Name: combined use of tail vein metastasis assays and real-time in vivo imaging to quantify breast cancer metastatic colonization and burden in the lungs
Uploaded: 2019-12-19T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs at JoVE.co

Vi tackar Emily Norton för att ha hjälpt till med virusinfektioner och kritisk läsning av manuskriptet. Vi tackar också Ryan Kanai för hjälp med att förvärva bilder av lungorna och Kate E. Tubbesing för hjälp med bildanalys av de gröna metastaser i lungorna. Vi tackar djur forskningsanläggningen personal för deras stöd och för hjälp vid utarbetandet av denna video. Detta arbete stöddes av en Susan G. Komen karriär katalysator Grant som tilldelas J.M.L. (#CCR17477184).

Detta protokoll inbegriper användning av möss och biologiskt farliga material och kräver godkännande från lämpliga institutionella säkerhets kommittéer. Alla de beskrivna in vivo arbete här är godkänt av Albany Medical College institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC).
Anmärkning: för en protokoll översikt, se schematiskt i figur 1.
1. paketera alla nödvändiga retrovirus och upphov
<p class="jove_co...

Kritiska steg i metoden Det är viktigt att optimera antalet injicerade celler (steg 3) för en given cell linje och mus stam eftersom detta kan i hög grad påverka antalet metastaser som bildar och längden på experimentet. Om alltför många celler injiceras eller metastaser växa för länge, metastaser kan vara svårt att räkna att göra effekterna av genetisk manipulation svårt att bedöma. Men, om alltför få celler injiceras, få eller inga metastaser kan bildas. Därför bör ett prelimin...

