proteinen gekennzeichnet werden, haben wir einen modifizierten Ansatz verwendet, da DIE RNAi-Vektoren auch ZsGreen liefern (<strong class="...

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Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Der beschriebene Ansatz kombiniert experimentelle Schwanzvenenmetastasierungs-Assays mit in vivo Live-Tier-Imaging, um neben der Quantifizierung der Metastasenzahl und -größe in der Lunge auch die Echtzeit-Überwachung der Bildung und des Wachstums von Brustkrebsmetastasen zu ermöglichen.

Kombinierte Verwendung von Tail Vein Metastasis Assays und Real-Time In Vivo Imaging zur Quantifizierung der metastasierenden Kolonisation und Belastung von Brustkrebs in der Lunge

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Unser Protokoll kann verwendet werden, um schnell und einfach die Rolle eines beliebigen Kandidatengens bei der metastasierenden Kolonisation und dem Wachstum zu testen. Das Protokoll ermöglicht auch echtzeit-Überwachung von Metastasen, Bildung und Wachstum, sowie Quantifizierung der MetastasenZahl und Größe bei den gleichen Tieren ohne die Notwendigkeit einer Resektion oder histologische Färbung. Platte vier T1-Zellen bei 150.000 Zellen pro Brunnen in einer 12-Well-Platte in kompletten Wachstumsmedien.Inkubieren bei 37 Grad Celsius 5% Kohlendioxid über Nacht. Am nächsten Tag die Wachstumsmedien aus den Zellen ansaugen. Fügen Sie 500 Mikroliter luziferase viralen Überstand und 500 Mikroliter fluoreszierendes Protein viralen Überstand, um gleichzeitig die Zellen mit der Luziferase und fluoreszierenden Protein viralen Überwasserungsmitteln zu infizieren.Dann fügen Sie einen Mikroliter von acht Milligramm pro Milliliter Hexadimethrinbromid hinzu und brüten bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 24 bis 48 Stunden. Trypsinisieren Sie die vier T1-Zellen mit 500 Mikroliter Trypsin. Nach zwei bis fünf Minuten alle Zellen in vier Milliliter Selektionsmedien auf eine sechs Zentimeter große Schale übertragen und so das Trypsin abschrecken.Nachdem die Selektion abgeschlossen ist, bestätigen Sie, dass die infizierten vier T1-Zellen ZsGreen Fluoreszenzprotein mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop mit 50- bis 100-facher Vergrößerung exproszieren. Bestätigen Sie auch, dass die infizierten vier T1-Zellen Luziferase mit einem kommerziell erhältlichen Luciferase-Aktivitätskit exdrücken. Fahren Sie mit der Optimierung des in vivo experimentellen Designs fort, wie im Textprotokoll beschrieben.Aspirieren Sie die Medien und spülen Sie die Zellplatten mit 1X PBS. Versuchen Sie die Zellen mit fünf Milliliter Trypsin pro 15 Zentimeter Platte für zwei bis fünf Minuten und übertragen Sie alle Zellen in ein konisches Rohr. Waschen Sie die verbleibenden Zellen aus der Gewebekulturschale mit genügend vollständigen Wachstumsmedien, um das Trypsin zu löschen.Fügen Sie die Wäsche in das gleiche konische Rohr. Zählen Sie die Zellen mithilfe eines automatisierten Zellenzählers, um die Gesamtzahl der Zellen zu bestimmen. Als nächstes zentrifugieren Sie die Zellen bei 122 mal G für drei Minuten, und aspirieren Sie den Überstand.Setzen Sie die Zellen in 1X PBS in der gewünschten Konzentration wieder aus. Hier werden 25.000 Zellen in jede Maus und 100 Mikroliter PBS injiziert. Die wieder suspendierten Zellen liegen also bei 250.000 Zellen pro Milliliter.Halten Sie die Zellsuspensionen bis zur Injektion auf Eis. Arbeiten Sie in einer Haube in der Tieranlage, mischen Sie die Zellen sanft, aber gründlich, indem Sie das Rohr invertieren oder eine Ein-Milliliter-Spritze verwenden, um sicherzustellen, dass sie gleichmäßig wieder aufgehängt werden. Laden Sie nun eine Ein-Milliliter-Luer Lock-Spritze mit der Zellsuspension und vertreiben Sie überschüssige Luftblasen.Legen Sie eine halbe Zoll 30 Gauge Nadel auf die Spritze mit der Abschrägung nach oben und vertreiben Luftblasen. Legen Sie die Maus vorsichtig in einen Nagetier-Restrainer. Die seitliche Schwanzvene sollte sichtbar und erweitert sein.Wenn nicht, kneifen Sie vorsichtig die Basis des Schwanzes und tauchen Sie den Schwanz in warmes Leitungswasser, um die Venen zu