Name: combined use of tail vein metastasis assays and real-time in vivo imaging to quantify breast cancer metastatic colonization and burden in the lungs
Uploaded: 2019-12-19T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs at JoVE.co

Agradecemos a Emily Norton por ayudar con las infecciones virales y la lectura crítica del manuscrito. También damos las gracias a Ryan Kanai por ayudar con la adquisición de imágenes de los pulmones y Kate E. Tubbesing por la ayuda con el análisis de imágenes de las metástasis verdes en los pulmones. Agradecemos al personal de la instalación de investigación animal por su apoyo y por la ayuda en la preparación de este video. Este trabajo fue apoyado por una beca Susan G. Komen Career Catalyst que otorgó a J.M.L. (#CCR17477184).

Este protocolo implica el uso de ratones y materiales biopeligrosos y requiere la aprobación de los comités de seguridad institucionales apropiados. Todo el trabajo in vivo descrito aquí es aprobado por el Comité Institucional de cuidado y Uso de Animales (IACUC, por sus) por sus dados).
NOTA: Para obtener información general sobre el protocolo, consulte el esquema en la Figura 1.
1. Empaquetado de todos los retrovirus y lentivirus n...

Pasos críticos del método Es fundamental optimizar el número de células inyectadas (paso 3) para una línea celular dada y la tensión del ratón, ya que esto puede influir en gran medida en el número de metástasis que se forman y la longitud del experimento. Si se inyectan demasiadas células o las metástasis crecen durante demasiado tiempo, las metástasis pueden ser difíciles de contar haciendo que los efectos de la manipulación genética sean difíciles de evaluar. Sin embargo, si se inye...

