Name: combined use of tail vein metastasis assays and real-time in vivo imaging to quantify breast cancer metastatic colonization and burden in the lungs
Uploaded: 2019-12-19T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs at JoVE.co

Vi takker Emily Norton for å bistå med virusinfeksjoner og kritisk lesning av manuskriptet. Vi takker også Ryan Kanai for hjelp med å anskaffe bilder av lungene og Kate E. Tubbesing for hjelp med bildeanalyse av den grønne metastaser i lungene. Vi takker dyret forskning anlegget ansatte for deres støtte og for å få hjelp i utarbeidelsen av denne videoen. Dette arbeidet ble støttet av en Susan G. Komen Career Catalyst Grant som tildeles J.M.L. (#CCR17477184).

Denne protokollen innebærer bruk av mus og biologisk farlige materialer og krever godkjenning fra de aktuelle institusjonelle sikkerhets komiteer. Alle de beskrevne in vivo arbeid her er godkjent av Albany Medical College institusjonelle dyr omsorg og bruk komiteen (IACUC).
Merk: for en protokoll oversikt, se skjematisk i figur 1.
1. pakking alle nødvendige retroviruses og lentiviruses
Merk: Den beskrevne pro...

Kritiske trinn i metoden Det er viktig å optimalisere antall celler injisert (trinn 3) for en gitt cellelinje og mus belastning da dette kan i stor grad påvirke antall metastaser som form og lengden på eksperimentet. Hvis for mange celler injiseres eller metastaser vokse for lenge, kan metastaser være vanskelig å telle gjør virkningene av genetisk manipulasjon vanskelig å vurdere. Men hvis for få celler injiseres, få eller ingen metastaser kan danne. Dermed bør et foreløpig eksperiment gjø...

