Name: combined use of tail vein metastasis assays and real-time in vivo imaging to quantify breast cancer metastatic colonization and burden in the lungs
Uploaded: 2019-12-19T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs at JoVE.co

Мы благодарим Эмили Нортон за помощь в борьбе с вирусными инфекциями и критическое чтение рукописи. Мы также благодарим Райана Канаи за помощь в получении изображений легких и Кейт Э. Таббесинг за помощь в анализе изображений зеленых метастазов в легких. Мы благодарим сотрудников научно-исследовательского центра по животноводству за поддержку и помощь в подготовке этого видео. Эта работа была поддержана Сьюзен Г. Komen Карьера Катализатор Грант, который присудил JML (#CCR17477184).

Этот протокол предусматривает использование мышей и биоопасных материалов и требует одобрения соответствующих институциональных комитетов по безопасности. Все описанные работы in vivo здесь одобрены Олбани медицинский колледж институционального ухода за животными и использования ко?...

Критические шаги метода Очень важно оптимизировать количество впрыскиваемых клеток (шаг 3) для данной клеточной линии и деформации мыши, поскольку это может значительно повлиять на количество метастаз, которые образуются, и продолжительность эксперимента. Если слишком мног...

Рак остается второй ведущей причиной смерти во всем мире1 и метастаз является причиной большинства из этих смертей2,3. Однако ограниченное понимание молекулярных механизмов, регулирующих метастатическую колонизацию и последующий рост, препятствует разработке эффективных методов лечения метастатических заболеваний. Идентификация новых терапевтических целей требует анализа, чтобы проверить, как возмущенное выражение или функция гена кандидата влияет на формирование метастаз и рост метастаза. В то время как автохтонусные модели мыши имеют свои преимущества, они отнимают много времени и дорого генерировать, что делает их более подходящими для целевой проверки, а не целевого обнаружения. Системы модели трансплантации, в которых ген кандидата возмущен в раковых клетках in vitro, а затем воздействие на метастатический потенциал оцениваются in vivo, являются менее дорогостоящими и более высокой пропускной способностью, чем автохтоновые модели. Кроме того, вирусные векторы для стабильной доставки РНК, CRISPR/CAS9 и трансгенов широко доступны, что делает его относительно легко возмущать практически любой ген или гены, представляющие интерес в раковых клеток линий. Этот подход также может быть использован для оценки роли генов-кандидатов в метастатической колонизации и росте раковых клеток человека путем пересадки клеток на ослабленных иммунитетом или гуманизированных мышей.
Два типа анализов, используемых для проверки образования метастазов пересаженные раковые клетки in vivo являются спонтанными метастазами анализы и экспериментальные метастазовые анализы. При спонтанных метастазах анализы4,5, раковые клетки вводятся в мышей, позволило сформировать первичную опухоль, а затем спонтанное образование метастазов и последующего роста анализируются. Сила этой модели заключается в том, что клетки должны завершить все этапы метастатического процесса, чтобы сформировать метастатические опухоли. Тем не менее, многие линии раковых клеток не метастазируют эффективно в спонтанных моделях метастаз, и любые манипуляции клеток, которые влияют на первичный рост опухоли может смутить результаты метастазировать анализ. Экспериментальные метастазные анализы, в которых раковые клетки вводятся непосредственно в обращение, используются, чтобы избежать этих ловушек. Общие экспериментальные метастазовые анализы включают инъекции хвостовойвены 6,7,8 (и продемонстрировали здесь), интракардиальная инъекция9,и портальная инъекциявены 10.
Цель протокола, представленного здесь, заключается в том, чтобы обеспечить экспериментальный метастазный ассса in vivo, который позволяет исследователю отслеживать образование метастазов и рост в режиме реального времени, а также количественно определить количество метастазов и размер ы в легких одной и той же мыши. Для достижения этой цели, традиционные экспериментальные метастазовые хвостовые вены анализы6,7,8 сочетаются с живой изображения животных, используя in vivo изображений устройства9,11,12,13,14. Опухолевые клетки, устойчиво выражающие как люциферазу, так и флуоресцентный белок, вводятся мышам через боковую хвостовую вену, а затем устройство in vivo imaging используется для измерения изменений метастатического бремени в легких с течением времени(рисунок 1). Тем не менее, устройство in vivo live animal image не может различать или измерять размер отдельных метастазов. Таким образом, в конце эксперимента, флуоресцентный стереомикроскоп используется для подсчета числа и измерения размера флуоресцентных метастаз в легких без необходимости секционирования и гистологии или иммуногистохимии (Рисунок 1). Этот протокол может быть использован для проверки того, как изменение экспрессии или функции гена кандидата влияет на формирование метастазирования и рост. Потенциальные терапевтические соединения, такие как небольшие молекулы или функции блокирующие антитела также могут быть проверены.
Чтобы продемонстрировать этот подход, мы впервые выполнили доказательство концептуального эксперимента, в котором основной фактор репликации, репликации белка A3 (RPA3) сбит в метастатических клеток рака молочной железы мыши. Мы показываем, что мыши, вводимые клетками RPA3, имеют значительно меньше метастатического бремени в каждый момент времени по сравнению с мышами, вводимыми контрольными клетками. Анализ метастазов, содержащих легкие, показывает, что это снижение метастатического бремени является результатом значительного снижения метастатического колонизации и нарушения роста метастазов, которые образуются. Чтобы еще больше продемонстрировать этот метод, мы проверили ли одновременно сбить Да связанных белка (YAP) и транскрипционного со-активатора с PD - связывающий мотив (ТАЗ) ухудшает метастатическую колонизацию или последующий рост. YAP и ТАЗ являются двумя связанными транскрипционными со-активаторами, которые являются критическими эффекторами вниз по течению Пути Гиппо. Мы15,16 и другие причастны YAP и ТАЗ в метастазирование (рассмотрено в17,18,19), предполагая, что эти белки являются хорошими терапевтическими целями. Последовательно, мы обнаружили, что мыши, введенные с YAP / TA ' нокдаун клетки значительно снизили метастатическое бремя. Анализ легких показал, что клетки яп/ТАЗ образуют гораздо меньше метастазов и что метастазовые метастаза, которые действительно образуются, были меньше. Эти эксперименты демонстрируют, как экспериментальные метастазные анализы позволяют исследователю быстро и недорого проверить роль гена-кандидата в формировании метастазов и росте. Они также показывают, как комбинированное использование живой визуализации животных и флуоресцентная количественная оценка метастазов в целых легких позволяет исследователю лучше понять шаги во время метастатичной колонизации.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% SDS-PAGE Gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td>Trypsin for tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat bottom white assay plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3922</td>