El cáncer sigue siendo la segunda causa de muerte en todo el mundo1 y la metástasis es responsable de la mayoría de estas muertes2,3. Sin embargo, una comprensión limitada de los mecanismos moleculares que rigen la colonización metastásica y el crecimiento posterior ha obstaculizado el desarrollo de tratamientos eficaces para la enfermedad metastásica. La identificación de nuevas dianas terapéuticas requiere un ensayo para probar cómo la expresión o función perturbada de un gen candidato influye en la formación y el crecimiento de la metástasis. Mientras que los modelos de ratón autóctonos tienen sus ventajas, consumen mucho tiempo y son costosos de generar, lo que los hace más adecuados para la validación de destino en lugar de la detección de objetivos. Los sistemas modelo de trasplante en los que el gen candidato se perturba en las células cancerosas in vitro y luego se evalúan in vivo los efectos sobre el potencial metastásico, son menos costosos y de mayor rendimiento que los modelos autóctonos. Además, los vectores virales para la administración estable de ARNi, CRISPR/CAS9 y transgenes están ampliamente disponibles, por lo que es relativamente fácil perturbar prácticamente cualquier gen o genes de interés en las líneas celulares de una célula cancerosa. Este enfoque también se puede utilizar para analizar el papel de los genes candidatos en la colonización metastásica y el crecimiento en las líneas celulares de cáncer humano trasplantando las células en ratones inmunocomprometidos o humanizados.
Los dos tipos de ensayos utilizados para probar la formación de metástasis por células cancerosas trasplantadas in vivo son ensayos de metástasis espontáneas y ensayos experimentales de metástasis. En los ensayos espontáneos de metástasis4,5, las células cancerosas se inyectan en ratones, se les permite formar un tumor primario, y luego se analiza la formación espontánea de metástasis y el crecimiento posterior. La fuerza de este modelo es que las células deben completar todos los pasos del proceso metastásico para formar tumores metastásicos. Sin embargo, muchas líneas celulares cancerosas no hacen metástasis eficientemente en modelos de metástasis espontánea, y cualquier manipulación de las células que afecta el crecimiento del tumor primario puede confundir los resultados del ensayo de metástasis. Los ensayos experimentales de metástasis, en los que las células cancerosas se inyectan directamente en la circulación, se utilizan para evitar estos escollos. Los ensayos de metástasis experimentales comunes incluyen la inyección de vena de cola6,7,8 (y se demuestra aquí), inyección intracardiaca9,y la inyección de vena porta10.
El propósito del protocolo presentado aquí es proporcionar un ensayo experimental de metástasis in vivo que permita a un investigador monitorear la formación y el crecimiento de metástasis en tiempo real, así como cuantificar el número y el tamaño de la metástasis del punto final en los pulmones del mismo ratón. Para ello, los ensayos tradicionales de metástasis de la cola experimental6,7,8 se combinan con imágenes de animales vivos, utilizando un dispositivo de imagen in vivo9,11,12,13,14. Las células tumorales que expresan establemente tanto la luciferasa como una proteína fluorescente se inyectan en ratones a través de la vena lateral de la cola y luego el dispositivo de imágenes in vivo se utiliza para medir los cambios en la carga metastásica en los pulmones a lo largo del tiempo(Figura 1). Sin embargo, el dispositivo de imágenes de animales vivos in vivo no puede distinguir ni medir el tamaño de las metástasis individuales. Por lo tanto, al final del experimento, se utiliza un estereomicroscopio fluorescente para contar el número y medir el tamaño de las metástasis fluorescentes en los pulmones sin necesidad de seccionamiento e histología o inmunohistoquímica(Figura 1). Este protocolo se puede utilizar para probar cómo la alteración de la expresión o función de un gen candidato influye en la formación y el crecimiento de la metástasis. También se pueden probar posibles compuestos terapéuticos como moléculas pequeñas o anticuerpos de bloqueo de funciones.
Para demostrar este enfoque, primero realizamos un experimento de prueba de concepto en el que el factor de replicación esencial, la proteína de replicación A3 (RPA3) se derriba en las células de cáncer de mama de ratón metastásico. Mostramos que los ratones inyectados con células de derribo de RPA3 tienen una carga metastásica significativamente menor en cada punto de tiempo en comparación con los ratones inyectados con células de control. El análisis de los pulmones que contienen metástasis muestra que esta carga metastásica reducida es el resultado de una colonización metastásica significativamente reducida y un crecimiento deteriorado de las metástasis que se forman. Para demostrar aún más esta técnica, probamos si el derribo simultáneo de proteína asociada al Sí (YAP) y coactivador transcripcional con un motivo de unión a pdZ (TAZ) afecta la colonización metastásica o el crecimiento posterior. YAP y TAZ son dos coactivadores transcripcionales relacionados que son los efectores descendentes críticos de Hippo Pathway. Nosotros15,16 y otros hemos implicado YAP y TAZ en metástasis (revisado en17,18,19), lo que sugiere que estas proteínas son buenas dianas terapéuticas. Consistentemente, encontramos que los ratones inyectados con células de derribo YAP/TAZ habían reducido significativamente la carga metastásica. El análisis de los pulmones mostró que las células de derribo YAP/TAZ formaban muchas menos metástasis y que las metástasis que se formaban eran más pequeñas. Estos experimentos demuestran cómo los ensayos experimentales de metástasis permiten a un investigador probar rápida y económicamente el papel de un gen candidato en la formación y el crecimiento de metástasis. Además, muestran cómo el uso combinado de imágenes de animales vivos y la cuantificación fluorescente de metástasis en pulmones enteros permite al investigador comprender mejor los pasos durante la colonización metastásica.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% SDS-PAGE Gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td>Trypsin for tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat bottom white assay plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3922</td>
