Name: combined use of tail vein metastasis assays and real-time in vivo imaging to quantify breast cancer metastatic colonization and burden in the lungs
Uploaded: 2019-12-19T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs at JoVE.co

Agradecemos emily norton para ajudar com infecções virais e leitura crítica do manuscrito. Agradecemos também Ryan Kanai para ajudar a adquirir imagens dos pulmões e Kate E. Tubbesing para ajudar com a análise de imagem das metástases verdes nos pulmões. Agradecemos ao pessoal do centro de investigação animal pelo seu apoio e pela assistência na preparação deste vídeo. Este trabalho foi apoiado por uma Susan G. Komen Career Catalyst Grant que concedeu a J.M.L. (#CCR17477184).

Este protocolo envolve o uso de camundongos e materiais bioperigosos e requer a aprovação dos comitês de segurança institucional apropriados. Todo o trabalho in vivo descrito aqui é aprovado pelo comitê institucional de cuidados e uso de animais da Albany Medical College (IACUC).
NOTA: Para uma visão geral do protocolo, veja esquema na Figura 1.
1. Empacotando todos os retrovírus e lentivírus necessários
<p class="jove_conte...

Etapas críticas do método É fundamental otimizar o número de células injetadas (passo 3) para uma determinada linha celular e tensão do mouse, pois isso pode influenciar muito o número de metástases que se formam e a duração do experimento. Se muitas células são injetadas ou as metástases crescem por muito tempo, as metástases podem ser difíceis de contar tornando os efeitos da manipulação genética difíceis de avaliar. No entanto, se muito poucas células são injetadas, poucas ou n...