			<td>For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol wipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For sterolizing the injection site before tail vein injecitons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/C mice (female, 6 weeks)</td>
			<td>Taconic</td>
			<td>BALB-F</td>
			<td>For tail vein metastatic colonization and burden assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA regular</td>
			<td>VWR Ameresco</td>
			<td>97061-416</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lysis buffer</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td></td>
			<td>For collecting protien samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celltreat Syringe Filters, PES 30mm, 0.45 &#956;m</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>40-229749-CS</td>
			<td>For filtering viral supernatant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 and euthanasia chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For euthanasing the mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-luciferase reporter assay kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1960</td>
			<td>For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&39;s phosphate buffered saline</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>TS1006</td>
			<td>For PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-406</td>
			<td>Used to dilute trypsin for tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS 100% US origin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97068-085</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fujifilm LAS-3000 gel imager</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td></td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH(14C10) Rabibit mAb</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2118</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP conjugate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>31460</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human embryonic kidney cells, HEK-293FT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R70007</td>
			<td>Cell line used for packging virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone DMEM/High clucose</td>
			<td>GE Healthcare life sciences</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B, Ultra Pure Grade</td>
			<td>VWR Ameresco</td>
			<td>97064-810</td>
			<td>For antibiotic selection of infected cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td></td>
			<td>For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imagej</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for image analysis of lung metastases: threshold set to 25 &#38; 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immuno-Blot PVDF Membrane</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1620177</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For mouse anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System (in vivo live animal imaging device)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>CLS136340</td>
			<td>For in vivo imaging of metastatic burden</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M205 FA &#38; Lecia DCF3000 G (GFP and bright field filters)</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Microscope and camera for visualing, counting and taking pcitures of metastases in the lungs; 10X magnifacation, 3.5 sec exposure, 1.4 gain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>L3000008</td>
			<td>For YAP/TAZ-TEAD reporter transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image 3.2 (image software program)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Software for IVIS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse breast cancer cells, 4T1</td>
			<td>Karmanos Cancer Institute</td>
			<td>Aslakson, CJ et al.,1992</td>
			<td>Mouse metastatic breast cance cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Gauge version 3.0</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td></td>
			<td>Software for quantifying western blot band intensity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM (transfection buffer)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-062</td>
			<td>For packaging virus and transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA protein assay kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td>For quantifying protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Phosphatase Inhibitor Mini Tablets</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32957</td>
			<td>Added to cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32953</td>
			<td>Added to cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene (hexadimethrine bromide)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>45-H9268</td>
			<td>For infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>45-P7255</td>
			<td>For antibiotic selection of infected cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent restrainer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For restraining mice during tail vein injeciton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE running buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAZ (V3886) Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4883</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBST buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20 automated cell counter</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>For counting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See Table 1 for complete list of vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89404-464</td>
			<td>For visualizing fluorescence in ZSGreen labeled cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western transfer buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XenoLight D-Luciferin K+ Salt</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>122799</td>
			<td>Substrate injected into mice for in vivo bioluminescent IVIS images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (lipid solution for transfection)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6365787001</td>
			<td>For packaging virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YAP (D8H1X) XP Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>14074</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combined use of tail vein metastasis assays and real-time in vivo imaging to quantify breast cancer metastatic colonization and burden in the lungs