			<td>For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol wipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For sterolizing the injection site before tail vein injecitons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/C mice (female, 6 weeks)</td>
			<td>Taconic</td>
			<td>BALB-F</td>
			<td>For tail vein metastatic colonization and burden assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA regular</td>
			<td>VWR Ameresco</td>
			<td>97061-416</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lysis buffer</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td></td>
			<td>For collecting protien samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celltreat Syringe Filters, PES 30mm, 0.45 &#956;m</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>40-229749-CS</td>
			<td>For filtering viral supernatant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 and euthanasia chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For euthanasing the mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-luciferase reporter assay kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1960</td>
			<td>For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&39;s phosphate buffered saline</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>TS1006</td>
			<td>For PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-406</td>
			<td>Used to dilute trypsin for tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS 100% US origin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97068-085</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fujifilm LAS-3000 gel imager</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td></td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH(14C10) Rabibit mAb</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2118</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP conjugate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>31460</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human embryonic kidney cells, HEK-293FT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R70007</td>
			<td>Cell line used for packging virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone DMEM/High clucose</td>
			<td>GE Healthcare life sciences</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B, Ultra Pure Grade</td>
			<td>VWR Ameresco</td>
			<td>97064-810</td>
			<td>For antibiotic selection of infected cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td></td>
			<td>For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imagej</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for image analysis of lung metastases: threshold set to 25 &#38; 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immuno-Blot PVDF Membrane</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1620177</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For mouse anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System (in vivo live animal imaging device)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>CLS136340</td>
			<td>For in vivo imaging of metastatic burden</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M205 FA &#38; Lecia DCF3000 G (GFP and bright field filters)</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Microscope and camera for visualing, counting and taking pcitures of metastases in the lungs; 10X magnifacation, 3.5 sec exposure, 1.4 gain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>L3000008</td>
			<td>For YAP/TAZ-TEAD reporter transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image 3.2 (image software program)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Software for IVIS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse breast cancer cells, 4T1</td>
			<td>Karmanos Cancer Institute</td>
			<td>Aslakson, CJ et al.,1992</td>
			<td>Mouse metastatic breast cance cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Gauge version 3.0</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td></td>
			<td>Software for quantifying western blot band intensity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM (transfection buffer)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-062</td>
			<td>For packaging virus and transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA protein assay kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td>For quantifying protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Phosphatase Inhibitor Mini Tablets</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32957</td>
			<td>Added to cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32953</td>
			<td>Added to cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene (hexadimethrine bromide)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>45-H9268</td>
			<td>For infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>45-P7255</td>
			<td>For antibiotic selection of infected cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent restrainer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For restraining mice during tail vein injeciton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE running buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAZ (V3886) Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4883</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBST buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20 automated cell counter</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>For counting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See Table 1 for complete list of vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89404-464</td>
			<td>For visualizing fluorescence in ZSGreen labeled cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western transfer buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XenoLight D-Luciferin K+ Salt</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>122799</td>
			<td>Substrate injected into mice for in vivo bioluminescent IVIS images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (lipid solution for transfection)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6365787001</td>
			<td>For packaging virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YAP (D8H1X) XP Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>14074</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combined use of tail vein metastasis assays and real-time in vivo imaging to quantify breast cancer metastatic colonization and burden in the lungs