O câncer continua a ser a segunda principal causa de morte em todo o mundo1 e metástase é responsável pela maioria dessas mortes2,3. No entanto, uma compreensão limitada dos mecanismos moleculares que regem a colonização metastática e o crescimento subsequente tem dificultado o desenvolvimento de tratamentos eficazes para a doença metastática. A identificação de novos alvos terapêuticos requer um ensaio para testar como a expressão ou função perturbada de um gene candidato influencia a formação e o crescimento da metástase. Embora os modelos de mouse autrátecos tenham suas vantagens, eles são demorados e caros de gerar, tornando-os mais adequados para a validação de destino em vez de descoberta de destino. Os sistemas de modelos de transplante em que o gene candidato é perturbado nas células cancerosas in vitro e, em seguida, os efeitos sobre o potencial metastático são avaliados in vivo, são menos caros e de maior rendimento do que os modelos autótos. Além disso, os vetores virais para entrega estável de RNAi, CRISPR/CAS9 e transgenes estão amplamente disponíveis, tornando relativamente fácil perturbar praticamente qualquer gene ou genes de interesse em linhas de células cancerosas. Esta abordagem também pode ser usada para analisar o papel dos genes candidatos na colonização metastática e crescimento em linhas de células cancerosas humanas, transplantando as células em camundongos imunocomprometidos ou humanizados.
Os dois tipos de ensaios utilizados para testar a formação da metástase por células cancerosas transplantadas in vivo são ensaios de metástase espontânea e ensaios de metástase experimental. Em ensaios metástase espontânea4,5, as células cancerosas são injetadas em camundongos, autorizados a formar um tumor primário, e, em seguida, a formação metástase espontânea e crescimento subseqüente são ensaios. A força deste modelo é que as células devem completar todas as etapas do processo metastático, a fim de formar tumores metastáticos. No entanto, muitas linhas de células cancerosas não metástase eficientemente em modelos de metástase espontânea, e qualquer manipulação das células que impacta o crescimento do tumor primário pode confundir os resultados do ensaio metástase. Ensaios experimentais de metástase, em que as células cancerosas são injetadas diretamente em circulação, são usados para evitar essas armadilhas. Os ensaios experimentais comuns da metástase incluem a injeção da veia da cauda6,7,8 (e demonstrado aqui), injeção intracardiac9,e injeção da veia do portal10.
O objetivo do protocolo apresentado aqui é fornecer um ensaio de metástase experimental in vivo que permita que um pesquisador monitore a formação e o crescimento da metástase em tempo real, bem como quantificar o número e o tamanho da metástase do ponto final nos pulmões do mesmo rato. Para isso, a tradicional metástase experimental da veia da cauda conta6,7,8 são combinadas com imagens de animais vivos, utilizando um dispositivo de imagem in vivo9,11,12,13,14. As células tumorais expressando de forma evigorada tanto a luciferase quanto uma proteína fluorescente são injetadas em camundongos através da veia lateral da cauda e, em seguida, o dispositivo de imagem in vivo é usado para medir mudanças na carga metastática nos pulmões ao longo do tempo (Figura 1). No entanto, o dispositivo de imagem animal vivo in vivo não pode distinguir ou medir o tamanho das metástases individuais. Assim, no final do experimento, um estreoscópio fluorescente é usado para contar o número e medir o tamanho das metástases fluorescentes nos pulmões sem a necessidade de secção e histologia ou imunohistoquímica (Figura 1). Este protocolo pode ser usado para testar como alterar a expressão ou função de um gene candidato influencia a formação e o crescimento da metástase. Potenciais compostos terapêuticos, como pequenas moléculas ou anticorpos de bloqueio de função também podem ser testados.
Para demonstrar essa abordagem, primeiro realizamos um experimento de prova de conceito no qual o fator essencial de replicação, a proteína de replicação A3 (RPA3) é derrubado em células metastáticas de câncer de mama de camundongos. Nós mostramos que os ratos injetados com células rpa3 knockdown têm significativamente menos carga metastática em cada ponto de tempo em comparação com ratos injetados com células de controle. A análise dos pulmões contendo metástasidade mostra que essa redução da carga metastática é o resultado de uma colonização metastática significativamente reduzida e crescimento prejudicado das metástases que se formam. Para demonstrar ainda mais essa técnica, testamos se a queda sim da proteína associada sim (YAP) e co-ativador transcricional com um motivo de ligação pdz (TAZ) prejudica a colonização metastática ou o crescimento subsequente. YAP e TAZ são dois co-ativadores transcricionais relacionados que são os efetores críticos a jusante do Caminho do Hipopótamo. Nós15,16 e outros implicamos YAP e TAZ na metástase (revista em17,18,19), sugerindo que essas proteínas são bons alvos terapêuticos. Consistentemente, nós encontramos que os ratos injetados com pilhas do knockdown de YAP/TAZ tinham reduzido significativamente a carga metastática. A análise dos pulmões mostrou que as células knockdown YAP/TAZ formaram muito menos metástases e que as metástases que se formaram eram menores. Esses experimentos demonstram como os ensaios de metástase experimental permitem que um pesquisador teste rapidamente e barata o papel de um gene candidato na formação e crescimento da metástase. Eles mostram ainda como o uso combinado de imagens de animais vivos e quantificação fluorescente de metástases em pulmões inteiros permite ao pesquisador entender melhor os passos durante a colonização metastática.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% SDS-PAGE Gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td>Trypsin for tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat bottom white assay plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3922</td>
			<td>For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol wipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For sterolizing the injection site before tail vein injecitons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/C mice (female, 6 weeks)</td>
			<td>Taconic</td>
			<td>BALB-F</td>
			<td>For tail vein metastatic colonization and burden assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA regular</td>
			<td>VWR Ameresco</td>
			<td>97061-416</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lysis buffer</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td></td>
			<td>For collecting protien samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celltreat Syringe Filters, PES 30mm, 0.45 &#956;m</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>40-229749-CS</td>
			<td>For filtering viral supernatant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 and euthanasia chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For euthanasing the mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-luciferase reporter assay kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1960</td>
			<td>For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&39;s phosphate buffered saline</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>TS1006</td>
			<td>For PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-406</td>
			<td>Used to dilute trypsin for tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS 100% US origin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97068-085</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fujifilm LAS-3000 gel imager</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td></td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH(14C10) Rabibit mAb</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2118</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP conjugate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>31460</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human embryonic kidney cells, HEK-293FT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R70007</td>
			<td>Cell line used for packging virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone DMEM/High clucose</td>
			<td>GE Healthcare life sciences</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B, Ultra Pure Grade</td>
			<td>VWR Ameresco</td>
			<td>97064-810</td>
			<td>For antibiotic selection of infected cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td></td>
			<td>For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imagej</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for image analysis of lung metastases: threshold set to 25 &#38; 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immuno-Blot PVDF Membrane</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1620177</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For mouse anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System (in vivo live animal imaging device)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>CLS136340</td>
			<td>For in vivo imaging of metastatic burden</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M205 FA &#38; Lecia DCF3000 G (GFP and bright field filters)</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Microscope and camera for visualing, counting and taking pcitures of metastases in the lungs; 10X magnifacation, 3.5 sec exposure, 1.4 gain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>L3000008</td>
			<td>For YAP/TAZ-TEAD reporter transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image 3.2 (image software program)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Software for IVIS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse breast cancer cells, 4T1</td>
			<td>Karmanos Cancer Institute</td>
			<td>Aslakson, CJ et al.,1992</td>
			<td>Mouse metastatic breast cance cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Gauge version 3.0</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td></td>
			<td>Software for quantifying western blot band intensity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM (transfection buffer)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-062</td>
			<td>For packaging virus and transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA protein assay kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td>For quantifying protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Phosphatase Inhibitor Mini Tablets</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32957</td>
			<td>Added to cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32953</td>
			<td>Added to cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene (hexadimethrine bromide)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>45-H9268</td>
			<td>For infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>45-P7255</td>
			<td>For antibiotic selection of infected cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent restrainer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For restraining mice during tail vein injeciton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE running buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAZ (V3886) Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4883</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBST buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20 automated cell counter</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>For counting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See Table 1 for complete list of vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89404-464</td>
			<td>For visualizing fluorescence in ZSGreen labeled cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western transfer buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XenoLight D-Luciferin K+ Salt</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>122799</td>
			<td>Substrate injected into mice for in vivo bioluminescent IVIS images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (lipid solution for transfection)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6365787001</td>
			<td>For packaging virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YAP (D8H1X) XP Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>14074</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combined use of tail vein metastasis assays and real-time in vivo imaging to quantify breast cancer metastatic colonization and burden in the lungs

