Name: combined use of tail vein metastasis assays and real-time in vivo imaging to quantify breast cancer metastatic colonization and burden in the lungs
Uploaded: 2019-12-19T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs at JoVE.co

Emily Norton'a viral enfeksiyonlara ve el yazmasının eleştirel okumaya yardımcı olduğu için teşekkür ederiz. Biz de akciğerlerde yeşil metastaz görüntü analizi ile yardım için akciğer ve Kate E. Tubbesing görüntüleri elde yardımcı olmak için Ryan Kanai teşekkür ederiz. Biz destek ve bu video hazırlanmasında yardım için hayvan araştırma tesisi personeli teşekkür ederiz. Bu çalışma, J.M.L.'ye (#CCR17477184) verilen Susan G. Komen Career Catalyst Grant tarafından desteklenmiştir.

Bu protokol farelerin ve biyolojik tehlikeli maddelerin kullanımını içerir ve ilgili kurumsal güvenlik komitelerinin onayını gerektirir. Burada açıklanan tüm in vivo çalışma Albany Tıp Koleji kurumsal hayvan bakım ve kullanım komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
NOT: Protokole genel bakış için Şekil 1'dekişema'ya bakın.
1. Gerekli tüm retrovirüslerin ve lentivirüslerin paketlenmesi
<p class="jove_con...

Yöntemin kritik adımları Belirli bir hücre hattı ve fare zorlanması için enjekte edilen hücre sayısını (adım 3) optimize etmek önemlidir, çünkü bu, oluşan metastaz sayısını ve deneyin uzunluğunu büyük ölçüde etkileyebilir. Çok fazla hücre enjekte edilirse veya metastazlar çok uzun süre büyürse, metastazların genetik manipülasyonun etkilerini değerlendirmek zorlaştıkça sayılması zor olabilir. Ancak, çok az hücre enjekte edilirse, az veya hiç metastaz oluşabil...