La metástasis es la principal causa de muertes relacionadas con el cáncer y hay opciones terapéuticas limitadas para los pacientes con enfermedad metastásica. La identificación y prueba de nuevas dianas terapéuticas que faciliten el desarrollo de mejores tratamientos para la enfermedad metastásica requiere modelos preclínicos in vivo. Aquí se muestra un modelo de ratón singérico para decir la colonización metastásica del cáncer de mama y el crecimiento posterior. Las células cancerosas metastásicas se transduelen de forma estable con vectores virales que codifican la luciferasa de las luciérnagas y las proteínas ZsGreen. Los genes candidatos son manipulados de forma estable en células cancerosas que expresan luciferase/ZsGreen y luego las células se inyectan en ratones a través de la vena lateral de la cola para analizar la colonización y el crecimiento metastásicos. A continuación, se utiliza un dispositivo de imágenes in vivo para medir la bioluminiscencia o fluorescencia de las células tumorales en los animales vivos para cuantificar los cambios en la carga metastásica con el tiempo. La expresión de la proteína fluorescente permite cuantificar el número y el tamaño de las metástasis en los pulmones al final del experimento sin necesidad de seccionar o tinción histológica. Este enfoque ofrece una manera relativamente rápida y fácil de probar el papel de los genes candidatos en la colonización y el crecimiento metastásicos, y proporciona mucha más información que los ensayos tradicionales de metástasis venosa de cola. Con este enfoque, mostramos que la reducción de la reducción de la carga metastásica en los pulmones y el desenlace simultáneo de proteína asociada al Sí (YAP) y del activador transcripcional con un motivo de unión a la PDZ (TAZ) en las células de cáncer de mama reduce la carga metastásica en los pulmones y que esta carga reducida es el resultado de una colonización metastásica significativamente deteriorada y un crecimiento reducido de metástasis.