Cancer är fortfarande den näst vanligaste dödsorsaken i världen1 och metastaser är ansvarig för majoriteten av dessa dödsfall2,3. Men en begränsad förståelse av de molekylära mekanismerna som styr metastaserad kolonisering och efterföljande tillväxt har hindrat utvecklingen av effektiva behandlingar för metastaserande sjukdom. Identifiering av nya terapeutiska mål kräver ett test för att testa hur oroad uttryck eller funktion av en kandidat gen påverkar metastaser bildas och tillväxt. Även inhemska musmodeller har sina fördelar, de är tidskrävande och dyrt att generera, vilket gör dem mer lämpade för mål validering snarare än mål identifiering. Transplantation modellsystem där kandidaten genen är oroad i cancerceller in vitro-och sedan effekter på metastatisk potential bedöms in vivo, är billigare och högre genomströmning än autoktona modeller. Dessutom, viral vektorer för stabil leverans av RNAi, CRISPR/CAS9, och transgener är allmänt tillgängliga, vilket gör det relativt lätt att stör praktiskt taget någon gen eller gener av intresse i en cancer cellinjer. Denna metod kan också användas för att assay rollen av kandidaten gener i metastaserad kolonisering och tillväxt i mänskliga cancer cellinjer genom transplantation cellerna till immunkomprometterade eller humaniserade möss.
De två typer av analyser som används för att testa metastaser bildas genom transplanterade cancerceller in vivo är spontana metastaser-analyser och experimentella metastaser-analyser. I spontana metastaser analyser4,5, cancerceller injiceras i möss, tillåtet att bilda en primär tumör, och sedan spontan metastaser bildas och efterföljande tillväxt är analyseras. Styrkan i denna modell är att cellerna måste slutföra alla steg i den metastaserande processen för att bilda metastaserande tumörer. Emellertid, många cancer cellinjer inte metastasera effektivt i spontana metastaser modeller, och någon manipulation av de celler som påverkar primär tumörtillväxt kan blanda ihop resultaten av metastaser analysen. Experimentella metastaser analyser, där cancerceller injiceras direkt i cirkulationen, används för att undvika dessa fallgropar. Vanliga experimentella metastaser analyser inkluderar svansen ven injektion6,7,8 (och visas här), intrakardiell injektion9, och Portal Vein injektion10.
Syftet med det protokoll som presenteras här är att ge en in vivo experimentell metastaser analys som gör det möjligt för en forskare att övervaka metastaser bildas och tillväxt i realtid, samt att kvantifiera slutpunkt metastaser antal och storlek i lungorna av samma mus. För att åstadkomma detta, traditionella experimentella svans venen metastaser analyser6,7,8 kombineras med levande djur avbildning, med hjälp av en in vivo Imaging Device9,11,12,13,14. Tumörceller som stabilt uttrycker både luciferas och ett fluorescerande protein injiceras i möss via den laterala svans venen och därefter används in vivo-avbildningsapparaten för att mäta förändringar av metastatisk börda i lungorna över tid (figur 1). In vivo-enheten för levande djur kan dock inte särskilja eller mäta storleken på enskilda metastaser. Således, i slutet av experimentet, en fluorescerande stereomikroskop används för att räkna antalet och mäta storleken på fluorescerande metastaser i lungorna utan behov av snittning och histologi eller immunohistokemi (figur 1). Detta protokoll kan användas för att testa hur ändring av uttryck eller funktion av en kandidat gen påverkar metastaser bildas och tillväxt. Potentiella terapeutiska föreningar såsom små molekyler eller funktion blockerar antikroppar kan också testas.
För att demonstrera detta tillvägagångssätt utförde vi först ett proof of Concept-experiment där den viktiga replikeringsfaktorn, replikeringproteinet a3 (RPA3) slås ned i metastaserande mus bröstcancerceller. Vi visar att möss injiceras med RPA3 knockdown celler har signifikant mindre metastaserande börda vid varje tidpunkt jämfört med möss injiceras med kontrollceller. Analys av de metastaser som innehåller lungorna visar att denna minskade metastatisk börda är resultatet av signifikant minskad metastaserad kolonisering och försämrad tillväxt av de metastaser som bildas. För att ytterligare demonstrera denna teknik, vi testade om samtidig knock down av Ja tillhörande protein (YAP) och transkriptionella Co-aktivator med en PDZ-bindande motiv (TAZ) försämrar metastaserad kolonisering eller efterföljande tillväxt. YAP och Taz är två relaterade transkriptionella Co-aktivatorer som är de kritiska nedströms manipulatorer av Hippo vägen. Vi15,16 och andra har inblandad YAP och Taz i metastaser (ses över i17,18,19), vilket tyder på att dessa proteiner är bra terapeutiska mål. Konsekvent, vi fann att möss injiceras med YAP/TAZ knockdown celler hade signifikant minskad metastaserande börda. Analys av lungorna visade att YAP/TAZ knockdown celler bildade många färre metastaser och att de metastaser som gjorde formen var mindre. Dessa experiment visar hur experimentella metastaser gör det möjligt för en forskare att snabbt och billigt testa rollen av en kandidat gen i metastaser bildas och tillväxt. De visar vidare hur den kombinerade användningen av levande djur avbildning och fluorescerande kvantifiering av metastaser i hela lungorna gör det möjligt för forskaren att bättre förstå stegen vid metastaserad kolonisation.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% SDS-PAGE Gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td>Trypsin for tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat bottom white assay plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3922</td>
			<td>For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol wipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For sterolizing the injection site before tail vein injecitons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/C mice (female, 6 weeks)</td>
			<td>Taconic</td>
			<td>BALB-F</td>
			<td>For tail vein metastatic colonization and burden assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA regular</td>
			<td>VWR Ameresco</td>
			<td>97061-416</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lysis buffer</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td></td>
			<td>For collecting protien samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celltreat Syringe Filters, PES 30mm, 0.45 &#956;m</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>40-229749-CS</td>
			<td>For filtering viral supernatant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 and euthanasia chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For euthanasing the mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-luciferase reporter assay kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1960</td>
			<td>For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&39;s phosphate buffered saline</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>TS1006</td>
			<td>For PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-406</td>
			<td>Used to dilute trypsin for tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS 100% US origin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97068-085</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fujifilm LAS-3000 gel imager</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td></td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH(14C10) Rabibit mAb</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2118</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP conjugate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>31460</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human embryonic kidney cells, HEK-293FT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R70007</td>
			<td>Cell line used for packging virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone DMEM/High clucose</td>
			<td>GE Healthcare life sciences</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B, Ultra Pure Grade</td>
			<td>VWR Ameresco</td>
			<td>97064-810</td>
			<td>For antibiotic selection of infected cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td></td>
			<td>For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imagej</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for image analysis of lung metastases: threshold set to 25 &#38; 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immuno-Blot PVDF Membrane</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1620177</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For mouse anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System (in vivo live animal imaging device)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>CLS136340</td>
			<td>For in vivo imaging of metastatic burden</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M205 FA &#38; Lecia DCF3000 G (GFP and bright field filters)</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Microscope and camera for visualing, counting and taking pcitures of metastases in the lungs; 10X magnifacation, 3.5 sec exposure, 1.4 gain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>L3000008</td>
			<td>For YAP/TAZ-TEAD reporter transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image 3.2 (image software program)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Software for IVIS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse breast cancer cells, 4T1</td>
			<td>Karmanos Cancer Institute</td>
			<td>Aslakson, CJ et al.,1992</td>
			<td>Mouse metastatic breast cance cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Gauge version 3.0</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td></td>
			<td>Software for quantifying western blot band intensity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM (transfection buffer)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-062</td>
			<td>For packaging virus and transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA protein assay kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td>For quantifying protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Phosphatase Inhibitor Mini Tablets</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32957</td>
			<td>Added to cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32953</td>
			<td>Added to cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene (hexadimethrine bromide)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>45-H9268</td>
			<td>For infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>45-P7255</td>
			<td>For antibiotic selection of infected cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent restrainer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For restraining mice during tail vein injeciton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE running buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAZ (V3886) Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4883</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBST buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20 automated cell counter</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>For counting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See Table 1 for complete list of vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89404-464</td>
			<td>For visualizing fluorescence in ZSGreen labeled cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western transfer buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XenoLight D-Luciferin K+ Salt</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>122799</td>
			<td>Substrate injected into mice for in vivo bioluminescent IVIS images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (lipid solution for transfection)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6365787001</td>
			<td>For packaging virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YAP (D8H1X) XP Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>14074</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combined use of tail vein metastasis assays and real-time in vivo imaging to quantify breast cancer metastatic colonization and burden in the lungs