Kreft er fortsatt den nest største dødsårsaken over hele verden1 og metastasering er ansvarlig for de fleste av disse dødsfallene2,3. Imidlertid har en begrenset forståelse av de molekylære mekanismene som regulerer metastatisk kolonisering og påfølgende vekst hindret utviklingen av effektive behandlinger for metastatisk sykdom. Identifikasjonen av romanen terapeutiske mål krever en analyse for å teste hvordan perturbed uttrykk eller funksjon av en kandidat genet påvirker metastasering dannelse og vekst. Mens autochtonous musemodeller har sine fordeler, er de tidkrevende og kostbare å generere, noe som gjør dem mer egnet for mål validering i stedet for målgjenkjenning. Transplant modellsystemer der kandidat genet er perturbed i kreftceller in vitro og deretter effekter på metastatisk potensial er vurdert i Vivo, er rimeligere og høyere gjennomstrømning enn autochtonous modeller. I tillegg, viral vektorer for stabil levering av RNAi, CRISPR/CAS9, og transgenes er allment tilgjengelig, noe som gjør det relativt enkelt å forurolige nesten alle gen eller gener av interesse i en kreftcelle linjer. Denne tilnærmingen kan også brukes til å analysen rollen som kandidat gener i metastatisk kolonisering og vekst i menneskets kreftcelle linjer ved å transplantere cellene i immunsupprimerte eller humanisert mus.
De to typer analyser brukes til å teste metastasering dannelse av transplanterte kreftceller in vivo er spontane metastasering analyser og eksperimentelle metastasering analyser. I spontane metastasering analyser4,5, er kreftceller injiseres i mus, lov til å danne en primær svulst, og deretter spontan metastasering dannelse og påfølgende vekst er analyseres. Styrken i denne modellen er at cellene må fullføre alle trinnene i metastatisk prosess for å danne metastatisk svulster. Men mange kreftcelle linjer ikke metastase effektivt i spontane metastasering modeller, og enhver manipulering av cellene som påvirker primære tumor vekst kan forvirre resultatene av metastasering analysen. Eksperimentelle metastasering analyser, der kreftceller injiseres direkte i sirkulasjon, brukes for å unngå disse fallgruvene. Vanlige eksperimentelle metastasering analyser inkluderer hale vene injeksjon6,7,8 (og demonstrert her), intrakardielle injeksjon9, og Portal vene injeksjon10.
Formålet med protokollen som presenteres her er å gi en in vivo eksperimentell metastasering analysen som gjør at en forsker til å overvåke metastasering dannelse og vekst i sanntid, samt å kvantifisere endepunktet metastasering nummer og størrelse i lungene av samme mus. For å oppnå dette, tradisjonell eksperimentell hale vene metastasering analyser6,7,8 er kombinert med levende dyr Imaging, ved hjelp av en in vivo Imaging Device9,11,12,13,14. Tumor celler stabilt uttrykker både luciferase og et fluorescerende protein injiseres i mus via lateral halen blodåre og deretter in vivo Imaging enheten brukes til å måle endringer i metastatisk byrde i lungene over tid (figur 1). Imidlertid, det inne vivo bo dyr tenkelig apparat kan ikke skjelne eller målnummeret av individ metastaser. Således, på slutten av forsøket, en fluorescerende stereomikroskopet brukes til å telle antall og måle størrelsen på fluorescerende metastaser i lungene uten behov for snitting og histologi eller immunhistokjemi (figur 1). Denne protokollen kan brukes til å teste hvordan endring av uttrykket eller funksjonen til et kandidat gen påvirker metastasering dannelse og vekst. Potensielle terapeutiske forbindelser som små molekyler eller funksjon blokkerer antistoffer kan også testes.
For å demonstrere denne tilnærmingen, vi først utførte et bevis på konseptet eksperiment der de essensielle replikering faktor, replikering protein a3 (RPA3) er slått ned i metastatisk mus brystkreftceller. Vi viser at mus injisert med RPA3 knockdown celler har betydelig mindre metastatisk byrde på hvert tidspunkt sammenlignet med mus injisert med kontroll celler. Analyse av metastasering lungene viser at denne reduserte metastatisk byrden er et resultat av betydelig redusert metastatisk kolonisering og nedsatt vekst av metastaser som dannes. For ytterligere å demonstrere denne teknikken, testet vi om samtidig slå ned Ja tilknyttet protein (YAP) og transcriptional co-aktivator med en PDZ-bindende motiv (TAZ) svekker metastatisk kolonisering eller påfølgende vekst. YAP og TAZ er to relaterte transcriptional co-aktivator som er den kritiske nedstrøms effekt Orer av Hippo Pathway. Vi15,16 og andre har innblandet YAP og Taz i metastasering (omtalt i17,18,19), noe som tyder på at disse proteinene er gode terapeutiske mål. Konsekvent, fant vi at mus injisert med YAP/TAZ knockdown celler hadde betydelig redusert metastatisk byrde. Analyse av lungene viste at YAP/TAZ knockdown celler dannet mange færre metastaser og at metastaser som gjorde form var mindre. Disse eksperimentene viser hvordan eksperimentelle metastasering analyser tillate en forsker til raskt og rimelig teste rollen som en kandidat genet i metastasering formasjon og vekst. De viser videre hvordan den kombinerte bruken av levende dyr Imaging og fluorescerende kvantifisering av metastaser i hele lungene gjør at forskeren å bedre forstå trinnene under metastatisk kolonisering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% SDS-PAGE Gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td>Trypsin for tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat bottom white assay plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3922</td>
			<td>For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol wipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For sterolizing the injection site before tail vein injecitons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/C mice (female, 6 weeks)</td>
			<td>Taconic</td>
			<td>BALB-F</td>
			<td>For tail vein metastatic colonization and burden assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA regular</td>
			<td>VWR Ameresco</td>
			<td>97061-416</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lysis buffer</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td></td>
			<td>For collecting protien samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celltreat Syringe Filters, PES 30mm, 0.45 &#956;m</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>40-229749-CS</td>
			<td>For filtering viral supernatant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 and euthanasia chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For euthanasing the mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-luciferase reporter assay kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1960</td>
			<td>For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&39;s phosphate buffered saline</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>TS1006</td>
			<td>For PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-406</td>
			<td>Used to dilute trypsin for tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS 100% US origin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97068-085</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fujifilm LAS-3000 gel imager</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td></td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH(14C10) Rabibit mAb</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2118</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP conjugate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>31460</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human embryonic kidney cells, HEK-293FT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R70007</td>
			<td>Cell line used for packging virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone DMEM/High clucose</td>
			<td>GE Healthcare life sciences</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B, Ultra Pure Grade</td>
			<td>VWR Ameresco</td>
			<td>97064-810</td>
			<td>For antibiotic selection of infected cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td></td>
			<td>For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imagej</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for image analysis of lung metastases: threshold set to 25 &#38; 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immuno-Blot PVDF Membrane</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1620177</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For mouse anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System (in vivo live animal imaging device)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>CLS136340</td>
			<td>For in vivo imaging of metastatic burden</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M205 FA &#38; Lecia DCF3000 G (GFP and bright field filters)</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Microscope and camera for visualing, counting and taking pcitures of metastases in the lungs; 10X magnifacation, 3.5 sec exposure, 1.4 gain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>L3000008</td>
			<td>For YAP/TAZ-TEAD reporter transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image 3.2 (image software program)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Software for IVIS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse breast cancer cells, 4T1</td>
			<td>Karmanos Cancer Institute</td>
			<td>Aslakson, CJ et al.,1992</td>
			<td>Mouse metastatic breast cance cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Gauge version 3.0</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td></td>
			<td>Software for quantifying western blot band intensity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM (transfection buffer)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-062</td>
			<td>For packaging virus and transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA protein assay kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td>For quantifying protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Phosphatase Inhibitor Mini Tablets</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32957</td>
			<td>Added to cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32953</td>
			<td>Added to cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene (hexadimethrine bromide)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>45-H9268</td>
			<td>For infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>45-P7255</td>
			<td>For antibiotic selection of infected cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent restrainer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For restraining mice during tail vein injeciton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE running buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAZ (V3886) Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4883</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBST buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20 automated cell counter</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>For counting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See Table 1 for complete list of vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89404-464</td>
			<td>For visualizing fluorescence in ZSGreen labeled cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western transfer buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XenoLight D-Luciferin K+ Salt</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>122799</td>
			<td>Substrate injected into mice for in vivo bioluminescent IVIS images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (lipid solution for transfection)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6365787001</td>
			<td>For packaging virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YAP (D8H1X) XP Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>14074</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combined use of tail vein metastasis assays and real-time in vivo imaging to quantify breast cancer metastatic colonization and burden in the lungs

