Name: combined use of tail vein metastasis assays and real-time in vivo imaging to quantify breast cancer metastatic colonization and burden in the lungs
Uploaded: 2019-12-19T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs at JoVE.co

אנו מודים אמילי נורטון על סיוע עם זיהומים ויראלי קריאה ביקורתית של כתב היד. אנחנו גם מודים לריאן Kanai לעזרה עם רכישת תמונות של הריאות וקייט E. טאבבסינג לעזרה עם ניתוח תמונה של גרורות ירוקות בריאות. אנו מודים לצוות המחקר של בעלי החיים על תמיכתם וסיוע בהכנת וידאו זה. עבודה זו נתמכת על ידי הגרנט סוזן ג ' Komen הקריירה המענק הוענק J.M.L. (#CCR17477184).

פרוטוקול זה כרוך בשימוש בעכברים ובחומרים ביו-מסוכנים ומחייב אישור מוועדות הבטיחות המוסדיים המתאימות. כל המתואר בעבודה vivo כאן הוא אישר על ידי מכללת אולבני המכללה הרפואית בעלי חיים מוסדיים ועדת השימוש (IACUC).
הערה: למבט כולל על פרוטוקול, ראה סכמטי באיור 1.
<p clas...

צעדים קריטיים של השיטה זה קריטי כדי לייעל את מספר התאים המוזרקים (שלב 3) עבור קו תא נתון ומתח העכבר כמו זה יכול להשפיע מאוד על מספר גרורות כי הטופס ואת אורך הניסוי. אם תאים רבים מדי מוזרק או לגדול גרורות במשך זמן רב מדי, גרורות עשוי להיות קשה לספור עושה את ההשפעות של מניפולציה גנטית...