Kanser ölüm dünya çapında ikinci önde gelen nedeni olmaya devam etmektedir1 ve metastaz bu ölümlerin çoğunluğu sorumludur2,3. Ancak, metastatik kolonizasyon ve sonraki büyüme yöneten moleküler mekanizmaların sınırlı bir anlayış metastatik hastalık için etkili tedavilerin gelişimini engellemiştir. Yeni terapötik hedeflerin belirlenmesi, bir aday genin metastaz oluşumunu ve büyümesini nasıl etkilediğini test etmek için bir test gerektirir. Otokton fare modellerinin avantajları olsa da, zaman alıcı dır ve oluşturmak pahalıdır, bu da onları hedef bulma yerine hedef doğrulama için daha uygun hale getirir. Aday genin kanser hücrelerinde in vitro olarak tedirgin olduğu ve metastatik potansiyel üzerindeki etkilerinin in vivo olarak değerlendirildiği nakil modeli sistemleri, otokton modellere göre daha ucuz ve daha yüksek iş âldeki sistemlerdir. Buna ek olarak, RNAi, CRISPR/CAS9 ve transgenlerin istikrarlı teslimatı için viral vektörler yaygın olarak mevcuttur, bu da kanser hücresi hatlarında ilgi çeken hemen hemen her geni veya geni tedirgin etmeyi nispeten kolaylaştırır. Bu yaklaşım aynı zamanda insan kanser hücresi hatlarında metastatik kolonizasyon ve büyüme de immünozveya insanlaşmış fareler içine hücreleri naklederek aday genlerin rolünü titretmek için kullanılabilir.
Nakledilen kanser hücrelerinin in vivo tarafından metastaz oluşumunu test etmek için kullanılan iki tip tahlilssi spontan metastaz tahlilleri ve deneysel metastaz tahlilleridir. Spontan metastaz tahlillerinde4,5, kanser hücreleri farelere enjekte edilir, primer tümör oluşturmasına izin verilir, ve daha sonra spontan metastaz oluşumu ve sonraki büyüme tahlil edilir. Bu modelin gücü hücrelerin metastatik tümörler oluşturmak için metastatik sürecin tüm adımlarını tamamlamak gerekir. Ancak, birçok kanser hücre hatları spontan metastaz modellerinde verimli metastaz yok, ve primer tümör büyümesini etkileyen hücrelerin herhangi bir manipülasyon metastaz tahsin sonuçlarını şaşırtmak olabilir. Kanser hücrelerinin doğrudan dolaşıma enjekte edildiği deneysel metastaz tahlilleri bu tuzakları önlemek için kullanılır. Yaygın deneysel metastaz tahlilleri kuyruk ven enjeksiyonuiçerir 6,7,8 (ve burada gösterilmiştir), intrakardiyak enjeksiyon9, ve portal venenjeksiyonu 10.
Burada sunulan protokolün amacı, bir araştırmacının metastaz oluşumunu ve büyümesini gerçek zamanlı olarak izlemesine olanak tanıyan in vivo deneysel metastaz testi sağlamak ve aynı farenin akciğerlerindeki nokta metastaz sayısını ve boyutunu ölçmektir. Bunu başarmak için, geleneksel deneysel kuyruk ven metastaz tahlilleri6,7,8 canlı hayvan görüntüleme ile birleştirilir, in vivo görüntüleme cihazı kullanarak9,11,12,13,14. Hem luciferase hem de floresan proteini ifade eden tümör hücreleri lateral kuyruk damarı ile farelere enjekte edilir ve daha sonra in vivo görüntüleme cihazı zamanla akciğerlerdeki metastatik yükteki değişiklikleri ölçmek için kullanılır(Şekil 1). Ancak, in vivo canlı hayvan görüntüleme cihazı ayırt edemez veya bireysel metastaz boyutunu ölçmek. Bu nedenle, deney sonunda, bir floresan stereomikroskop sayısını saymak ve kesit ve histoloji veya immünohistokimya gerek kalmadan akciğerlerde floresan metastaz boyutunu ölçmek için kullanılır(Şekil 1). Bu protokol, aday genin ekspresyonunun veya işlevinin değiştirilmesinin metastaz oluşumunu ve büyümeyi nasıl etkilediğini test etmek için kullanılabilir. Küçük moleküller veya fonksiyon bloke antikorlar gibi potansiyel terapötik bileşikler de test edilebilir.
Bu yaklaşımı göstermek için, ilk olarak metastatik fare meme kanseri hücrelerinde temel replikasyon faktörü olan replikasyon proteini A3'ün (RPA3) yıkıldığı kavram deneyinin bir kanıtını gerçekleştirdik. RPA3 nakavt hücreleri enjekte edilen farelerin kontrol hücreleri ile enjekte edilen farelere kıyasla her zaman önemli ölçüde daha az metastatik yüke sahip olduğunu gösteriyoruz. Metastaz içeren akciğerlerin analizi, bu azalan metastatik yükün metastatik kolonizasyonun önemli ölçüde azalması ve oluşan metastazların büyüme bozukluğunun bir sonucu olduğunu göstermektedir. Bu tekniği daha da göstermek için, EVET ilişkili proteinin (YAP) ve transkripsiyonel koaktivatörün PDZ bağlayıcı motifli (TAZ) aynı anda yıkılması metastatik kolonizasyonu mu yoksa sonraki büyümeyi mi bozduğunu test ettik. YAP ve TAZ, Hippo Pathway'in kritik downstream efektörleri olan iki ilgili transkripsiyonel ko-aktivatörlerdir. Biz15,16 ve diğerleri metastaz YAP ve TAZ karıştığı var(17içinde gözden ,18,19),Bu proteinleriyi tedavi hedefleri olduğunu düşündüren. Sürekli olarak, YAP/TAZ nakavt hücrelerine enjekte edilen farelerin metastatik yükü önemli ölçüde azalttığını gördük. Akciğerlerin analizi YAP/TAZ knockdown hücrelerinin çok daha az metastaz oluşturduğunu ve oluşan metastazların daha küçük olduğunu gösterdi. Bu deneyler, deneysel metastaz tahlillerinin bir araştırmacının metastaz oluşumu ve büyümesinde aday genin rolünü hızlı ve ucuz bir şekilde test etmesine nasıl olanak sağladığını göstermektedir. Ayrıca canlı hayvan görüntüleme ve tüm akciğerlerde metastaz floresan nicel kombine kullanımı nın araştırmacının metastatik kolonizasyon sırasındaki adımları daha iyi anlamasına nasıl olanak sağladığını göstermektedir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% SDS-PAGE Gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td>Trypsin for tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat bottom white assay plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3922</td>
			<td>For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol wipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For sterolizing the injection site before tail vein injecitons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/C mice (female, 6 weeks)</td>
			<td>Taconic</td>
			<td>BALB-F</td>
			<td>For tail vein metastatic colonization and burden assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA regular</td>
			<td>VWR Ameresco</td>
			<td>97061-416</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lysis buffer</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td></td>
			<td>For collecting protien samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celltreat Syringe Filters, PES 30mm, 0.45 &#956;m</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>40-229749-CS</td>
			<td>For filtering viral supernatant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 and euthanasia chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For euthanasing the mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-luciferase reporter assay kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1960</td>
			<td>For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&39;s phosphate buffered saline</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>TS1006</td>
			<td>For PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-406</td>
			<td>Used to dilute trypsin for tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS 100% US origin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97068-085</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fujifilm LAS-3000 gel imager</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td></td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH(14C10) Rabibit mAb</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2118</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP conjugate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>31460</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human embryonic kidney cells, HEK-293FT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R70007</td>
			<td>Cell line used for packging virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone DMEM/High clucose</td>
			<td>GE Healthcare life sciences</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B, Ultra Pure Grade</td>
			<td>VWR Ameresco</td>
			<td>97064-810</td>
			<td>For antibiotic selection of infected cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td></td>
			<td>For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imagej</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for image analysis of lung metastases: threshold set to 25 &#38; 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immuno-Blot PVDF Membrane</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1620177</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For mouse anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System (in vivo live animal imaging device)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>CLS136340</td>
			<td>For in vivo imaging of metastatic burden</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M205 FA &#38; Lecia DCF3000 G (GFP and bright field filters)</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Microscope and camera for visualing, counting and taking pcitures of metastases in the lungs; 10X magnifacation, 3.5 sec exposure, 1.4 gain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>L3000008</td>
			<td>For YAP/TAZ-TEAD reporter transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image 3.2 (image software program)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Software for IVIS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse breast cancer cells, 4T1</td>
			<td>Karmanos Cancer Institute</td>
			<td>Aslakson, CJ et al.,1992</td>
			<td>Mouse metastatic breast cance cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Gauge version 3.0</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td></td>
			<td>Software for quantifying western blot band intensity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM (transfection buffer)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-062</td>
			<td>For packaging virus and transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Component of complete growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA protein assay kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td>For quantifying protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Phosphatase Inhibitor Mini Tablets</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32957</td>
			<td>Added to cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32953</td>
			<td>Added to cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene (hexadimethrine bromide)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>45-H9268</td>
			<td>For infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>45-P7255</td>
			<td>For antibiotic selection of infected cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent restrainer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For restraining mice during tail vein injeciton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE running buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAZ (V3886) Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4883</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBST buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20 automated cell counter</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>For counting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See Table 1 for complete list of vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89404-464</td>
			<td>For visualizing fluorescence in ZSGreen labeled cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western transfer buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XenoLight D-Luciferin K+ Salt</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>122799</td>
			<td>Substrate injected into mice for in vivo bioluminescent IVIS images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (lipid solution for transfection)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6365787001</td>
			<td>For packaging virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YAP (D8H1X) XP Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>14074</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combined use of tail vein metastasis assays and real-time in vivo imaging to quantify breast cancer metastatic colonization and burden in the lungs