Metastasering er den viktigste årsaken til kreft-relaterte dødsfall og det er begrensede terapeutiske alternativer for pasienter med metastatisk sykdom. Identifisering og testing av romanen terapeutiske mål som vil lette utviklingen av bedre behandlinger for metastatisk sykdom krever prekliniske in vivo-modeller. Demonstrert her er en syngeneic mus modell for assaying brystkreft metastatisk kolonisering og påfølgende vekst. Metastatisk kreftceller er stabilt transduced med viral vektorer koding Firefly luciferase og ZsGreen proteiner. Kandidat gener er så stabilt manipulert i luciferase/ZsGreen-uttrykker kreftceller og deretter cellene injiseres i mus via lateral halen venen til analysen metastatisk kolonisering og vekst. En inne vivo tenkelig apparat er så pleide mål det bioluminesens eller fluorescens av det svulst celler inne det lever dyrene å kvantifisere endre inne metastatisk lasten over tid. Uttrykket av det fluorescerende proteinet gjør at antallet og størrelsen på metastaser i lungene kan kvantifisert på slutten av eksperimentet, uten behov for snitting eller histologiske farging. Denne tilnærmingen gir en relativt rask og enkel måte å teste rollen som kandidat gener i metastatisk kolonisering og vekst, og gir mye mer informasjon enn tradisjonelle hale vene metastasering analyser. Ved hjelp av denne tilnærmingen, viser vi at samtidige knockdown av Ja assosiert protein (YAP) og transcriptional co-aktivator med en PDZ-bindende motiv (TAZ) i brystkreftceller fører til redusert metastatisk byrde i lungene og at denne reduserte byrden er et resultat av signifikant nedsatt metastatisk kolonisering og redusert vekst av metastaser.