A metástase é a principal causa de mortes relacionadas ao câncer e há opções terapêuticas limitadas para pacientes com doença metastática. A identificação e o teste de novos alvos terapêuticos que facilitarão o desenvolvimento de melhores tratamentos para doençametastática requer modelos in vivo pré-clínicos. Demonstrado aqui é um modelo de camundongo singênico para atribuir câncer de mama colonização metastática e crescimento subseqüente. As células cancerosas metastáticas são transinduzidas de forma estrutumsónte com vetores virais codificando protecções de vaga-lume e ZsGreen. Os genes candidatos são então manipulados de forma evigorada em células cancerosas lúciferase/ZsGreen e, em seguida, as células são injetadas em camundongos através da veia lateral da cauda para analisar a colonização e o crescimento metastáticos. Um dispositivo de imagem in vivo é então usado para medir a bioluminescência ou fluorescência das células tumorais nos animais vivos para quantificar as mudanças na carga metastática ao longo do tempo. A expressão da proteína fluorescente permite que o número e o tamanho das metástases nos pulmões sejam quantificados no final do experimento sem a necessidade de secção ou coloração histológica. Esta abordagem oferece uma maneira relativamente rápida e fácil de testar o papel dos genes candidatos na colonização metastática e crescimento, e fornece muito mais informações do que os ensaios tradicionais de metástase da veia da cauda. Usando essa abordagem, mostramos que o knockdown sim da proteína associada sim (YAP) e co-ativador transcricional com um motivo de ligação pdz (TAZ) em células de câncer de mama leva à redução da carga metastática nos pulmões e que esta carga reduzida é o resultado de colonização metastática significativamente prejudicada e crescimento reduzido de metástases.

Para demonstrar a abordagem acima, realizamos um experimento de prova de conceito no qual um fator crítico de replicação, o RPA3 foi derrubado em uma linha de células carcinoma mamária samária do camundongo metastático (4T122). Enquanto o protocolo descreve a rotulagem das células com proteínas luciferase e fluorescentes antes da manipulação genética, usamos uma abordagem modificada porque os vetores RNAi também entregam ZsGreen (Figura 2A).</stro...

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Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

A abordagem descrita combina ensaios experimentais de metástase da veia da cauda com imagens de animais vivos in vivo in vivo para permitir o monitoramento em tempo real da formação e crescimento da metástase do câncer de mama, além da quantificação do número e tamanho da metástase nos pulmões.