הסרטן נשאר הגורם המוביל השני של המוות ברחבי העולם1 גרורות הוא אחראי על רוב מקרי המוות האלה2,3. עם זאת, הבנה מוגבלת של המנגנונים המולקולריים השולטים בקולוניזציה גרורתית והצמיחה הבאה מעכבת את התפתחות הטיפולים האפקטיביים למחלות גרורתית. הזיהוי של מטרות טיפוליות הרומן דורש מבחן כדי לבחון עד כמה מודאג הביטוי או התפקוד של גן מועמד משפיע גרורות היווצרות וצמיחה. בעוד שלדגמי העכבר האוטומטיים יש את היתרונות שלהם, הם צורכים זמן ויקרים להפקת, מה שהופך אותם למתאימים יותר לאימות היעד ולא לגילוי המטרה. מערכות מודל להשתלות שבו הגן המועמד הוא מודאג בתאי הסרטן בתחום החוץ ולאחר מכן השפעות על פוטנציאל גרורתי מוערך ב vivo, הם פחות יקר והתפוקה גבוהה יותר מאשר מודלים autochthonous. בנוסף, וקטורים ויראליות עבור משלוח יציב של RNAi, CRISPR/CAS9, ו transgenes זמינים באופן נרחב, מה שהופך אותו קל יחסית לperturb כמעט כל גן או גנים של עניין קווי תאים סרטניים. גישה זו יכולה לשמש גם כדי לייחס את התפקיד של הגנים המועמדים בקולוניזציה גרורתית וצמיחה בתאי סרטן האנושי על ידי שתילת התאים לתוך מושפע חיסוני או עכברים הומניזציה.
שני סוגים של בחני המשמש לבדיקת גרורות על-ידי תאים סרטניים מושתלים ב vivo הם גרורה ספונטנית וגרורה ניסיוני. ב גרורות ספונטנית אומר4,5, התאים הסרטניים מוזרק לתוך עכברים, מותר ליצור גידול ראשוני, ולאחר מכן היווצרות גרורות ספונטנית הצמיחה הבאה הם החוצה. החוזק של המודל הזה הוא כי התאים חייבים להשלים את כל השלבים של תהליך גרורתי כדי ליצור גידולים גרורתי. עם זאת, הרבה קווי התאים של סרטן אינם גרורות ביעילות במודלים גרורות ספונטנית, וכל מניפולציה של התאים ההשפעות על גידול ראשוני הגידול יכול לבלבל את התוצאות של שיטת גרורות. גרורות ניסיוני, שבו תאים סרטניים מוזרק ישירות לתוך המחזור, משמשים כדי למנוע מלכודות אלה. גרורות נסיוניות נפוצות כוללות את הזרקת וריד הזנב6,7,8 (והפגינו כאן), הזרקת תאיים9, ו הזרקת וריד השער10.
מטרת הפרוטוקול המוצג כאן היא לספק vivo גרורות ניסיוני המאפשר חוקר לפקח גרורות היווצרות וצמיחה בזמן אמת, כמו גם לכמת את נקודת הסיום מספר וגודל בריאות של אותו עכבר. כדי להשיג את זה, הניסוי המסורתי וריד הזנב גרורות שאומר6,7,8 משולבים עם הדמיה חיה בעלי חיים, באמצעות מכשיר vivo הדמיה9,11,12,13,14. תאים סרטניים באופן בלתי נשכח הן לוציפראז ו חלבון פלורסנט מוזרק לתוך עכברים דרך הווריד זנב לרוחב ולאחר מכן במכשיר הדמיה vivo משמש למדוד שינויים נטל גרורתי בריאות לאורך זמן (איור 1). עם זאת, המכשיר vivo live הדמיה בעלי חיים לא יכול להבחין או למדוד את הגודל של גרורות בודדות. כך, בסוף הניסוי, stereomicroscope פלורסנט משמש כדי לספור את המספר ולמדוד את הגודל של גרורות פלורסנט בריאות ללא צורך בהענשת היסטולוגיה או אימונוהיסטוכימיה (איור 1). פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לבדוק כיצד לשנות את הביטוי או הפונקציה של מועמד גן משפיע גרורות היווצרות וצמיחה. תרכובות טיפוליות פוטנציאליות כגון מולקולות קטנות או נוגדנים לחסימת פונקציות ניתן גם לבדוק.
כדי להדגים גישה זו, ביצעת תחילה הוכחה של ניסוי המושג שבו גורם שכפול חיוני, חלבון שכפול A3 (RPA3) הוא הופל בתאים גרורות בסרטן השד העכבר. אנו מראים כי עכברים שהוחדרו עם RPA3 למטה התאים יש נטל משמעותי פחות גרורתי בכל נקודת זמן לעומת עכברים שהוחדרו עם תאי בקרה. ניתוח של הריאות גרורות מכיל מראה כי זה נטל גרורתי מופחתת היא תוצאה של מושבת גרורתית משמעותית וצמיחה לקויה של גרורות כי הטופס. כדי להמחיש עוד טכניקה זו, בדקנו אם בו להפיל את החלבון המשויך כן (יאפ) ו transcript co-activator עם מוטיב מחייב PDZ (TAZ) פוגע מושבת גרורתית או הצמיחה הבאה. לאחר מכן ו TAZ הם שני הקשורים הטרנססקריפט שיתוף מפעילים כי הם המטה הקריטי של מסלול היפו. אנו15,16 ואחרים יש מעורבים לנבוח ו TAZ ב גרורות (נבדקו17,18,19), הרומז כי חלבונים אלה הם מטרות טיפוליות טוב. באופן עקבי, מצאנו כי עכברים מוזרק עם מיקוד למטה לתאי הנוק/טאז הופחת משמעותית נטל גרורתי. ניתוח של הריאות הראו כי מיקוד למטה את התאים של מלנוק/טאז יצרו הרבה פחות גרורות ושגרורות שעשו צורה היו קטנות יותר. ניסויים אלה מדגימים כיצד גרורות נסיוניות לאפשר לחוקר במהירות ובזול לבדוק את התפקיד של גן מועמד במערך גרורות וצמיחה. הם עוד מראים כיצד השימוש המשולב של הדמיה חיה בעלי חיים וקוונפיקציה פלורסנט של גרורות בריאות שלמות מאפשר לחוקר להבין טוב יותר את השלבים במהלך הקולוניזציה גרורתית.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% SDS-PAGE Gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td>Trypsin for tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat bottom white assay plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3922</td>
			<td>For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol wipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For sterolizing the injection site before tail vein injecitons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/C mice (female, 6 weeks)</td>
			<td>Taconic</td>
			<td>BALB-F</td>
			<td>For tail vein metastatic colonization and burden assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA regular</td>
			<td>VWR Ameresco</td>
			<td>97061-416</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lysis buffer</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td></td>
			<td>For collecting protien samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celltreat Syringe Filters, PES 30mm, 0.45 &#956;m</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>40-229749-CS</td>
			<td>For filtering viral supernatant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 and euthanasia chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For euthanasing the mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-luciferase reporter assay kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1960</td>