For å demonstrere ovennevnte tilnærming, utførte vi et bevis på konseptet eksperiment der en kritisk replikering faktor, RPA3 ble slått ned i en metastatisk mus melke kreftcelle linje (4T122). Mens protokollen beskriver merking cellene med både luciferase og fluorescerende proteiner før genetisk manipulasjon, brukte vi en modifisert tilnærming fordi RNAi vektorer også levere ZsGreen (figur 2a). Først 4T1 celler var stabilt transduced med en ...

Watch this Scientific Journal Video about Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs at JoVE.co

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Det beskrevet innfallsvinkel syndikatene eksperimentelle hale vene metastasering analyser med inne vivo bo dyr tenkelig å tillate virkelig-tid avlytting av brystkreften metastasering formasjon og oppblomstringen foruten kvantifisering av metastasering antallet og størrelse inne det lungen.

Kombinert bruk av hale vene metastasering analyser og Real-Time in vivo Imaging å kvantifisere brystkreft metastatisk kolonisering og byrde i lungene

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Vår protokoll kan brukes til raskt og enkelt å teste rollen som ethvert kandidatgen i metastatisk kolonisering og vekst. Protokollen tillater også sanntidsovervåking av metastase, dannelse og vekst, samt kvantifisering av metastasenummer og størrelse hos de samme dyrene uten behov for reseksjon eller histoologisk farging. Plate fire T1 celler på 150,000 celler per brønn i en 12-brønns plate i komplett vekst media.Inkuber ved 37 grader Celsius 5% karbondioksid over natten. Neste dag, aspirere vekstmediene fra cellene. Tilsett 500 mikroliter luciferase viral supernatant og 500 mikroliter fluorescerende protein viral supernatant å samtidig infisere cellene med både luciferase og fluorescerende protein viral supernativa.Deretter legger du til en mikroliter på åtte milligram per milliliter heksametrinbromid og inkuber ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid i 24 til 48 timer. Prøv å fikse de fire T1-cellene med 500 mikroliter trypsin. Etter to til fem minutter, overføre alle cellene til en seks centimeter rett i fire milliliter av utvalgsmedier, og dermed slukke trypsin.Etter at valget er fullført, må du bekrefte at de infiserte fire T1-cellene uttrykker ZsGreen fluorescerende protein ved hjelp av et omvendt fluorescerende mikroskop ved 50 til 100 ganger forstørrelse. Bekreft også at de infiserte fire T1-cellene uttrykker luciferase ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig luciferase aktivitetssett. Fortsett å utføre optimalisering av in vivo eksperimentell design som beskrevet i tekstprotokollen.Aspirer mediet og skyll celleplatene med 1X PBS. Prøvpsinize cellene med fem milliliter trypsin per 15 centimeter plate i to til fem minutter og overføre alle cellene til et konisk rør. Vask gjenværende celler fra vevskulturfatet med nok komplette vekstmedier til å slukke trypsin.Tilsett vasken til samme koniske rør. Telle cellene ved hjelp av en automatisert celleteller for å bestemme det totale cellenummeret. Deretter sentrifuger cellene ved 122 ganger G i tre minutter, og aspirerer supernatanten.Re-suspendere cellene i 1X PBS ved ønsket konsentrasjon. Her injiseres 25 000 celler i hver mus og 100 mikroliter PBS. Så de re-suspenderte cellene er på 250.000 celler per milliliter.Hold cellesuspensjonene på is til injeksjon. Arbeide i en hette på dyreanlegget, forsiktig men grundig blande cellene ved å snu røret eller bruke en en en milliliter sprøyte for å sikre at de er jevnt suspendert. Last en en en milliliter Luer Lock sprøyte med cellefjæringen og fjern overflødige luftbobler.Plasser en halv tomme 30 gauge nål på sprøyten med skråkanten opp og utvise luftbobler. Plasser forsiktig musen i et gnagerehold. Lateral halevenen skal være synlig og utvidet.Hvis ikke, klyp forsiktig bunnen av halen og dypp halen i varmt vann fra springen for å utvide venene. Bruk en spritserviett til å rengjøre halen, sett deretter nålen inn i halevenen, skråsiden opp og injiser 100 mikroliter cellefjæring. Hvis nålen settes riktig inn i venen, bør den lett skyve litt forover og tilbake, og det bør ikke være motstand når stempelet skyves.Vellykkede injeksjoner bør også resultere i en flush der den blå fargen på venen blir hvit i noen sekunder etter injeksjonen. Fjern nålen langsomt, og bruk en steril gasbind, påfør trykk på injeksjonsstedet for å stoppe blødning. Returner musen til buret og skjermen i 15 minutter for å sikre full gjenoppretting.Slå på in vivo live dyr bildebehandling enheten, åpne bildeprogramvaren, og logg inn. Klikk initialiser-knappen og vent til maskinen initialiseres. Endre synsfeltet til D.For