Uso combinado de ensaios de metástase de veia de cauda e imagens in vivo em tempo real para quantificar a colonização metastática do câncer de mama e carga nos pulmões

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Nosso protocolo pode ser usado para testar rapidamente e facilmente o papel de qualquer gene candidato na colonização e crescimento metastático. O protocolo também permite o monitoramento em tempo real de metástase, formação e crescimento, bem como quantificação do número e tamanho da metástase nos mesmos animais sem a necessidade de ressecção ou coloração histológica. Placa quatro células T1 a 150.000 células por poço em uma placa de 12 poços em mídia de crescimento completo.Incubar a 37 graus Celsius 5% de dióxido de carbono durante a noite. No dia seguinte, aspire a mídia de crescimento das células. Adicione 500 microliters de supernanato viral luciferase e 500 microliters de proteína fluorescente supernante viral para infectar simultaneamente as células com as supernantes virais luciferase e proteína fluorescente.Em seguida, adicione um microliter de oito miligramas por brometo de hexadimetrina mililitro e incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 24 a 48 horas. Tentepsinizar as quatro células T1 com 500 microliters de trippsina. Depois de dois a cinco minutos, transfira todas as células para um prato de seis centímetros em quatro mililitros de mídia de seleção, assim saciando a trippsina.Após a seleção ser concluída, confirme que as quatro células T1 infectadas estão expressando proteína fluorescente ZsGreen usando um microscópio fluorescente invertido a 50 a 100 vezes a ampliação. Confirme também que as quatro células T1 infectadas estão expressando luciferase usando um kit de atividade luciferase disponível comercialmente. Prossiga para realizar a otimização do projeto experimental in vivo, conforme descrito no protocolo de texto.Aspire a mídia e enxágue as placas celulares com 1X PBS. Tentepsinizar as células com cinco mililitros de trippsina por placa de 15 centímetros por dois a cinco minutos e transferir todas as células para um tubo cônico. Lave as células remanescentes do prato de cultura tecidual com mídia de crescimento completa suficiente para saciar a trippsina.Adicione a lavagem ao mesmo tubo cônico. Conte as células usando um contador automático de células para determinar o número total da célula. Em seguida, centrifugar as células a 122 vezes G por três minutos, e aspirar o supernante.Suspenda-as des suspendidas as células em 1X PBS na concentração desejada. Aqui, 25.000 células são injetadas em cada rato e 100 microliters de PBS. Então as células re-suspensas estão em 250.000 células por mililitro.Mantenha as suspensões das células no gelo até a injeção. Trabalhando em um capuz na instalação animal, misture suavemente, mas cuidadosamente as células, invertendo o tubo ou usando uma seringa de um mililitro para garantir que elas sejam suspensas uniformemente. Agora, carregue uma seringa Luer Lock de um mililitro com a suspensão da célula e expulse bolhas de ar em excesso.Coloque uma agulha de calibre 30 de meia polegada na seringa com o bisel para cima e expulse bolhas de ar. Coloque suavemente o mouse em um cabador de roedores. A veia lateral da cauda deve ser visível e dilatada.Se não, aperte suavemente a base da cauda e mergulhe a cauda em água morna da torneira para dilatar as veias. Use uma limpeza de álcool para limpar a cauda, depois insira a agulha na veia da cauda, lado de bisel para cima e injete 100 microliters de suspensão celular. Se a agulha for inserida corretamente na veia, ela deve facilmente deslizar ligeiramente para frente e para trás, e não deve haver resistência quando o êmbolo é empurrado.Injeções bem sucedidas também devem resultar em uma descarga na qual a cor azul da veia fica branca por alguns segundos após a injeção. Remova lentamente a agulha e, usando uma gaze estéril, aplique pressão no local da injeção para parar qualquer sangramento. Volte o mouse para sua gaiola e monitore por 15 minutos para garantir a recuperação completa.Ligue o dispositivo de imagem animal in vivo vivo, abra o software de imagem e faça login. Clique no botão inicializar e aguarde a inicialização da máquina. Altere o campo de exibição para D.Para uso pela primeira vez, edite as configurações de exposição clicando em editar, preferências, aquisição e exposição automática.Altere o tempo máximo de exposição do padrão de 60 segundos para 300 segundos e clique em ok. Carregue uma seringa de um mililitro com D-luciferin, depois adicione uma agulha de calibre 30 de meia polegada à seringa e expulse bolhas de ar. Meça e regise a massa de um rato anestesiado.Contenha o rato beliscando o pescoço usando os dedos do polegar e do ponteiro e segurando a cauda entre o dedo mindinho e a base da mão. Inverta o mouse em um