Metastaser är den främsta orsaken till cancerrelaterade dödsfall och det finns begränsade terapeutiska alternativ för patienter med metastaserad sjukdom. Identifiering och testning av nya terapeutiska mål som underlättar utvecklingen av bättre behandlingar för metastaserande sjukdom kräver prekliniska in vivo-modeller. Demonstreras här är en uterustransplantat musmodell för testmetoder bröstcancer metastaserande kolonisering och efterföljande tillväxt. Metastaserande cancerceller är stabilt omvandlas med virala vektorer kodning Firefly luciferas och zsgreen proteiner. Kandidatgener är då stabilt manipulerade i luciferase/ZsGreen-uttrycker cancerceller och sedan cellerna injiceras i möss via laterala svans ven till assay metastaserande kolonisering och tillväxt. En in vivo bild anordning används sedan för att mäta bioluminescens eller fluorescens av tumörcellerna i de levande djuren för att kvantifiera förändringar i metastatisk börda över tiden. Uttrycket av fluorescerande protein gör att antalet och storleken av metastaser i lungorna som skall kvantifieras i slutet av experimentet utan behov av snittning eller histologisk färgning. Detta tillvägagångssätt erbjuder ett relativt snabbt och enkelt sätt att testa rollen av kandidaten gener i metastaserad kolonisering och tillväxt, och ger en hel del mer information än traditionella svans venen metastaser analyser. Med hjälp av denna metod, visar vi att samtidig knockdown av Ja associerade protein (YAP) och transkriptionella Co-aktivator med en PDZ-bindande motiv (TAZ) i bröstcancerceller leder till minskad metastaserande börda i lungorna och att denna minskade börda är resultatet av signifikant försämrad metastaserad kolonisering och minskad tillväxt av metastaser.