verdünnen. Verwenden Sie ein Alkoholtuch, um den Schwanz zu reinigen, setzen Sie dann die Nadel in die Schwanzvene, abschrägen Seite nach oben, und injizieren 100 Mikroliter Zellsuspension. Wenn die Nadel richtig in die Vene eingeführt wird, sollte sie leicht nach vorne und hinten gleiten, und es sollte kein Widerstand vorhanden sein, wenn der Kolben gedrückt wird.Erfolgreiche Injektionen sollten auch zu einem Flush führen, bei dem die blaue Farbe der Vene für einige Sekunden nach der Injektion weiß wird. Entfernen Sie langsam die Nadel, und mit einer sterilen Gaze, Druck auf die Injektionsstelle ausüben, um jede Blutung zu stoppen. Bringen Sie die Maus in ihren Käfig und Monitor für 15 Minuten, um eine vollständige Wiederherstellung zu gewährleisten.Schalten Sie das Live-Tierbildgerät in vivo ein, öffnen Sie die Bildsoftware und melden Sie sich an. Klicken Sie auf die Schaltfläche Initialisieren, und warten Sie, bis der Computer initialisiert ist. Ändern Sie das Sichtfeld in D.Für die erstmalige Verwendung, bearbeiten Sie belichtungseinstellungen, indem Sie auf Bearbeiten, Einstellungen, Erfassung und automatische Belichtung klicken.Ändern Sie die maximale Belichtungszeit von der Standardbelichtungszeit von 60 Sekunden auf 300 Sekunden, und klicken Sie auf "Okay". Laden Sie eine Ein-Milliliter-Spritze mit D-Luciferin, fügen Sie dann eine halbe Zoll 30-Spur-Nadel in die Spritze und vertreiben Luftblasen. Messen und aufzeichnen Sie die Masse einer anästhesierten Maus.Halten Sie die Maus zurück, indem Sie die Schürfzeit des Halses mit Dem Daumen und den Zeigerfingern kneifen und den Schwanz zwischen dem rosa Finger und der Basis der Hand greifen. Invertieren Sie die Maus in einem 45-Grad-Winkel mit dem Nachunten-Kopf. Setzen Sie die Nadel, Abschrägung Seite nach oben, in die linke Seite der Maus IP-Raum.Bestätigen Sie den Eintrag in den IP-Bereich, indem Sie ein kleines Volume zurückzeichnen. Es sollte keine Farbe an der Basis der Nadel vorhanden sein, wenn sie im IP-Bereich zurückgezeichnet wird. Injizieren Sie das entsprechende Volumen von D-Luciferin für eine Dosis von 150 Milligramm pro Kilogramm.Unmittelbar nach der Verabreichung von D-Luciferin starten Sie einen Timer. Legen Sie die Maus flach auf den Rücken in das Bildgebungsgerät mit der Nase in den Nasenkegel, und stellen Sie sicher, dass ein halbes bis zweieinhalb Prozent Isofluran verabreicht wird. Klicken Sie auf die Leucht- und Fotoboxen.Ändern Sie die Belichtungszeit auf Auto, und klicken Sie dann im Erfassungsbedienfeld auf Acquire. Nach der Bildgebung kehren Sie die Maus für 15 Minuten in ihren Käfig und Monitor zurück, um eine vollständige Wiederherstellung zu gewährleisten. Nach der Euthanasie, wie im Textprotokoll beschrieben, isolieren und entfernen Sie die Lunge von jeder Maus und spülen Sie in 1X PBS, um überschüssiges Blut zu entfernen.Erfassen Sie Bilder von ZsGreen-Metastasen in den Lappen bei 10X in Brightfield und Fluoreszenz mit einem fluoreszierenden Stereoskop mit einem GFP-Breitbandfilter. Verwenden Sie Bildanalysesoftware, um die Größe und Anzahl der Metastasen aus den Bildern zu quantifizieren. Um die Daten aus den mit dem Live-Tierbildgerät aufgenommenen Bildern zu verarbeiten und zu analysieren, öffnen Sie alle Bilddateien für jede Maus in der Bildsoftware.Stellen Sie sicher, dass die Einheiten in Strahlkraft für biolumineszierende Daten und Effizienz für fluoreszierende Daten sind, indem Sie auf den Pfeil oben links im Bildfenster klicken und ihn in die entsprechende Einheit ändern. Verwenden Sie das Bild vom letzten Zeitpunkt, um einen Bereich von Interesse oder ROI zu erstellen, indem Sie zuerst im Werkzeugpalettenfenster auf ROI-Tools klicken. Fügen Sie dann einen ROI ein, indem Sie auf den Pfeil klicken und einen auswählen.Klicken Sie auf den Rand des ROI und bewegen Sie ihn auf die Brust der Maus. Passen Sie die Größe des ROI so an, dass er die Brust der Maus abdeckt und das Signal nicht ausschließt. Klicken Sie dann auf ROIs messen, und kopieren oder geben Sie die unformatierte Zahl in ein Excel-Blatt ein.Plotten und analysieren Sie die Daten, wie im Textprotokoll beschrieben. Klicken Sie mit der