			<td>For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&39;s phosphate buffered saline</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>TS1006</td>
			<td>For PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-406</td>
			<td>Used to dilute trypsin for tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS 100% US origin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97068-085</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fujifilm LAS-3000 gel imager</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td></td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH(14C10) Rabibit mAb</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2118</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP conjugate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>31460</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human embryonic kidney cells, HEK-293FT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R70007</td>
			<td>Cell line used for packging virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone DMEM/High clucose</td>
			<td>GE Healthcare life sciences</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B, Ultra Pure Grade</td>
			<td>VWR Ameresco</td>
			<td>97064-810</td>
			<td>For antibiotic selection of infected cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td></td>
			<td>For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imagej</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for image analysis of lung metastases: threshold set to 25 &#38; 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immuno-Blot PVDF Membrane</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1620177</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For mouse anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System (in vivo live animal imaging device)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>CLS136340</td>
			<td>For in vivo imaging of metastatic burden</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M205 FA &#38; Lecia DCF3000 G (GFP and bright field filters)</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Microscope and camera for visualing, counting and taking pcitures of metastases in the lungs; 10X magnifacation, 3.5 sec exposure, 1.4 gain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>L3000008</td>
			<td>For YAP/TAZ-TEAD reporter transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image 3.2 (image software program)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Software for IVIS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse breast cancer cells, 4T1</td>
			<td>Karmanos Cancer Institute</td>
			<td>Aslakson, CJ et al.,1992</td>
			<td>Mouse metastatic breast cance cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Gauge version 3.0</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td></td>
			<td>Software for quantifying western blot band intensity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM (transfection buffer)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-062</td>
			<td>For packaging virus and transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA protein assay kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td>For quantifying protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Phosphatase Inhibitor Mini Tablets</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32957</td>
			<td>Added to cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32953</td>
			<td>Added to cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene (hexadimethrine bromide)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>45-H9268</td>
			<td>For infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>45-P7255</td>
			<td>For antibiotic selection of infected cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent restrainer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For restraining mice during tail vein injeciton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE running buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAZ (V3886) Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4883</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBST buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20 automated cell counter</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>For counting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See Table 1 for complete list of vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89404-464</td>
			<td>For visualizing fluorescence in ZSGreen labeled cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western transfer buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XenoLight D-Luciferin K+ Salt</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>122799</td>
			<td>Substrate injected into mice for in vivo bioluminescent IVIS images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (lipid solution for transfection)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6365787001</td>
			<td>For packaging virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YAP (D8H1X) XP Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>14074</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combined use of tail vein metastasis assays and real-time in vivo imaging to quantify breast cancer metastatic colonization and burden in the lungs

