Name: combined use of tail vein metastasis assays and real-time in vivo imaging to quantify breast cancer metastatic colonization and burden in the lungs
Uploaded: 2019-12-19T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs at JoVE.co

우리는 바이러스 감염과 원고의 비판적 독서를 지원에 대한 에밀리 노턴 감사합니다. 우리는 또한 폐에 있는 녹색 전이의 심상 분석에 도움을 위한 폐와 케이트 E. Tubbesing의 심상을 취득하는 것을 도움을 위한 라이언 카나이 에게 감사합니다. 동물 연구 시설 직원의 지원과 이 비디오 작성에 도움을 주신 것에 대해 감사드립니다. 이 작품은 J.M.L.에 수여 수잔 G. 코멘 경력 촉매 그랜트에 의해 지원되었다 (#CCR17477184).

이 프로토콜은 마우스 및 생체 유해 물질의 사용을 포함하고 적절한 기관 안전 위원회의 승인을 필요로한다. 여기에 설명된 모든 생체 내 작업은 알바니 의과 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인됩니다.
참고: 프로토콜 개요는 그림 1의회로도를 참조하십시오.
1. 필요한 모든 레트로 바이러스 및 렌티 바이러스 포장...

메서드의 중요한 단계 주어진 세포주 및 마우스 균주에 대해 주입된 세포수(단계 3)를 최적화하는 것이 중요하며, 이는 실험의 형태및 길이에 크게 영향을 미칠 수 있다. 너무 많은 세포가 주입되거나 전이가 너무 오래 증가하는 경우에, 전이가 평가하기 어려운 유전 조작의 효력을 만드는 계산하기 어려울 지도 모릅니다. 그러나, 너무 적은 세포가 주입되는 경우에, 몇몇 또는 전혀 ...