För att demonstrera ovanstående tillvägagångssätt utförde vi ett proof of Concept-experiment där en kritisk replikeringsfaktor, RPA3 slogs ned i en metastaserad mus bröstcancer cellinjer (4T122). Medan protokollet beskriver märkning cellerna med både luciferas och fluorescerande proteiner före genetisk manipulation, vi använde en modifierad metod eftersom RNAi vektorer också leverera zsgreen (figur 2a). Först, 4T1 celler var stabilt sens...

Watch this Scientific Journal Video about Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs at JoVE.co

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs (Video) | JoVE

Den beskrivna metoden kombinerar experimentella svans vener metastaser analyser med in vivo levande djur avbildning för att möjliggöra realtidsövervakning av bröstcancer metastaser bildning och tillväxt utöver kvantifiering av metastaser antal och storlek i lungorna.

Kombinerad användning av Stjärtvenmetastaser-analyser och real tids in vivo-avbildning för att kvantifiera bröst cancer metastaserande kolonisering och börda i lungorna

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Vårt protokoll kan användas för att snabbt och enkelt testa vilken roll någon kandidat gen i metastaserande kolonisering och tillväxt. Protokollet tillåter också realtime övervakning av metastasering, bildning, och tillväxt, samt kvantifiering av metastasering antal och storlek i samma djur utan behov av samband eller histologiska färgning. Plate fyra T1 celler på 150, 000 celler per brunn i en 12-brunnsplatta i komplett tillväxt media.Inkubera vid 37 grader Celsius 5%koldioxid över natten. Nästa dag aspirerar tillväxtmedierna från cellerna. Lägg till 500 mikroliter av luciferas viral supernatant och 500 mikroliter av fluorescerande protein viral supernatant för att samtidigt infektera cellerna med både luciferas och fluorescerande protein virala supernatanter.Lägg sedan till en mikroliter på åtta milligram per milliliter hexadimetrinbromid och inkubera vid 37 grader Celsius och 5%koldioxid i 24 till 48 timmar. Trypsinize de fyra T1-cellerna med 500 mikroliter trypsin. Efter två till fem minuter, överför alla celler till en sex centimeter skål i fyra milliliter urvalsmedia, och därigenom släcka trypsin.Efter att urvalet är klart, bekräfta att de infekterade fyra T1-celler uttrycker ZsGreen fluorescerande protein med hjälp av en inverterad fluorescerande mikroskop vid 50 till 100 gånger förstoring. Också bekräfta att de infekterade fyra T1-celler uttrycker luciferas med hjälp av en kommersiellt tillgänglig luciferas aktivitet kit. Fortsätt med att utföra optimering av den experimentella in vivo-designen enligt beskrivningen i textprotokollet.Aspirera media och skölj cellplattorna med 1X PBS. Trypsinize cellerna med fem milliliter trypsin per 15 centimeter plattan i två till fem minuter och överföra alla celler till ett koniskt rör. Tvätta återstående celler från vävnadskulturen skålen med tillräckligt komplett tillväxt media för att släcka trypsin.Lägg tvätten till samma koniska röret. Räkna cellerna med hjälp av en automatiserad cellräknare för att bestämma det totala cellnumret. Därefter centrifugcellerna vid 122 gånger G i tre minuter, och aspirera supernatanten.Åter avbryta cellerna i 1X PBS vid önskad koncentration. Här injiceras 25 000 celler i varje mus och 100 mikroliter PBS. Så de åter upphängda cellerna är på 250, 000 celler per milliliter.Håll cellupphängningar på is tills injektion. Arbeta i en huva vid djuranläggningen, blanda försiktigt men noggrant cellerna genom att vända röret in eller använda en milliliter spruta för att säkerställa att de är enhetligt åter upphängda. Nu, ladda en en milliliter Luer Lås spruta med cellfjädringen och utvisa överflödiga luftbubblor.Placera en halv tum 30 gauge nål på sprutan med avfasningen upp och utvisa luftbubblor. Placera försiktigt musen i en gnagarhåll. Den laterala svansvenen bör vara synlig och dilaterad.Om inte, försiktigt nypa basen av svansen och doppa svansen i varmt kranvatten för att vidga venerna. Använd en alkohol torka för att rengöra svansen, sedan sätta in nålen i svansvenen, avfasning sida upp, och injicera 100 mikroliter cell suspension. Om nålen sätts in ordentligt i venen, ska den lätt glida något framåt och bakåt, och det bör inte finnas motstånd när kolven trycks.Framgångsrika injektioner bör också resultera i en färg där den blå färgen på venen blir vit i några sekunder efter injektionen. Ta långsamt bort nålen, och med hjälp av en steril gasbinda, utöva tryck på injektionsstället för att stoppa blödning. Returnera musen till sin bur och övervaka i 15 minuter för att säkerställa full återhämtning.Slå på den in vivo levande djur imaging enhet, öppna bildprogramvara, och logga in. Klicka på knappen initiera och vänta tills maskinen initieras. Ändra synfältet till D.För första gången använda, redigera exponeringsinställningar genom att klicka på redigera, preferenser, förvärv och automatisk exponering.