גרורות הוא הגורם העיקרי של מקרי מוות הקשורים לסרטן, יש אפשרויות טיפוליות מוגבלות עבור חולים עם מחלה גרורתית. זיהוי ובדיקה של מטרות טיפוליות הרומן שיאפשרו פיתוח של טיפולים טובים יותר עבור מחלה גרורתית דורש פרה במודלים vivo. הפגינו כאן הוא מודל העכבר הסינגנטי עבור assaying סרטן השד מושבת גרורות והצמיחה הבאים. תאים סרטניים גרורות הם התמרה באופן בלתי נשכח עם נגיפי וקטורים קידוד גחלילית לוציפראז ו-ZsGreen חלבונים. המועמדים הגנים הם לאחר מכן מניפולציות באופן שולי ב לוציפראז/ZsGreen-ביטוי תאים סרטניים ולאחר מכן התאים מוזרק לתוך עכברים באמצעות וריד זנב לרוחב לתוך מושבת גרורתית וצמיחה. במכשיר הדמיה vivo משמש מכן כדי למדוד את הביולומינציה או הזריחה של תאי הגידול בבעלי חיים לכמת שינויים בנטל גרורתי לאורך זמן. הביטוי של חלבון פלורסנט מאפשר את מספר וגודל גרורות בריאות כדי להיות כמותית בסוף הניסוי ללא צורך במתן הסבר או כתמים היסטולוגית. גישה זו מציעה דרך מהירה וקלה יחסית כדי לבדוק את התפקיד של גנים המועמדים בקולוניזציה גרורתית וצמיחה, ומספק הרבה יותר מידע מאשר מסורתית הזנב גרורות גרואסאומר. באמצעות גישה זו, אנו מראים כי הסתרה בו זמנית של החלבון המשויך כן (לצ) ו הטרנססקריפט שיתוף activator עם מוטיב PDZ-מחייב (TAZ) בתאי סרטן השד מוביל נטל גרורתי מופחת בריאות וכי נטל זה מופחת הוא תוצאה של מושבת גרורתית באופן משמעותי וצמיחה מופחתת של גרורות.