ângulo de 45 graus com a cabeça apontando para baixo. Insira a agulha, lado bisbigo para cima, no espaço IP do lado esquerdo do mouse.Confirme a entrada no espaço IP retirando um pequeno volume. Não deve haver cor na base da agulha ao desenhar de volta no espaço IP. Injete o volume apropriado de D-luciferina para uma dose de 150 miligramas por quilograma.Imediatamente após a administração de D-luciferina, inicie um temporizador. Coloque o mouse de costas no dispositivo de imagem com o nariz no cone do nariz, e certifique-se de que uma meia a duas por cento de isoflurane está sendo administrada. Clique nas caixas luminescentes e fotográficas.Altere o tempo de exposição para auto e clique em adquirir no painel de controle de aquisição. Após a imagem, devolva o mouse à gaiola e monitore por 15 minutos para garantir a recuperação completa. Seguindo a eutanásia, como descrito no protocolo de texto, isole e remova os pulmões de cada rato e enxágue em 1X PBS para remover o excesso de sangue.Adquira imagens de metástases ZsGreen nos lóbulos em 10X em Brightfield e fluorescência usando um estereoscópio fluorescente com um filtro de banda larga GFP. Use o software de análise de imagens para quantificar o tamanho e o número de metástases das imagens. Para processar e analisar os dados das imagens adquiridas com o dispositivo de imagem animal in vivo vivo, abra todos os arquivos de imagem para cada mouse no software de imagem.Certifique-se de que as unidades estão em brilho para dados bioluminescentes e eficiência para dados fluorescentes clicando na seta no canto superior esquerdo da janela de imagem e alterando-as para a unidade apropriada. Use a imagem do ponto de última vez para criar uma região de interesse, ou ROI, clicando primeiro em ferramentas de ROI na janela da paleta de ferramentas. Em seguida, insira um ROI clicando na seta e selecionando um.Clique na borda do ROI e mova-o para o peito do mouse. Ajuste o tamanho do ROI para que cubra o baú do mouse e não exclua o sinal. Em seguida, clique em medir ROIs e copiar ou digitar o número bruto em uma folha do Excel.Plote e analise os dados conforme descrito no protocolo de texto. Clique com o botão direito do mouse no arquivo de imagem para copiar o ROI e, em seguida, cole-o em arquivos de imagem dos outros pontos de tempo e clique em medir ROIs. O vetor retroviral que expressa shRNAs baseados em tandem miR-30, visando tanto YAP quanto TAZ, reduz a expressão de proteína fiscal e a atividade transcricional em quatro células T1.Quatro células de luciferase T1 foram transduzidas com uma versão expressa ZsGreen deste vetor de shRNA YAP/TAZ ou um shRNA controlado com base em miR-30. Imagens bioluminescentes mostram que a taxa em que a carga metastática aumentou foi significativamente mais rápida nos camundongos injetados com células de controle em comparação com os camundongos injetados com células de knockdown YAP/TAZ. Um gráfico do sinal de luciferase transformado log10 medido para cada rato ao longo do experimento também mostra que a taxa foi mais rápida nos camundongos injetados com as células de controle em comparação com os camundongos injetados com células de knockdown YAP/TAZ.Significativamente menos metástases formadas nos camundongos injetados com as células de knockdown YAP/TAZ em comparação com camundongos com células de controle quando contados manualmente. A mesma tendência foi observada ao utilizar o software de análise de imagens. Não só muitas mais metástases se formaram nos ratos de controle, mas eles eram geralmente maiores.Consistentemente, a carga metastática nos pulmões também foi drasticamente reduzida pelo knockdown YAP/TAZ. A injeção bem sucedida de números iguais de células saudáveis em cada camundongo é fundamental para garantir dados de alta qualidade. Lembre-se de ter cuidado e seguir as diretrizes de segurança ao trabalhar com retrovírus e lentivírus infecciosos, especialmente se os vírus forem infecciosos humanos.Essa técnica nos permitiu ilustrar os papéis dos genes candidatos e da colonização e crescimento metastáticos, fornecendo uma maneira de identificar e testar novos alvos terapêuticos para o tratamento da doença metastática. Após este procedimento, metástases contendo pulmões podem ser ainda mais analisadas por manchas imunofluorescentes ou histológicas para investigar como o gene alterado está influenciando metástases e identificar outras proteínas que podem estar envolvidas.

Research

JoVE Journal

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Usando análise de imagem baseada em computador para melhorar a quantificação da metástase pulmonar no modelo de câncer de mama 4T1

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Modelando Metástase Cerebral Via Injeção Venosa Caudal de Células Inflamatórias de Câncer de Mama

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