Ändra den maximala exponeringstiden från standard 60 sekunder till 300 sekunder och klicka på okej. Ladda en en milliliter spruta med D-luciferin, tillsätt sedan en halv tum 30 gauge nål till sprutan och utvisa luftbubblor. Mät och registrera massan av en sövd mus.Håll fast musen genom att nypa halsens scruff med hjälp av tummen och pekarfingrarna och greppa svansen mellan lillfingret och basen av handen. Invertera musen i 45 graders vinkel med huvudet pekande nedåt. Sätt in nålen, avfasa sidan uppåt, i musens vänstra sida IP-utrymme.Bekräfta inträdet i IP-utrymmet genom att dra tillbaka en liten volym. Det bör inte vara färg vid nålens bas när du drar tillbaka i IP-utrymmet. Injicera lämplig volym av D-luciferin för en dos på 150 milligram per kilogram.Omedelbart efter D-luciferin administration, starta en timer. Placera musen platt på ryggen i bildåtergivningsapparaten med näsan i noskonen och se till att en halv till två och en halv procent isofluran administreras. Klicka på de självlysande lådorna och fotografierna.Ändra exponeringstiden för auto och klicka sedan på anskaffa i anskaffningskontrollpanelen. Efter bildtagning, returnera musen till sin bur och övervaka i 15 minuter för att säkerställa full återhämtning. Efter dödshjälp, som beskrivs i textprotokollet, isolera och ta bort lungorna från varje mus och skölj i 1X PBS för att avlägsna överflödigt blod.Förvärva bilder av ZsGreen metastaser i lober på 10X i Brightfield och fluorescens med hjälp av ett fluorescerande stereoscope med ett GFP brett bandfilter. Använd bildanalysprogramvara för att kvantifiera storlek och antal metastaser från bilderna. För att bearbeta och analysera data från bilderna som förvärvats med in vivo levande djur bildhantering enhet, öppna alla bildfiler för varje mus i bildprogramvaran.Se till att enheterna är i radiance för bioluminescerande data och effektivitet för fluorescerande data genom att klicka på pilen längst upp till vänster i bildfönstret och ändra den till lämplig enhet. Använd bilden från den senaste tidspunkten för att skapa en region av intresse, eller ROI, genom att först klicka på ROI-verktyg i fönstret med verktygspaletten. Sätt sedan in en ROI genom att klicka på pilen och välja en.Klicka på gränsen till ROI och flytta den över till bröstet av musen. Justera storleken på ROI så det täcker bröstet av musen och utesluter inte signal. Klicka sedan på mått-ROIs och kopiera eller skriv råtalet i ett Excel-ark.Rita och analysera data enligt beskrivningen i textprotokollet. Högerklicka i bildfilen för att kopiera avkastningen på investeringen, sedan klistra in den i bildfiler från de andra tidpunkterna och klicka på mått-ROIs. Retroviral vektor uttrycker tandem miR-30-baserade shRNAs inriktning både YAP och TAZ minskar YAP och skatt protein uttryck och transkriptionell aktivitet i fyra T1 celler.Fyra T1 luciferas celler var stably transduced med en ZsGreen uttrycker version av denna tandem YAP/TAZ shRNA vektor eller en kontrollerad miR-30-baserade shRNA. Bioluminescerande bilder visar att den hastighet med vilken metastaserande börda ökade var betydligt snabbare hos mössen som injicerades med kontrollceller jämfört med mössen som injicerades med YAP/TAZ knockdown-celler. En tomt av log10 omvandlas luciferas signal mätt för varje mus under loppet av experimentet visar också att hastigheten var snabbare i möss injiceras med kontrollceller jämfört med möss injiceras med YAP / TAZ knockdown celler.Betydligt färre metastaser som bildas i mössen som injiceras med YAP/TAZ-knockdown-cellerna jämfört med möss med kontrollceller när de räknas manuellt. Samma trend observerades vid användning av programvaran för bildanalys. Inte nog med att många fler metastaser bildas i kontrollmössen, utan de var i allmänhet större.Konsekvent, den ögonbevarande bördan i lungorna var också drastiskt minskas av YAP/TAZ knockdown. Framgångsrik injektion av lika många friska celler i varje mus är avgörande för att säkerställa data av hög kvalitet. Kom ihåg att vara försiktig och följa säkerhetsriktlinjer när du arbetar med smittsamma retrovirus och lentivirus, särskilt om virusen är mänskliga smittsamma.Denna teknik har gjort det möjligt för oss att illustrera rollerna för kandidatgener och metastaserande kolonisering och tillväxt, vilket ger ett sätt att identifiera och testa nya terapeutiska mål för behandling av metastaserande sjukdom. Efter detta förfarande kan metastaser som innehåller lungor analyseras ytterligare genom immunofluorescerande eller histologisk färgning för att undersöka hur den förändrade genen påverkar metastaser och identifiera andra proteiner som kan vara inblandade.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis

Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis (Video) | JoVE

Intra-iliaca Injection för effektiv och selektiv Modellering av Mikroskopisk skelettmetastaser

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely ...

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion (Video) | JoVE

Coculture Analyser för att studera makrofager och mikroglia Stimulering av Glioblastoma Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones (Video) | JoVE

Advanced djurmodell av Colorectal metastas i Lever: avbildningsmetoder och egenskaper av metastaserande kloner

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer (Video) | JoVE

En portådern Injection modell för att studera levermetastaser av bröstcancer

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay (Video) | JoVE

Praktiska överväganden studera metastaserande lungcancer kolonisationen i osteosarkom med pulmonell metastas-analys

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment (Video) | JoVE

In Vivo EPR bedömning av pH, pO2, Redox Status, och koncentrationer av fosfat och glutation i den tumör mikromiljö

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment (Video) | JoVE

Micromanipulation av cirkulerande tumör celler för nedströms molekylär analys och metastatisk potentiell bedömning

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells (Video) | JoVE

Patologisk analys av lungmetastasering efter lateral svansveninjektion av tumörceller

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model (Video) | JoVE

Använda datorbaserad bildanalys för att förbättra kvantifiering av lung metastasering i 4T1 Bröstcancermodellen

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

Modeling Brain Metastasis Via Tail-Vein Injection of Inflammatory Breast Cancer Cells

Modeling Brain Metastasis Via Tail-Vein Injection of Inflammatory Breast Cancer Cells (Video) | JoVE

Modellering av hjärnmetastaser via svansveninjektion av inflammatoriska bröstcancerceller

Metastatic spread to the brain is a common and devastating manifestation of many types of cancer. In the United States alone, about 200,000 patients are ...