암은 전 세계적으로 사망의 두 번째 주요 원인 남아1 전이 이 죽음의 대부분에 대한 책임이2,3. 그러나, 전이성 식민지및 후속 성장을 통제하는 분자 기계장치의 한정된 이해는 전이성 질병을 위한 효과적인 처리의 발달을 방해했습니다. 새로운 치료 표적의 확인은 후보 유전자의 교란된 발현 또는 기능이 전이 형성 및 성장에 미치는 영향을 테스트하기 위한 분석법을 필요로 한다. autochthonous 마우스 모델은 장점이 있지만 생성하는 데 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 들기 때문에 대상 검색보다는 대상 유효성 검사에 더 적합합니다. 후보 유전자가 시험관 내 암세포에서 교란되고 전이성 전위전위에 대한 영향이 생체 내에서 평가되는 이식 모델 시스템은 자가 진단모델보다 비용이 적게 들고 처리량이 높다. 또한, RNAi, CRISPR/CAS9 및 트랜스유전자의 안정한 전달을 위한 바이러스 벡터가 널리 이용가능하여, 암 세포주에서 관심 있는 거의 모든 유전자 또는 유전자를 비교적 쉽게 교란할 수 있다. 이 접근법은 또한 세포를 면역 타협 또는 인간화 된 마우스로 이식함으로써 인간 암 세포주에서 전이성 식민지화 및 성장에서 후보 유전자의 역할을 분석하는 데 사용할 수 있습니다.
생체 내에서 이식된 암세포에 의한 전이 형성을 테스트하는 데 사용되는 두 가지 유형의 실험은 자발적전이성 전이 검정 및 실험전이이다. 자발적 전이분석4,5에서,암세포는 마우스로 주입되고, 원발성 종양을 형성하도록 허용한 다음, 자발적전이 형성 및 후속 성장이 분석된다. 이 모형의 힘은 세포가 전이성 종양을 형성하기 위하여 전이성 프로세스의 모든 단계를 완료해야 한다는 것입니다. 그러나, 많은 암 세포주는 자발적인 전이 모델에서 효율적으로 전이되지 않으며, 원발성 종양 성장에 영향을 미치는 세포의 조작은 전이 분석의 결과를 혼동할 수 있다. 암세포가 순환에 직접 주입되는 실험적 전이 실험은 이러한 함정을 피하기 위해 사용됩니다. 일반적인 실험전이검사는꼬리정맥주사6,7,8(여기서 입증됨), 심내주사9,및 문맥주사(10)를 포함한다.
여기에 제시된 프로토콜의 목적은 연구원이 실시간으로 전이 형성 및 성장을 모니터링할 수 있도록 하는 생체 내 실험 전이 분석실험을 제공할 뿐만 아니라 동일한 마우스의 폐에서 종점 전이 수 및 크기를 정량화하는 것이다. 이를 달성하기 위해, 전통적인 꼬리 정맥 전이 검소6,7,8은 생체 내 이미징 장치9,11,12,13,14를사용하여 살아있는 동물 이미징과 결합된다. 루시퍼라제와 형광 단백질을 모두 안정적으로 발현하는 종양 세포는 측면 꼬리 정맥을 통해 마우스내로 주입된 후 생체내 이미징 장치는 시간이 지남에 따라 폐의 전이성 부담의 변화를 측정하는데 사용된다(그림1). 그러나, 생체 내 살아있는 동물 이미징 장치는 개별 전이의 크기를 구별하거나 측정할 수 없다. 따라서, 실험의 끝에서, 형광 입체 현미경은 절편 및 조직학 또는 면역 조직화학의 필요없이 폐에서 형광 전이의 크기를 카운트하고 측정하기 위해 사용된다(그림 1). 이 프로토콜은 후보 유전자의 발현 또는 기능을 변경하는 것이 전이 형성 및 성장에 미치는 영향을 테스트하는 데 사용될 수 있다. 항체를 차단하는 작은 분자 또는 기능과 같은 잠재적인 치료 화합물도 시험될 수 있습니다.
이 접근법을 설명하기 위하여는, 우리는 먼저 필수적인 복제 인자, 복제 단백질 A3 (RPA3)가 전이성 마우스 유방암 세포에서 쓰러지는 개념 실험의 증명을 수행했습니다. 우리는 RPA3 녹다운 세포로 주입된 마우스가 대조군 세포로 주입된 마우스에 비해 매 시점에서 현저한 전이성 부담을 가지고 있음을 보여준다. 전이 함유 폐의 분석은 이러한 전이성 부담 감소가 전이성 식민지화 및 형성되는 전이의 성장을 크게 감소시킨 결과임을 보여준다. 이 기술을 추가로 설명하기 위하여는, 우리는 PDZ 결합 모티프 (TAZ)를 가진 예 관련 단백질 (YAP) 및 전사 공동 활성제의 동시 노크가 전이성 식민지화 또는 후속 성장을 손상하는지 여부를 시험했습니다. YAP 와 TAZ는 하마 통로의 중요한 하류 이펙터인 두 개의 관련 전사 공동 활성제입니다. 우리15,16 및 그 외는 전이에 YAP와 TAZ를 연루했습니다(17,18,19에서검토), 이 단백질이 좋은 치료 표적이다는 것을 건의합니다. 일관되게, 우리는 YAP/TAZ 녹다운 세포로 주입된 마우스가 전이성 부담을 현저하게 감소시켰음을 발견했습니다. 폐의 분석은 YAP/TAZ 녹다운 세포가 더 적은 전이를 형성하고 양식한 전이가 더 작다는 것을 보여주었습니다. 이 실험은 실험적인 전이 실험이 어떻게 연구원이 전이 형성 및 성장에 있는 후보 유전자의 역할을 신속하고 저렴하게 시험하는 것을 허용하는지 보여줍니다. 그(것)들은 또한 살아있는 동물 화상 진찰의 결합한 사용 및 전체 폐에 있는 전이의 형광 정량화가 전이성 식민지 도중 단계를 더 잘 이해하는 것을 허용하는 방법을 보여줍니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% SDS-PAGE Gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td>Trypsin for tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat bottom white assay plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3922</td>
			<td>For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol wipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For sterolizing the injection site before tail vein injecitons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/C mice (female, 6 weeks)</td>
			<td>Taconic</td>
			<td>BALB-F</td>
			<td>For tail vein metastatic colonization and burden assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA regular</td>
			<td>VWR Ameresco</td>
			<td>97061-416</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lysis buffer</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td></td>
			<td>For collecting protien samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celltreat Syringe Filters, PES 30mm, 0.45 &#956;m</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>40-229749-CS</td>
			<td>For filtering viral supernatant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 and euthanasia chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For euthanasing the mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-luciferase reporter assay kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1960</td>
			<td>For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&39;s phosphate buffered saline</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>TS1006</td>
			<td>For PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-406</td>
			<td>Used to dilute trypsin for tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS 100% US origin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97068-085</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fujifilm LAS-3000 gel imager</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td></td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH(14C10) Rabibit mAb</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2118</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP conjugate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>31460</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human embryonic kidney cells, HEK-293FT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R70007</td>
			<td>Cell line used for packging virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone DMEM/High clucose</td>
			<td>GE Healthcare life sciences</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B, Ultra Pure Grade</td>
			<td>VWR Ameresco</td>
			<td>97064-810</td>
			<td>For antibiotic selection of infected cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td></td>
			<td>For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imagej</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for image analysis of lung metastases: threshold set to 25 &#38; 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immuno-Blot PVDF Membrane</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1620177</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For mouse anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System (in vivo live animal imaging device)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>CLS136340</td>
			<td>For in vivo imaging of metastatic burden</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M205 FA &#38; Lecia DCF3000 G (GFP and bright field filters)</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Microscope and camera for visualing, counting and taking pcitures of metastases in the lungs; 10X magnifacation, 3.5 sec exposure, 1.4 gain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>L3000008</td>
			<td>For YAP/TAZ-TEAD reporter transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image 3.2 (image software program)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Software for IVIS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse breast cancer cells, 4T1</td>
			<td>Karmanos Cancer Institute</td>
			<td>Aslakson, CJ et al.,1992</td>
			<td>Mouse metastatic breast cance cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Gauge version 3.0</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td></td>
			<td>Software for quantifying western blot band intensity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM (transfection buffer)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-062</td>
			<td>For packaging virus and transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA protein assay kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td>For quantifying protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Phosphatase Inhibitor Mini Tablets</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32957</td>
			<td>Added to cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32953</td>
			<td>Added to cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene (hexadimethrine bromide)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>45-H9268</td>
			<td>For infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>45-P7255</td>
			<td>For antibiotic selection of infected cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent restrainer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For restraining mice during tail vein injeciton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE running buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAZ (V3886) Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4883</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBST buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20 automated cell counter</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>For counting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See Table 1 for complete list of vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89404-464</td>
			<td>For visualizing fluorescence in ZSGreen labeled cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western transfer buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XenoLight D-Luciferin K+ Salt</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>122799</td>
			<td>Substrate injected into mice for in vivo bioluminescent IVIS images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (lipid solution for transfection)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6365787001</td>
			<td>For packaging virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YAP (D8H1X) XP Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>14074</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combined use of tail vein metastasis assays and real-time in vivo imaging to quantify breast cancer metastatic colonization and burden in the lungs