første gangs bruk redigerer du eksponeringsinnstillinger ved å klikke rediger, innstillinger, anskaffelse og automatisk eksponering.Endre maksimal eksponeringstid fra standard 60 sekunder til 300 sekunder, og klikk ok. Legg en en milliliter sprøyte med D-luciferin, og tilsett deretter en halv tomme 30 gauge nål til sprøyten og utvise luftbobler. Mål og registrer massen av en bedøvet mus.Hold musen ved å klemme scruff av nakken ved hjelp av tommelen og pekefingrene og gripe halen mellom pinky fingeren og bunnen av hånden. Inverter musen i en 45 graders vinkel med hodet pekende nedover. Sett nålen, skråsiden opp, inn i musens venstre side IP-plass.Bekreft inntreden i IP-rommet ved å trekke tilbake et lite volum. Det bør ikke være farge på bunnen av nålen når du tegner tilbake i IP-rommet. Injiser riktig volum av D-luciferin for en dose på 150 milligram per kilo.Umiddelbart etter administrering av D-luciferin, start en timer. Plasser musen flatt på ryggen i bildeenheten med nesen i nesekjeglen, og sørg for at den ene halvdelen til to og en halv prosent isofluran administreres. Klikk på selvlysende og fotografiske bokser.Endre eksponeringstiden til automatisk, og klikk deretter hent i kontrollpanelet for anskaffelse. Etter avbildning, returnere musen til buret og overvåke i 15 minutter for å sikre full gjenoppretting. Etter eutanasi, som beskrevet i tekstprotokollen, isolere og fjerne lungene fra hver mus og skylle i 1X PBS for å fjerne overflødig blod.Få bilder av ZsGreen metastaser i flikene på 10X i Brightfield og fluorescens ved hjelp av et fluorescerende stereoskop med et GFP-bredbåndfilter. Bruk bildeanalyseprogramvare til å kvantifisere størrelsen og antall metastaser fra bildene. For å behandle og analysere dataene fra bildene som er anskaffet med in vivo live animal imaging-enheten, åpne alle bildefiler for hver mus i bildeprogramvaren.Kontroller at enhetene er i utstråling for bioluminescerende data og effektivitet for fluorescerende data ved å klikke pilen øverst til venstre i bildevinduet og endre den til riktig enhet. Bruk bildet fra forrige gangs punkt til å opprette et interesseområde, eller avkastning, ved først å klikke på roi-verktøy i verktøypalettvinduet. Deretter setter du inn en avkastning ved å klikke på pilen og velge en.Klikk kantlinjen på avkastningen og flytt den over til brystet på musen. Juster størrelsen på avkastningen slik at den dekker brystet på musen og utelukker ikke signal. Klikk deretter måle ROIer og kopiere eller skrive inn rånummeret i et Excel-ark.Plott inn og analyser dataene som beskrevet i tekstprotokollen. Høyreklikk i bildefilen for å kopiere avkastningen, og lim den deretter inn i bildefiler fra de andre tidspunktene og klikk mål ROM. Retroviral vektor som uttrykker tandem miR-30-baserte shRNAs rettet mot både YAP og TAZ reduserer YAP og skatteproteinuttrykk og transkripsjonsaktivitet i fire T1-celler.Fire T1 luciferase celler ble stabilt transdusert med en ZsGreen uttrykker versjon av denne tandem YAP / TAZ shRNA vektor eller en kontrollert miR-30-basert shRNA. Bioluminescerende bilder viser at hastigheten som metastatisk byrde økte var signifikant raskere hos musene injisert med kontrollceller sammenlignet med musene injisert med YAP / TAZ knockdown celler. Et plott av log10 forvandlet luciferase signal målt for hver mus i løpet av eksperimentet viser også at hastigheten var raskere i musene injisert med kontrollcellene sammenlignet med musene injisert med YAP / TAZ knockdown celler.Signifikant færre metastaser dannet hos musene injisert med YAP/TAZ knockdown-cellene sammenlignet med mus med kontrollceller når de telles manuelt. Den samme trenden ble observert ved bruk av bildeanalyseprogramvaren. Ikke bare dannet mange flere metastaser i kontrollmusene, men de var generelt større.Konsekvent ble den metastatiske byrden i lungene også drastisk redusert ved YAP/TAZ-knockdown. Vellykket injeksjon av like mange friske celler i hver mus er avgjørende for å sikre data av høy kvalitet. Husk å være forsiktig og følg sikkerhetsretningslinjer når du arbeider med smittsomme retrovirus og lentivirus, spesielt hvis virusene er menneskelige smittsomme.Denne teknikken har gjort det mulig for oss å illustrere rollene til kandidatgener og metastatisk kolonisering og vekst, noe som gir en måte å identifisere og teste nye terapeutiske mål for behandling av metastatisk sykdom. Etter denne prosedyren kan metastaser som inneholder lunger analyseres ytterligere ved immunofluorescent eller histologisk farging for å undersøke hvordan det endrede genet påvirker metastaser og identifisere andre proteiner som kan være involvert.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis

Intra-iliaca Injection for effektiv og selektiv Modellering av Mikroskopisk Bone Metastase

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely ...

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Coculture Analyser å studere macrophage og Microglia Stimulering av Glioblastoma Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

Avansert dyremodell av tykktarmsmetastaser i leveren: Imaging teknikker og egenskaper av metastatisk Clones

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Utnytte Funksjonell genom Screening for å identifisere potensielt Novel narkotika mål i Cancer Cell spheroid kulturer

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

En Portal Vein Injection modell for å studere levermetastaser fra brystkreft

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

Praktiske hensyn i å studere metastatisk lungekreft kolonisering i Osteosarcoma bruker lunge metastasering analysen

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Mikromanipulering av sirkulerende tumor celler for nedstrøms molekylær analyse og metastatisk potensiell vurdering

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Patologisk analyse av lungemetastase etter lateral hale-vene injeksjon av tumorceller

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

Bruke databasert bildeanalyse for å forbedre kvantifiseringen av lungemetastase i 4T1 brystkreftmodell

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

Modeling Brain Metastasis Via Tail-Vein Injection of Inflammatory Breast Cancer Cells

Modellering av hjernemetastase via hale-vene-injeksjon av inflammatoriske brystkreftceller

Metastatic spread to the brain is a common and devastating manifestation of many types of cancer. In the United States alone, about 200,000 patients are ...