Метастаз является основной причиной смерти, связанной с раком, и существуют ограниченные терапевтические возможности для пациентов с метастатическими заболеваниями. Выявление и тестирование новых терапевтических целей, которые будут способствовать разработке более эффективных методов лечения метастатических заболеваний, требует доклинических моделей in vivo. Демонстрация здесь является сингенной мыши модели для оценки рака молочной железы метастатической колонизации и последующего роста. Метастатические раковые клетки стерливо трансумцируются с вирусными переносчиками, кодирующие светлячок люциферазы и белки SGreen. Кандидат генов затем стабилизированы в люциферазе / SGreen-выражение раковых клеток, а затем клетки вводятся в мышей через боковую вену хвоста, чтобы ассировать метастатическую колонизацию и рост. Устройство in vivo для визуализации используется для измерения биолюминесценции или флуоресценции опухолевых клеток у живых животных для количественной оценки изменений метастатического бремени с течением времени. Выражение флуоресцентного белка позволяет количественно определить количество и размер метастазов в легких в конце эксперимента без необходимости секционирования или гистологического окрашивания. Этот подход предлагает относительно быстрый и простой способ проверить роль генов-кандидатов в метастатической колонизации и роста, и предоставляет гораздо больше информации, чем традиционные анализы метастазов хвостовых вен. Используя этот подход, мы показываем, что одновременное снижение ассоциированного белка Yes (YAP) и транскрипционного коактиватора с связывающим мотивом PD ' (ТАЗ) в раковых клетках молочной железы приводит к снижению метастатического бремени в легких и что это снижение нагрузки является результатом значительно йогтерированной метастатизации и снижения роста метастазов.