전이는 암 관련 죽음의 주요 원인이고 전이성 질병을 가진 환자를 위한 한정된 치료 선택권이 있습니다. 전이성 질병에 대한 더 나은 치료법의 개발을 용이하게 하는 새로운 치료 표적의 식별 및 테스트에는 생체 내 전임상 모델이 필요합니다. 여기에서 입증된 것은 유방암 전이성 식민지화 및 후속 성장을 위한 합성 마우스 모델이다. 전이성 암 세포는 반딧불 루시퍼라제 및 ZsGreen 단백질을 코딩하는 바이러스 벡터로 안정적으로 변환됩니다. 후보 유전자는 그 때 luciferase/ZsGreen 발현암세포에서 그 후에 세포가 전이성 식민지화 및 성장을 분석하기 위하여 측방 꼬리 정맥을 통해 마우스로 주입됩니다. 생체 내 이미징 장치는 살아있는 동물의 종양 세포의 생물 발광 또는 형광을 측정하여 시간이 지남에 따라 전이성 부담의 변화를 정량화하는 데 사용됩니다. 형광 단백질의 발현은 절편 또는 조직학적 염색없이 실험이 끝날 때 폐에서 전이의 수와 크기를 정량화할 수 있게 한다. 이 접근법은 전이성 식민지화 및 성장에서 후보 유전자의 역할을 테스트하는 비교적 빠르고 쉬운 방법을 제공하며, 전통적인 꼬리 정맥 전이 분석보다 훨씬 더 많은 정보를 제공합니다. 이 접근법을 사용하여, 우리는 유방암 세포에 있는 PDZ 결합 모티프 (TAZ)를 가진 예 연관된 단백질 (YAP) 및 전사 공동 활성제의 동시 녹다운이 폐에 있는 감소된 전이성 부담으로 이끌어 내고 이 감소된 부담이 현저하게 손상한 전이성 식민지 및 전이성의 감소된 성장의 결과이다는 것을 보여줍니다.