Para demostrar el enfoque anterior, realizamos un experimento de prueba de concepto en el que un factor de replicación crítico, RPA3 fue derribado en una línea celular de carcinoma mamario de ratón metastásico (4T122). Mientras que el protocolo describe la etiquetado de las células con luciferasa y proteínas fluorescentes antes de la manipulación genética, utilizamos un enfoque modificado porque los vectores RNAi también entregan ZsGreen(Figura 2A).<...

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Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

El enfoque descrito combina ensayos experimentales de metástasis de la vena de cola con imágenes animales vivos in vivo para permitir el monitoreo en tiempo real de la formación y el crecimiento de metástasis de cáncer de mama, además de la cuantificación del número y tamaño de metástasis en los pulmones.

Uso combinado de ensayos de metástasis de vena de cola e imágenes en tiempo real en vivo en vivo para cuantificar la colonización metastásica del cáncer de mama y la carga en los pulmones

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Nuestro protocolo se puede utilizar para probar rápida y fácilmente el papel de cualquier gen candidato en la colonización metastásica y el crecimiento. El protocolo también permite el monitoreo en tiempo real de la metástasis, la formación y el crecimiento, así como la cuantificación del número y tamaño de la metástasis en los mismos animales sin necesidad de resección o tinción histológica. Placa cuatro células T1 a 150.000 células por pozo en una placa de 12 pozos en medios de crecimiento completos.Incubar a 37 grados Celsius 5% dióxido de carbono durante la noche. Al día siguiente, aspirar los medios de crecimiento de las células. Añadir 500 microlitros de sobrenadante viral luciferasa y 500 microlitros de sobrenadante viral de proteína fluorescente para infectar simultáneamente las células con la luciferasa y los sobrenadantes virales de proteína fluorescente.Luego, agregue un microlitro de ocho miligramos por mililitro de bromuro de hexadimetrina e incubar a 37 grados celsius y 5% dióxido de carbono durante 24 a 48 horas. Trypsinize las cuatro células T1 con 500 microlitros de trippsina. Después de dos a cinco minutos, transfiera todas las células a un plato de seis centímetros en cuatro mililitros de medios de selección, apagando así la trippsina.Una vez completada la selección, confirme que las cuatro células T1 infectadas expresan proteína fluorescente ZsGreen utilizando un microscopio fluorescente invertido de 50 a 100 veces el aumento. También confirme que las cuatro células T1 infectadas están expresando luciferasa utilizando un kit de actividad de luciferasa disponible comercialmente. Proceda a realizar la optimización del diseño experimental in vivo como se describe en el protocolo de texto.Aspirar el medio y enjuagar las placas celulares con 1X PBS. Pruebe las células con cinco mililitros de tripina por placa de 15 centímetros durante dos a cinco minutos y transfiera todas las células a un tubo cónico. Lave las células restantes del plato de cultivo de tejido con suficientes medios de crecimiento completos para saciar la trippsina.Agregue el lavado al mismo tubo cónico. Cuente las celdas utilizando un contador de celdas automatizado para determinar el número de celda total. A continuación, centrifugar las células a 122 veces G durante tres minutos, y aspirar el sobrenadante.Vuelva a suspender las células en 1X PBS a la concentración deseada. Aquí, se inyectan 25.000 células en cada ratón y 100 microlitros de PBS. Así que las células re-suspendidas están en 250.000 células por mililitro.Mantenga las suspensiones celulares sobre hielo hasta la inyección. Trabajando en una campana en la instalación animal, mezcle suavemente pero a fondo las células invirtiendo el tubo o utilizando una jeringa de un mililitro para asegurarse de que se vuelvan a suspender uniformemente. Ahora, cargue una jeringa Luer Lock de un mililitro con la suspensión celular y expulse el exceso de burbujas de aire.Coloque una aguja de calibre 30 de media pulgada en la jeringa con el bisel hacia arriba y expulse las burbujas de aire. Coloque suavemente el ratón en un limitador de roedores. La vena lateral de la cola debe ser visible y dilatada.Si no es así, pellizca suavemente la base de la cola y sumerge la cola en agua tibia del grifo para dilatar las venas. Use una toallita con alcohol para limpiar la cola, luego inserte la aguja en la vena de la cola, bisele el lado hacia arriba e inyecte 100 microlitros de suspensión celular. Si la aguja se inserta correctamente en la vena, debe deslizarse ligeramente hacia adelante y hacia atrás, y no debe haber resistencia cuando se empuja el émbolo.Las inyecciones exitosas también deben dar lugar a un lavado en el que el color azul de la vena se vuelve blanco durante unos segundos después de la inyección. Retire lentamente la aguja y, con una gasa estéril, aplique presión en el lugar de la inyección para detener cualquier sangrado. Vuelva a colocar el ratón en su jaula y monitoree durante 15 minutos para garantizar una recuperación completa.Encienda el dispositivo de imágenes de animales vivos in vivo, abra el software de imágenes e inicie sesión. Haga clic en el botón de inicialización y espere a que el equipo se inicialice. Cambie el campo de visión a D.Para el primer uso, edite la configuración de exposición haciendo clic en editar, preferencias, adquisición y exposición automática.Cambie el tiempo máximo de exposición de los 60 segundos predeterminados a 300 segundos y haga clic en Aceptar. Cargue una jeringa de un mililitro con D-luciferina, luego agregue una aguja de calibre 30 de media pulgada a la jeringa y expulse las burbujas de aire. Mida y registre la masa de un ratón anestesiado.Restringe el ratón pellizcando el rasguño del cuello usando los dedos del pulgar y el puntero y agarrando la cola entre el dedo meñique y la base de la mano. Invierta el ratón en un ángulo de 45 grados con la cabeza apuntando hacia abajo. Inserte la aguja, biselada hacia arriba, en el espacio IP del lado izquierdo del ratón.Confirme la entrada en el espacio IP recuperando un pequeño volumen. No debe