Чтобы продемонстрировать вышеподход, мы выполнили доказательство концептуального эксперимента, в котором критический фактор репликации, RPA3 был сбит в метастатической линии клеток карциномы мыши (4T122). В то время как протокол описывает маркировку клеток как люциферазы и ф?...

Watch this Scientific Journal Video about Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs at JoVE.co

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs (Video) | JoVE

Описанный подход сочетает в себе экспериментальные метастазирование хвостовой вены с in vivo живой изображения животных, чтобы в режиме реального времени мониторинга образования метастазов рака молочной железы и роста в дополнение к количественной метастазировать число и размер в легких.

Комбинированное использование хвоста вен ы метастазы анализы и в режиме реального времени в Vivo Imaging для количественной диагностики рака молочной железы метастатическая колонизация и бремя в легких

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Наш протокол может быть использован для быстрого и легкого тестирования роли любого гена-кандидата в метастатической колонизации и росте. Протокол также позволяет в режиме реального времени контролировать метастазы, образование и рост, а также количественное количество и размер метастазов у тех же животных без необходимости повторного оплодотворения или гистологического окрашивания. Плита четыре Т1 клетки на 150000 клеток на колодец в 12-хорошо пластины в полном росте средств массовой информации.Инкубировать при 37 градусах по Цельсию 5%углекислого газа в одночасье. На следующий день, аспирировать рост средств массовой информации из клеток. Добавьте 500 микролитров вирусного супернатанта люциферазы и 500 микролитров флуоресцентного белка вирусного супернатанта, чтобы одновременно заразить клетки как люциферазой, так и флуоресцентными белковых вирусных супернатантами.Затем добавьте один микролитр по восемь миллиграммов на миллилитр гексадиметрина бромистого и инкубировать при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислого газа в течение 24 до 48 часов. Трипсинизировать четыре Т1 клетки с 500 микролитров трипсина. Через две-пять минут перенесите все клетки на шестиметровую тарелку в четыре миллилитров отборных средств массовой информации, тем самым утолив трипсин.После завершения отбора подтвердите, что инфицированные четыре Т1-клетки выражают флуоресцентный белок с помощью перевернутого флуоресцентного микроскопа при 50-100-м увеличении. Также подтвердите, что инфицированные четыре Т1 клетки выражают люциферазы с помощью коммерчески доступных люцифераза деятельности комплекта. Приступить к проведению оптимизации экспериментального дизайна in vivo, как описано в текстовом протоколе.Аспирировать средства массовой информации и промыть пластины ячейки с 1X PBS. Трипсинизировать клетки с пятью миллилитров трипсина на 15 сантиметров пластины в течение двух-пяти минут и передать все клетки в конической трубки. Вымойте оставшиеся клетки из ткани культуры блюдо с достаточно полного роста средств массовой информации, чтобы утолить трипсина.Добавьте стирку в ту же коническую трубку. Подсчитайте ячейки с помощью автоматизированного счетчика ячеек, чтобы определить общий номер ячейки. Затем центрифуга клетки в 122 раза G в течение трех минут, и аспирировать супернатант.Повторное приостановление клеток в 1X PBS при желаемой концентрации. Здесь в каждую мышь вводится 25 000 ячеек и 100 микролитров PBS. Таким образом, повторно приостановленные клетки находятся на уровне 250 000 клеток на миллилитр.Держите подвески клетки на льду до инъекции. Работая в капюшоне на животном объекте, аккуратно, но тщательно смешать клетки, инвертирование трубки или с помощью одного миллилитров шприца, чтобы убедиться, что они равномерно повторно приостановлено. Теперь загрузите один миллилитр Luer Lock шприц с клеточной подвеской и изгнать избыток пузырьков воздуха.Поместите по половину дюйма 30 калибровочных игл на шприц с скошенной и изгнать пузырьки воздуха. Аккуратно поместите мышь в удержатель грызунов. Боковой хвост вены должны быть видны и расширены.Если нет, аккуратно ущипнуть основание хвоста и окунуть хвост в теплую водопроводную воду, чтобы расширить вены. Используйте спиртовую салфетку для очистки хвоста, затем вставьте иглу в хвостовую вену, скошенную сторону вверх и ввелите 100 микролитров клеточной подвески. Если игла правильно вставлена в вену, она должна легко скользить немного вперед и назад, и не должно быть сопротивления, когда поршень толкнул.Успешные инъекции должны также привести к флеш, в котором синий цвет вены становится белым в течение нескольких секунд после инъекции. Медленно снимите иглу и, используя стерильную марлю, нанесите давление на место инъекции, чтобы остановить кровотечение. Вернуть мышь в клетку и контролировать в течение 15 минут, чтобы обеспечить полное восстановление.Включите устройство визуализации живых животных in vivo, откройте программное обеспечение для изображения и войдите в систему. Нажмите кнопку инициализации и подождите, пока машина инициализируется. Измените поле зрения на D.For first time use, отредактировать настройки экспозиции, нажав на правку, предпочтения, приобретение и автоматическое воздействие.