상기 접근법을 입증하기 위해, 우리는 중요한 복제 인자인 RPA3가 전이성 마우스 유방 암종 세포주에서 쓰러졌던 개념 증명 실험을 수행하였다(4T122). 프로토콜은 유전자 조작 전에 루시퍼라제 및 형광 단백질로 세포를 표지하는 것을 설명하지만, RNAi 벡터는 ZsGreen(그림 2A)을제공하기 때문에 변형 된 접근 법을 사용했습니다. 먼저, 4T1 세포는 반?...

Watch this Scientific Journal Video about Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs at JoVE.co

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

기술된 접근법은 실험적인 꼬리 정맥 전이 실험과 생체 내 살아있는 동물 화상 진찰을 결합하여 폐에 있는 전이 수 그리고 크기의 정량화 이외에 유방암 전이 대형 및 성장의 실시간 감시를 허용합니다.

꼬리 정맥 전이 검사의 결합된 사용 및 생체 내 실시간 생체 내 이미징을 결합하여 폐암 전이성 식민지화 및 폐의 부담을 정량화

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

우리의 프로토콜은 전이성 식민지화 및 성장에 있는 어떤 후보 유전자든지의 역할을 빠르고 쉽게 시험하기 위하여 이용될 수 있습니다. 또한 이 프로토콜은 전이, 형성 및 성장의 실시간 모니터링뿐만 아니라 절제 또는 조직학적 얼룩없이 동일한 동물의 전이 수와 크기를 정량화할 수 있습니다. 완전한 성장 매체에서 12웰 플레이트에서 잘 150, 000 세포당 4개의 T1 세포를 플레이트.하룻밤 사이에 37도에서 5%의 이산화탄소를 배양합니다. 다음 날, 세포에서 성장 매체를 흡인. 루시파라제 바이러스 성 체신화 500 마이크로리터와 500 마이크로리터의 형광 단백질 바이러스 성 슈퍼나티를 추가하여 루시파아제와 형광 단백질 바이러스 슈퍼나티제로 세포를 동시에 감염시다.그런 다음 밀리리터 헥사디메린 브로마이드당 8밀리그램의 마이크로리터 1개를 추가하고 섭씨 37도, 이산화탄소 5%를 24~48시간 동안 배양합니다. 트립신의 500 마이크로 리터와 네 개의 T1 세포를 트립시니화. 2~5분 후, 모든 세포를 선택 매체의 4밀리리터로 6센티미터 접시에 옮기면 트립신을 담금질합니다.선택이 완료되면 감염된 4개의 T1 세포가 50~100배배배율로 역형 형광 현미경을 사용하여 ZsGreen 형광 단백질을 발현하고 있는지 확인합니다. 또한 감염된 4개의 T1 세포가 시판적으로 이용 가능한 루시파아제 활성 키트를 사용하여 루시파라제를 발현하고 있는지 확인한다. 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 생체 내 실험 설계의 최적화를 수행합니다.미디어를 흡인하고 1X PBS로 셀 플레이트를 헹구세요. 트립시니저는 15센티미터 플레이트당 5밀리리터의 트립신으로 세포를 2~5분 동안 분리하고 모든 세포를 원추형 튜브로 옮기습니다. 트립신을 담금질하기에 충분한 완전한 성장 매체로 조직 배양 접시에서 남은 세포를 씻으십시오.같은 원물 튜브에 세척을 추가합니다. 자동화된 셀 카운터를 사용하여 셀을 계산하여 총 셀 수를 결정합니다. 다음으로, 세포를 122회 G로 3분간 원심분리하고, 수퍼나티를 흡인시한다.원하는 농도에서 1X PBS에서 세포를 다시 중단한다. 여기서, 25, 000 세포는 PBS의 각 마우스 및 100 마이크로리터로 주입됩니다. 따라서 다시 중단된 세포는 밀리리터당 250, 000 세포에 있습니다.세포 현탁액을 주입 할 때까지 얼음에 보관하십시오. 동물 시설에서 후드에서 작업, 부드럽게하지만 철저하게 튜브를 반전하거나 균일하게 다시 중단되도록 1 밀리리터 주사기를 사용하여 세포를 혼합. 이제 셀 서스펜션으로 1밀리리터 루어 락 주사기를 적재하고 과도한 기포를 추방합니다.반 인치 30 게이지 바늘을 주사기에 놓고 베벨을 위로 놓고 기포를 추방합니다. 마우스를 설치류 제지제에 부드럽게 배치합니다. 측면 꼬리 정맥을 보이고 넓혀야합니다.그렇지 않은 경우 꼬리의 베이스를 부드럽게 꼬집어 따뜻한 수돗물에 꼬리를 담그고 정맥을 팽창시다. 꼬리를 청소하기 위해 알코올 닦기를 사용하여 꼬리 정맥에 바늘을 삽입하고 측면을 위로 구부리고 세포 현탁액 100 마이크로 리터를 주입하십시오. 바늘이 정맥에 제대로 삽입되면 약간 앞뒤로 쉽게 밀어야하며 플런저를 밀어 넣을 때 저항이 없어야합니다.성공적인 주사는 또한 정맥의 청색이 주입 다음 몇 초 동안 흰색으로 변하는 플러시를 초래해야합니다. 천천히 바늘을 제거하고 멸균 거즈를 사용하여 주사 부위에 압력을 가하여 출혈을 막습니다. 마우스를 케이지에 반환하고 전체 복구를 보장하기 위해 15 분 동안 모니터링하십시오.생체 내 라이브 동물 이미징 장치를 켜고 이미지 소프트웨어를 열고 로그인합니다. 초기화 버튼을 클릭하고 기기가 초기화될 때까지 기다립니다. 뷰 필드를 D.