rechten Maustaste in die Bilddatei, um den ROI zu kopieren, und fügen Sie ihn dann aus den anderen Zeitpunkten in Bilddateien ein, und klicken Sie auf 0,99 000 ROIs. Retrovirale Vektorexzidose, die Tandem-miR-30-basierte shRNAs exemitt, die sowohl auf YAP als auch auf TAZ abzielen, reduziert die YAP- und Steuerproteinexpression und Transkriptionsaktivität in vier T1-Zellen.Vier T1-Luziferase-Zellen wurden mit einer ZsGreen-Exzessversion dieses Tandem-YAP/TAZ shRNA-Vektors oder einer kontrollierten miR-30-basierten shRNA stabil transduziert. Biolumineszierende Bilder zeigen, dass die Rate, mit der die metastasische Belastung zunahm, bei den Mäusen, die mit Kontrollzellen injiziert wurden, signifikant schneller war als bei den Mäusen, die mit YAP/TAZ-Knockdown-Zellen injiziert wurden. Ein Diagramm des log10 transformierten Luziferase-Signals, das im Laufe des Experiments für jede Maus gemessen wurde, zeigt auch, dass die Rate bei den Mäusen, die mit den Kontrollzellen injiziert wurden, schneller war als bei den Mäusen, die mit YAP/TAZ-Knockdown-Zellen injiziert wurden.Deutlich weniger Metastasen, die in den Mäusen mit den YAP/TAZ-Knockdown-Zellen injiziert wurden, im Vergleich zu Mäusen mit Kontrollzellen, wenn sie manuell gezählt werden. Derselbe Trend wurde bei der Verwendung der Bildanalysesoftware beobachtet. In den Kontrollmäusen bildeten sich nicht nur viele weitere Metastasen, sondern sie waren im Allgemeinen größer.Konsequent erweise wurde auch die metastasierende Belastung in der Lunge durch YAP/TAZ-Knockdown drastisch reduziert. Eine erfolgreiche Injektion von zellengleichen Zellen in jede Maus ist entscheidend, um qualitativ hochwertige Daten zu gewährleisten. Denken Sie daran, Vorsicht walten zu lassen und Sicherheitsrichtlinien zu befolgen, wenn Sie mit infektiösen Retroviren und Lentiviren arbeiten, insbesondere wenn die Viren infektiös sind.Diese Technik hat es uns ermöglicht, die Rolle von Kandidatengenen und metastasierender Kolonisation und Wachstum zu veranschaulichen und eine Möglichkeit zu bieten, neue therapeutische Ziele für die Behandlung von metastasierenden Krankheiten zu identifizieren und zu testen. Im Anschluss an dieses Verfahren können lungenhaltige Metastasen durch immunfluoreszierende oder histologische Färbung weiter analysiert werden, um zu untersuchen, wie das veränderte Gen Metastasen beeinflusst, und andere Proteine zu identifizieren, die beteiligt sein könnten.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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Forschung

Krebsforschung

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Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

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Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

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A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Ein Portal Veneninjektion Modell zur Untersuchung der Leber Metastasierung von Brustkrebs

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

Praktische Überlegungen an einem Studium von metastasierendem Lungenkrebs Besiedlung in Osteosarkom mit pulmonalen Metastasen-Assay

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Mikromanipulation von zirkulierenden Tumorzellen für die nachgelagerte Molekulare Analyse und die metastasierende Potenzialbewertung

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Pathologische Analyse der Lungenmetastasierung nach lateraler Schwanzveneninjektion von Tumorzellen

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

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Verwendung computerbasierter Bildanalyse zur Verbesserung der Quantifizierung von Lungenmetastasen im 4T1-Brustkrebsmodell

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

Modeling Brain Metastasis Via Tail-Vein Injection of Inflammatory Breast Cancer Cells

Modellierung der Hirnmetastasierung durch Injektion von entzündlichen Brustkrebszellen in die Schwanzvene

Metastatic spread to the brain is a common and devastating manifestation of many types of cancer. In the United States alone, about 200,000 patients are ...