haber color en la base de la aguja al volver a dibujar en el espacio IP. Inyectar el volumen adecuado de D-luciferina para una dosis de 150 miligramos por kilogramo.Inmediatamente después de la administración de D-luciferin, inicie un temporizador. Coloque el ratón plano sobre su espalda en el dispositivo de imágenes con su nariz en el cono nasal, y asegúrese de que se está administrando un medio a dos y medio por ciento de isoflurano. Haga clic en los cuadros luminiscentes y fotográficos.Cambie el tiempo de exposición a automático y, a continuación, haga clic en adquirir en el panel de control de adquisición. Después de la toma de imágenes, devuelva el ratón a su jaula y monitoree durante 15 minutos para garantizar una recuperación completa. Después de la eutanasia, como se describe en el protocolo de texto, aislar y eliminar los pulmones de cada ratón y enjuagar en 1X PBS para eliminar el exceso de sangre.Adquiera imágenes de metástasis ZsGreen en los lóbulos a 10 veces en Brightfield y fluorescencia utilizando un estereoscopio fluorescente con un filtro de banda ancha GFP. Utilice el software de análisis de imágenes para cuantificar el tamaño y el número de metástasis de las imágenes. Para procesar y analizar los datos de las imágenes adquiridas con el dispositivo de imágenes de animales vivos in vivo, abra todos los archivos de imagen para cada ratón en el software de imagen.Asegúrese de que las unidades estén radiantes para los datos bioluminiscentes y la eficiencia de los datos fluorescentes haciendo clic en la flecha en la parte superior izquierda de la ventana de la imagen y cambiándola a la unidad adecuada. Utilice la imagen desde el último punto de tiempo para crear una región de interés, o ROI, haciendo clic primero en Las herramientas de ROI en la ventana de la paleta de herramientas. A continuación, inserte un ROI haciendo clic en la flecha y seleccionando uno.Haga clic en el borde del ROI y muévalo al pecho del ratón. Ajuste el tamaño del ROI para que cubra el pecho del ratón y no excluya la señal. A continuación, haga clic en medir ROI y copie o escriba el número sin procesar en una hoja de Excel.Trazar y analizar los datos como se describe en el protocolo de texto. Haga clic con el botón derecho en el archivo de imagen para copiar el ROI, luego péguelo en archivos de imagen de los otros puntos de tiempo y haga clic en medir ROI. El vector retroviral que expresa shRNAs basados en en tándem miR-30 dirigidos a YAP y TAZ reduce la expresión y actividad transcripcional de proteínas fiscales y YAP en cuatro células T1.Cuatro células luciferasas T1 fueron transducidas de forma estable con una versión ZsGreen que expresaba este vector YAP/TAZ shRNA tándem o un arnesco controlado basado en miR-30. Las imágenes bioluminiscentes muestran que la velocidad a la que aumentó la carga metastásica fue significativamente más rápida en los ratones inyectados con células de control en comparación con los ratones inyectados con células knockdown YAP/TAZ. Una gráfica de la señal de luciferasa transformada log10 medida para cada ratón en el transcurso del experimento también muestra que la velocidad fue más rápida en los ratones inyectados con las células de control en comparación con los ratones inyectados con células de derribo YAP/TAZ.Significativamente menos metástasis formadas en los ratones inyectados con las células knockdown YAP/TAZ en comparación con los ratones con células de control cuando se cuentan manualmente. Se observó la misma tendencia cuando se utiliza el software de análisis de imágenes. No sólo se formaron muchas más metástasis en los ratones de control, sino que generalmente eran más grandes.Consistentemente, la carga metastásica en los pulmones también se redujo drásticamente por derribo de YAP/TAZ. La inyección exitosa de igual número de células sanas en cada ratón es fundamental para garantizar datos de alta calidad. Recuerde tener cuidado y seguir las pautas de seguridad cuando trabaje con retrovirus infecciosos e lentivirus, especialmente si los virus son infecciosos humanos.Esta técnica nos ha permitido ilustrar las funciones de los genes candidatos y la colonización y el crecimiento metastásicos, proporcionando una manera de identificar y probar nuevas dianas terapéuticas para el tratamiento de la enfermedad metastásica. Después de este procedimiento, las metástasis que contienen pulmones se pueden analizar más a fondo mediante tinción inmunofluorescente o histológica para investigar cómo el gen alterado está influyendo en las metástasis e identificar otras proteínas que pueden estar involucradas.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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Intra-ilíaca Arteria inyección de Modelamiento eficiente y selectiva de microscópico metástasis en los huesos

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Investigación

Investigación sobre el cáncer

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Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

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Avanzada modelo animal de colorrectal metástasis en hígado: Técnicas de imagen y propiedades metastásicas de los clones

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

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La utilización de la genómica funcional de selección para identificar dianas farmacológicas potencialmente nueva en la celda cáncer culturas Esferoide

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Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

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Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

Uso de análisis de imágenes por ordenador para mejorar la cuantificación de la metástasis pulmonar en el modelo de cáncer de mama 4T1

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

Modeling Brain Metastasis Via Tail-Vein Injection of Inflammatory Breast Cancer Cells

Modelado de metástasis cerebral mediante inyección en la vena de cola de células inflamatorias de cáncer de mama

Metastatic spread to the brain is a common and devastating manifestation of many types of cancer. In the United States alone, about 200,000 patients are ...