로 처음 사용하면 편집, 기본 설정, 수집 및 자동 노출을 클릭하여 노출 설정을 편집합니다.최대 노출 시간을 기본 60초에서 300초로 변경하고 확인을 클릭합니다. D-luciferin으로 1 밀리리터 주사기를 로드한 다음 주사기에 반 인치 30 게이지 바늘을 추가하고 기포를 추방합니다. 마취 된 마우스의 질량을 측정하고 기록합니다.엄지손가락과 포인터 손가락을 사용하여 목 덜미를 꼬집고 핑키 핑거와 손의 베이스 사이에 꼬리를 움켜쥐어 마우스를 억제합니다. 머리를 아래쪽을 가리키며 45도 각도로 마우스를 반전시다. 바늘을 마우스왼쪽 IP 공간에 위쪽으로 베벨 측을 삽입합니다.작은 볼륨을 다시 그려 IP 공간에 입력을 확인합니다. IP 공간에서 다시 그릴 때 바늘의 바닥에 색이 없어야합니다. 킬로그램 당 150 밀리그램의 복용량에 대 한 D-luciferin의 적절 한 볼륨을 주입.D-루시퍼린 투여 직후 타이머를 시작합니다. 마우스를 코 콘에 코가 있는 이미징 장치에 평평하게 놓고 1~2% 이소플루란이 투여되고 있는지 확인합니다. 발광 및 사진 상자를 클릭합니다.노출 시간을 자동으로 변경한 다음 획득 제어판에서 획득을 클릭합니다. 이미징 후 마우스를 케이지로 반환하고 15분 동안 모니터하여 완전한 회복을 보장합니다. 본문 프로토콜에 설명된 바와 같이 안락사를 따르는 것은 각 마우스에서 폐를 분리 및 제거하고 1X PBS에서 헹구어 과도한 혈액을 제거한다.브라이트필드의 10X에서 로브의 ZsGreen 전이 의 이미지를 획득하고 GFP 와이드 밴드 필터가 있는 형광 스테레오스코프를 사용하여 형광을 얻습니다. 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 이미지의 전이 의 크기와 수를 정량화합니다. 생체 내 라이브 동물 이미징 장치로 획득한 이미지에서 얻은 데이터를 처리하고 분석하려면 이미지 소프트웨어의 각 마우스에 대한 모든 이미지 파일을 엽니다.이미지 창 왼쪽 상단의 화살표를 클릭하고 적절한 단위로 변경하여 형광 데이터에 대한 생물 발광 데이터와 효율성을 위한 광채를 제공합니다. 도구 팔레트 창에서 ROI 도구를 먼저 클릭하여 마지막 시점의 이미지를 사용하여 관심 영역 또는 ROI를 만듭니다. 그런 다음 화살표를 클릭하고 하나를 선택하여 하나의 ROI를 삽입합니다.ROI의 테두리를 클릭하고 마우스의 가슴으로 이동합니다. ROI의 크기를 조정하여 마우스의 가슴을 덮고 신호를 제외하지 않도록 합니다. 그런 다음 ROI 측정을 클릭하고 원시 번호를 Excel 시트에 복사하거나 입력합니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 데이터를 플롯하고 분석합니다. 이미지 파일을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하여 ROI를 복사한 다음 다른 시간 지점에서 이미지 파일에 붙여 넣고 측정 ROI를 클릭합니다. YAP와 TAZ를 모두 대상으로 하는 탠덤 miR-30 계의 shRNAs를 발현하는 레트로바이러스 벡터는 4개의 T1 세포에서 YAP 및 세금 단백질 발현 및 전사 활성을 감소시킨다.4개의 T1 루시파라제 세포는 이 탠덤 YAP/TAZ shRNA 벡터 또는 통제된 miR-30 계 shRNA의 ZsGreen 표현 버전으로 안정적으로 변형되었다. 생체 발광 이미지는 YAP/TAZ 녹다운 세포로 주입된 마우스에 비해 대조구 세포로 주입된 마우스에서 전이성 부담이 증가하는 속도가 훨씬 빠르다는 것을 보여준다. 실험 과정에서 각 마우스에 대해 측정된 log10 변환된 루시파아제 신호의 플롯은 또한 YAP/TAZ 녹다운 세포로 주입된 마우스에 비해 대조군 세포로 주입된 마우스에서 속도가 더 빠르다는 것을 보여준다.수동으로 계산될 때 제어 세포를 가진 마우스에 비해 YAP/TAZ 녹다운 세포를 주입한 마우스에서 형성된 전이가 현저히 적다. 이미지 분석 소프트웨어를 사용할 때도 동일한 추세가 관찰되었습니다. 뿐만 아니라 더 많은 전이 대조군 마우스에서 형성 했다, 하지만 그들은 일반적으로 더 큰.일관되게, 폐에 있는 전이성 부담은 또한 YAP/TAZ 녹다운에 의해 급격하게 감소되었습니다. 각 마우스에 동일한 수의 건강한 세포를 성공적으로 주입하는 것은 고품질 데이터를 보장하는 데 중요합니다. 특히 바이러스가 인간전염성인 경우, 전염성 레트로바이러스 및 렌즈바이러스로 작업할 때 주의사항을 사용하고 안전 지침을 따르는 것을 기억하십시오.이 기술은 우리가 전이성 질병의 처리를 위한 새로운 치료 표적을 확인하고 시험하는 방법을 제공하는 후보 유전자 및 전이성 식민지 및 성장의 역할을 설명하는 것을 허용했습니다. 이 절차에 따라, 폐를 포함하는 전이는 변경된 유전자가 전이에 어떻게 영향을 미치는지 조사하고 관련될 수 있는 그밖 단백질을 확인하기 위하여 면역형성 또는 조직학적 얼룩에 의해 추가 분석될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis

현미경 뼈 전이의 효율적이고 선택적 모델링을위한 내부 장골 동맥 주입

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely ...

연구

암 연구학

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

공동 배양 시험 법은 아교 모세포종 침략의 대 식세포와 미세 아교 세포 자극을 공부하기

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

고급 동물의 간에서 대장 전이의 모델 : 이미징 기술 및 전이성 클론의 특성

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

기능 유전체학에게 검사를 활용하여 암 세포 회전 타원체 문화에 잠재적으로 소설 약 표적을 식별하는

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

포탈 정맥 주입 모델 간 전이 유방암의 공부를

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

폐 전이 분석 결과 사용 하 여 다리에 전이성 폐 식민지 공부에서 실용적인 고려 사항

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

하류 분자 분석 및 전이성 전위 평가를 위한 순환 종양 세포의 미세 조작

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

종양 세포의 측면 꼬리 정맥 주입 다음 폐 전이의 병리학 적 분석

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

4T1 유방암 모델에서 폐 전이의 정량화를 개선하기 위해 컴퓨터 기반 이미지 분석을 사용하여

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

Modeling Brain Metastasis Via Tail-Vein Injection of Inflammatory Breast Cancer Cells

염증성 유방암 세포의 꼬리 정맥 주입을 통한 뇌 전이 모델링

Metastatic spread to the brain is a common and devastating manifestation of many types of cancer. In the United States alone, about 200,000 patients are ...