Измените максимальное время экспозиции с 60 секунд по умолчанию до 300 секунд и нажмите кнопку "Хорошо". Загрузите один миллилитр шприц с D-люциферин, а затем добавить пополам дюйма 30 калибровочных игл к шприцу и изгнать пузырьки воздуха. Измерьте и замитьте массу обезболивающей мыши.Сдерживайте мышь, щипать потертости шеи, используя большой палец и указательные пальцы и хватая хвост между мизинец палец и основание руки. Инвертировать мышь под углом 45 градусов с головой, указывающей вниз. Вставьте иглу, скошенную сторону вверх, в левое боковое IP-пространство мыши.Подтвердите вход в IP-пространство, оттехав небольшой объем. Там не должно быть цвета в основании иглы при опираясь обратно в пространстве IP. Введать соответствующий объем D-люциферина для дозы 150 миллиграммов на килограмм.Сразу же после D-люциферина администрации, начать таймер. Поместите мышь плашмя на спину в устройство визуализации с носом в носовой конус, и убедитесь, что от половины до двух с половиной процентов изофлюран в настоящее время вводят. Нажмите на люминесцентные и фото коробки.Измените время экспозиции на автоматическое, а затем нажмите приобрести в панели управления приобретением. После визуализации, вернуть мышь в клетку и контролировать в течение 15 минут, чтобы обеспечить полное восстановление. После эвтаназии, как описано в текстовом протоколе, изолировать и удалить легкие из каждой мыши и промыть в 1X PBS, чтобы удалить избыток крови.Приобретайте изображения метастазов в долях 10X в Брайтфилде и флуоресценции с помощью флуоресцентного стереоскопа с фильтром GFP. Используйте программное обеспечение для анализа изображений для количественной оценки размера и количества метастазов на изображениях. Для обработки и анализа данных с изображений, полученных с помощью устройства визуализации живых животных in vivo, откройте все файлы изображений для каждой мыши в программном обеспечении изображения.Убедитесь, что блоки находятся в сияния для биолюминесцентных данных и эффективности для флуоресцентных данных, нажав на стрелку в левом верхнем левом верхнем части окна изображения и изменив его на соответствующий блок. Используйте изображение из последней точки времени, чтобы создать область интереса, или рентабельность инвестиций, сначала нажав инструменты roi в окне палитры инструментов. Затем вставьте одну roi, нажав на стрелку и выбрав одну.Нажмите на границу roi и перемести его к груди мыши. Отрегулируйте размер roi поэтому оно покрывает комод мыши и не исключает сигнал. Затем щелкните меру ROIs и скопировать или ввести необработанный номер в лист Excel.Участок и анализ данных, описанных в текстовом протоколе. Нажмите правой кнопкой мыши в файле изображения, чтобы скопировать ROI, а затем вставить его в файлы изображений из других точек времени и нажмите кнопку измерения ROIs. Ретровирусный вектор, выражаюющий тандемные шРН-30 на основе миР-30, ориентированные как на YAP, так и на ТАЗ, снижает экспрессию YAP и налоговый белок и транскрипционную активность в четырех клетках Т1.Четыре клетки люциферазы T1 были стабилико трансдуцированы с помощью йСГрин, выражаю выражали версию этого тандема вектора ЯП/ТАЗ шРНК или управляемой миР-30 на основе шРНК. Биолюминесцентные изображения показывают, что скорость, с которой метастатическое бремя увеличилось, была значительно быстрее у мышей, введенных с контрольными клетками по сравнению с мышами, введенными с яП /ТАЗ нокдаун клеток. Сюжет преобразованного сигнала люциферазы log10, измеренного для каждой мыши в ходе эксперимента, также показывает, что скорость была быстрее у мышей, вводимых с контрольными клетками, по сравнению с мышами, введенными с нокдаунными клетками YAP/TAZ.Значительно меньше метастазов образуется у мышей, вводимых с ЯП / ТАЗ нокдаун клеток по сравнению с мышами с контрольными клетками при счете вручную. Такая же тенденция наблюдалась при использовании программного обеспечения для анализа изображений. Мало того, что гораздо больше метастазов форме в контроль мышей, но они, как правило, больше.Последовательно метастатическое бремя в легких также резко уменьшилось в нокдауне YAP/TAZ. Успешная инъекция равного количества здоровых клеток в каждую мышь имеет решающее значение для обеспечения высокого качества данных. Не забудьте соблюдать осторожность и следовать рекомендациям по безопасности при работе с инфекционными ретровирусами и лентивирусами, особенно если вирусы являются инфекционными для человека.Этот метод позволил нам проиллюстрировать роль генов-кандидатов и метастатической колонизации и роста, обеспечивая способ выявления и тестирования новых терапевтических целей для лечения метастатических заболеваний. После этой процедуры метастазы, содержащие легкие, могут быть дополнительно проанализированы иммунофлуоресцентным или гистологическим окрашиванием, чтобы исследовать, как измененный ген влияет на метастазы и определить другие белки, которые могут быть вовлечены.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis

Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis (Video) | JoVE

Intra-подвздошной артерией Инъекции для эффективного и селективного моделирования Микроскопическое костными метастазами

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely ...

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion (Video) | JoVE

Сокультивирования Анализы по изучению макрофагами и микроглии стимуляции глиобластомы вторжения

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones (Video) | JoVE

Расширенный животной модели колоректального метастазами в печени: Визуализация методы и свойства метастатических клонов

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer (Video) | JoVE

Воротной вены для инъекций модель для изучения печени метастазирования рака молочной железы

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay (Video) | JoVE

Практические соображения в изучении метастатического легких колонизации в остеосаркома, используя Assay легочных метастазов

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment (Video) | JoVE

В естественных условиях ЭПР Оценка рН, pO2, окислительно-восстановительного состояния и концентрации фосфатов и глутатиона в микроокружения опухоли

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment (Video) | JoVE

Микроманипуляции циркулирующей опухолевой клетки для молекулярного анализа вниз по течению и метастатического потенциального оценивания

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells (Video) | JoVE

Патологический анализ метастазирования в легкие после инъекции опухолевых клеток в латеральную хвостовую вену

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model (Video) | JoVE

Использование компьютерного анализа изображений для улучшения количественной оценки метастазов легких в модели рака молочной железы 4T1

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

Modeling Brain Metastasis Via Tail-Vein Injection of Inflammatory Breast Cancer Cells

Modeling Brain Metastasis Via Tail-Vein Injection of Inflammatory Breast Cancer Cells (Video) | JoVE

Моделирование метастазирования в головной мозг с помощью инъекции воспалительных клеток рака молочной железы в хвостовую вену

Metastatic spread to the brain is a common and devastating manifestation of many types of cancer. In the United States alone, about 200,000 patients are ...