כדי להדגים את הגישה הנ ל, ביצעת הוכחת הרעיון של ניסוי שבו גורם שכפול קריטי, RPA3 הופל בתוך מיכל של קרצינומה של הפטמות של העכבר גרורות (4T122). בעוד הפרוטוקול מתאר תיוג התאים עם לוציפראז וחלבונים פלורסנט לפני מניפולציה גנטית, השתמשנו בגישה שונה כי וקטורים RNAi גם לספק ZsGreen (א...

Watch this Scientific Journal Video about Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs at JoVE.co

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

הגישה המתוארת משלבת הזנב הנסיוני גרורות מוסר עם הדמיה vivo live בעלי חיים כדי לאפשר ניטור בזמן אמת של גרורות סרטן השד היווצרות וצמיחה בנוסף לקוונפיקציה של מספר גרורות וגודל בריאות.

שימוש משולב של הזנב וריד גרורה Assays ובזמן אמת ב Vivo הדמיה כדי לכמת מושבת סרטן השד ונטל בריאות

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

הפרוטוקול שלנו יכול לשמש במהירות ובקלות לבדוק את התפקיד של כל גן מועמד קולוניזציה גרורתית וצמיחה. הפרוטוקול מאפשר גם ניטור בזמן אמת של גרורות, היווצרות וצמיחה, כמו גם כימות של מספר גרורות וגודל באותם בעלי חיים ללא צורך בתיקון או כתמים היסטולוגיים. לוח ארבעה תאים T1 ב 150, 000 תאים לגם בצלחת 12 באר במדיה צמיחה מלאה.דגירה ב 37 מעלות צלזיוס 5% פחמן דו חמצני לילה. למחרת, שאף את תקשורת הצמיחה מהתאים. הוסף 500 מיקרוליטרים של על-טבעי ויראלי לוציפראז ו-500 מיקרוליטרים של חלבון פלואורסצנטי נגיפיים כדי להדביק בו זמנית את התאים הן עם החלבון הלוציפראז והן עם חלבונים פלואורסצנטיים.לאחר מכן, מוסיפים מיקרוליטר אחד של שמונה מיליגרם למיליליטר הקסדימתרין ברומיד ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 24 עד 48 שעות. טריפסיניזציה של ארבעת תאי T1 עם 500 מיקרוליטרים של טריפסין. לאחר שתיים עד חמש דקות, להעביר את כל התאים לצלחת שישה סנטימטרים בארבעה מיליליטר של מדיה הבחירה, ובכך מרווה את טריפסין.לאחר השלמת הבחירה, אשר כי ארבעת תאי T1 הנגועים מבטאים חלבון פלואורסצנטי ZsGreen באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך בהגדלה של פי 50 עד 100. כמו כן לאשר כי ארבעה תאים T1 נגועים מבטאים luciferase באמצעות ערכת פעילות לוציפראז זמין מסחרית. המשך לבצע אופטימיזציה של העיצוב הניסיוני in vivo כמתואר בפרוטוקול הטקסט.שאפו את המדיה ושטוף את לוחות התאים עם PBS 1X. טריפסין התאים עם חמישה מיליליטר של טריפסין לכל צלחת 15 ס"מ במשך שתיים עד חמש דקות ולהעביר את כל התאים לצינור חרוט. לשטוף את התאים הנותרים מן צלחת תרבות הרקמות עם מספיק מדיה צמיחה מלאה כדי לרוות את טריפסין.מוסיפים את הכביסה לאותו צינור חרוט. ספור את התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי כדי לקבוע את מספר התא הכולל. לאחר מכן, צנטריפוגה התאים ב 122 פעמים G במשך שלוש דקות, ושואפים את העל טבעי.להשעות מחדש את התאים PBS 1X בריכוז הרצוי. כאן, 25, 000 תאים מוזרקים לתוך כל עכבר ו 100 microliters של PBS. אז התאים המושעים מחדש הם ב-250,000 תאים למיליליטר.שמור את המתלים התא על קרח עד הזרקה. עבודה במכסה המנוע במתקן בעלי החיים, בעדינות אך ביסודיות לערבב את התאים על ידי היפוך הצינור או באמצעות מזרק מיליליטר אחד כדי להבטיח כי הם מושעים מחדש באופן אחיד. עכשיו, לטעון מזרק לולר לוק אחד מיליליטר עם ההשעיה התא לגרש בועות אוויר עודף.מניחים מחט חצי אינץ ' 30 מד על המזרק עם שיפה למעלה לגרש בועות אוויר. מניחים בעדינות את העכבר במכרסם. וריד הזנב האחורי צריך להיות גלוי ומופחת.אם לא, יש לצבוט בעדינות את בסיס הזנב ולטבול את הזנב במי ברז חמים כדי לטבול את הוורידים. השתמש לנגב אלכוהול כדי לנקות את הזנב, ולאחר מכן להכניס את המחט לתוך וריד הזנב, צד משופע למעלה, ולהזריק 100 microliters של השעיית התא. אם המחט מוכנסת כראוי לתוך וריד, זה צריך בקלות להחליק מעט קדימה ואחפה, ולא צריך להיות התנגדות כאשר הבוכנה הוא דחף.זריקות מוצלחות צריך גם לגרום סומק שבו הצבע הכחול של הוריד הופך לבן במשך כמה שניות לאחר ההזרקה. לאט להסיר את המחט, באמצעות גזה סטרילית, להפעיל לחץ על אתר ההזרקה כדי לעצור כל דימום. להחזיר את העכבר לכלוב שלה לפקח במשך 15 דקות כדי להבטיח התאוששות מלאה.הפעל את התקן ההדמיה החיה של in vivo, פתח את תוכנת התמונה והיכנס. לחץ על לחצן האתחול והמתן לאתחול המחשב. שנה את שדה התצוגה ל- D. לשימוש ראשון, ערוך הגדרות חשיפה על-ידי לחיצה על עריכה, העדפות, רכישה וחשיפה אוטומטית.שנה את זמן החשיפה המרבי מ- 60 השניות המוגדרות כברירת מחדל ל- 300 שניות ולחץ על אישור. לטעון מזרק מיליליטר אחד עם D-luciferin, ולאחר מכן להוסיף חצי אינץ ' 30 מחט מד למזרק לגרש בועות אוויר. למדוד ולתקליט את המסה של עכבר הרדמה.רסן את העכבר על ידי צביטת עורף הצוואר באמצעות האגודל ואצבעות המצביע ותפיסת הזנב בין האצבע הזרת לבסיס היד. היפוך העכבר בזווית של 45 מעלות כשראשו מצביע כלפי מטה. הכנס את המחט, שיפוע צד למעלה, לתוך שטח IP בצד שמאל של העכבר.אשר את הכניסה לשטח ה- IP על-ידי משיכת אמצעי אחסון קטן. לא צריך להיות צבע בבסיס המחט בעת ציור בחזרה בחלל ה-IP. להזריק את הנפח המתאים של D-לוסיפרין עבור מנה של 150 מיליגרם לקילוגרם.מיד לאחר ממשל D-לוציפרין, להתחיל טיימר. מניחים את העכבר שטוח על גבו במכשיר ההדמיה עם אפו בקונוס האף, ולהבטיח כי אחד חצי עד שניים וחצי אחוז isoflurane מנוהל. לחץ על תיבות זוהר וצילום.שנה את זמן החשיפה לאוטואי ולאחר מכן לחץ על רכוש בלוח הבקרה של הרכישה. לאחר ההדמיה, להחזיר את העכבר לכלוב שלה לפקח במשך 15 דקות כדי להבטיח התאוששות מלאה. בעקבות המתת חסד, כמתואר בפרוטוקול הטקסט, לבודד ולהסיר את הריאות מכל עכבר ולשטוף ב 1X PBS כדי להסיר דם עודף.לרכוש תמונות של גרורות ZsGreen באונות ב 10X בברייטפילד פלואורסצנטי באמצעות סטריאוסקופ פלואורסצנטי עם מסנן פס רחב GFP. השתמש בתוכנה לניתוח תמונות כדי לכמת את הגודל והמספר של גרורות מהתמונות. כדי לעבד ולנתח את הנתונים מהתמונות שנרכשו באמצעות התקן ההדמיה החיה in vivo, פתח את כל קבצי התמונה עבור כל עכבר בתוכנת התמונה.ודא כי היחידות הן זוהר עבור נתונים bioluminescent ויעילות עבור נתונים פלואורסצנטיים על ידי לחיצה על החץ בחלק השמאלי העליון של חלון התמונה ושינויו ליחידה המתאימה. השתמש בתמונה מנקודת הזמן האחרונה כדי ליצור אזור מעניין, או ROI, על-ידי לחיצה תחילה על כלי ROI בחלון לוח הכלים. לאחר מכן, הוסף ROI אחד על-ידי לחיצה על החץ ובחירתו.לחץ על הגבול של ROI והזז אותו אל החזה של העכבר. התאם את גודל ההשקעה כך שהיא תכסה את החזה של העכבר ולא תכלול אות. לאחר מכן, לחץ על למדוד את מספר ההשקעה ולהעתיק או להקליד את המספר הגולמי בגיליון Excel.התווה ונתח את הנתונים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני בקובץ התמונה כדי להעתיק את ה- ROI ולאחר מכן הדבק אותו בקבצי תמונה מנקודות הזמן האחרות ולחץ על למדוד ROIs. וקטור רטרו-ויראלי המבטא shRNAs מבוססי טנדם miR-30 המכוונים הן YAP והן TAZ מפחית ביטוי YAP וחלבון מס ופעילות שעתוק בארבעה תאי T1.ארבעה תאי לוציפראז T1 התומרו באופן הדוק עם גרסה מבטאת ZsGreen של וקטור YAP/ TAZ shRNA דו-מושבי זה או shRNA מבוקר מבוסס miR-30. תמונות ביולומינסנטיות מראות כי הקצב שבו הנטל גרורתי גדל היה מהיר משמעותית בעכברים שהוזרקו לתאי בקרה בהשוואה לעכברים שהוזרקו לתאי הפלה YAP/TAZ. חלקה של log10 הפך אות luciferase נמדד עבור כל עכבר במהלך הניסוי גם מראה כי הקצב היה מהיר יותר בעכברים מוזרק עם תאי הבקרה לעומת העכברים מוזרק עם תאי נוקאאוט YAP / TAZ.באופן משמעותי פחות גרורות נוצרו בעכברים מוזרק עם תאי הפלה YAP / TAZ לעומת עכברים עם תאי בקרה כאשר נספרים באופן ידני. אותה מגמה נצפתה בעת שימוש בתוכנת ניתוח התמונה. לא רק שרבות גרורות נוספות נוצרו בעכברי הבקרה, הן היו בדרך כלל גדולות יותר.באופן עקבי, הנטל גרורתי בריאות גם הופחת באופן דרסטי על ידי YAP / TAZ להפיל. הזרקה מוצלחת של מספרים שווים של תאים בריאים לכל עכבר היא קריטית כדי להבטיח נתונים באיכות גבוהה. זכור לנקוט זהירות ופעל בהתאם להנחיות הבטיחות בעת עבודה עם רטרווירוסים זיהומיות lentiviruses, במיוחד אם הנגיפים הם זיהומיות אנושיות.טכניקה זו אפשרה לנו להמחיש את התפקידים של גנים מועמדים קולוניזציה גרורתית וצמיחה, מתן דרך לזהות ולבדוק מטרות טיפוליות חדשניות לטיפול במחלות גרורתיות. בעקבות הליך זה, גרורות המכילות ריאות ניתן לנתח עוד יותר על ידי כתמים immunofluorescent או היסטולוגית כדי לחקור כיצד הגן השתנה משפיע על גרורות ולזהות חלבונים אחרים שעשויים להיות מעורבים.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis

הזרקת עורק Intra-כסל עבור דוגמנות יעילה וסלקטיבי של מיקרוסקופיים עצם גרור

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely ...

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

מבחני Coculture ללמוד מקרופאג Microglia גירוי של גליובלסטומה הפלישה

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

מתקדם במודל חיה של גרורה גסה בכבד: טכניקות הדמיה ונכסים של משובטים גרורתי

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

ניצול הקרנת Genomics פונקציונלית כדי לזהות מטרות תרופה חדשנית פוטנציאלי תרבויות אליפטית תא סרטני

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

מודל הזרקת Portal Vein לחקר גרור בכבד של סרטן השד

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

שיקולים מעשיים בלימוד כיבוש ריאות גרורתי אוסטאוסרקומה באמצעות וזמינותו גרורות בריאות

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

מיקרומניפולציה של במחזור תאים סרטניים לניתוח מולקולרי במורד הזרם והערכה פוטנציאלית גרורתית

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

ניתוח פתולוגי של גרורות ריאות בעקבות הזרקת וריד זנב לרוחב של תאים סרטניים

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

שימוש בניתוח תמונה מבוסס מחשב כדי לשפר את כימות גרורות הריאות במודל סרטן השד 4T1

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

Modeling Brain Metastasis Via Tail-Vein Injection of Inflammatory Breast Cancer Cells

מידול גרורות במוח באמצעות הזרקת ורידים בזנב של תאי סרטן שד דלקתיים

Metastatic spread to the brain is a common and devastating manifestation of many types of cancer. In the United States alone, about 200,000 patients are ...