Metastaz kansere bağlı ölümlerin ana nedenidir ve metastatik hastalığı olan hastalar için sınırlı tedavi seçenekleri vardır. Metastatik hastalık için daha iyi tedavilerin geliştirilmesini kolaylaştıracak yeni tedavi hedeflerinin tanımlanması ve test edilmesi, in vivo modellerinde preklinik preklinik gerektirir. Burada gösterilen meme kanseri metastatik kolonizasyon ve sonraki büyüme atamak için bir syngeneic fare modelidir. Metastatik kanser hücreleri, ateş böceği luciferase ve ZsGreen proteinlerini kodlayan viral vektörlerle şantiye edilir. Aday genler daha sonra koably luciferase / ZsGreen ifade kanser hücrelerinde manipüle edilir ve daha sonra hücreler metastatik kolonizasyon ve büyüme saymak için lateral kuyruk damarı ile fareleriçine enjekte edilir. Bir in vivo görüntüleme cihazı daha sonra zaman içinde metastatik yük değişiklikleri ölçmek için canlı hayvanlarda tümör hücrelerinin biyolüminesans veya floresan ölçmek için kullanılır. Floresan proteinin ekspresyonu, deney sonunda kesit veya histolojik boyama ya da metastaz gerekkalmadan akciğerlerdeki metastazların sayısının ve boyutunun ölçülmesine olanak tanır. Bu yaklaşım, metastatik kolonizasyon ve büyüme aday genlerin rolünü test etmek için nispeten hızlı ve kolay bir yol sunuyor, ve geleneksel kuyruk ven metastazı tahlilleri çok daha fazla bilgi sağlar. Bu yaklaşımı kullanarak, meme kanseri hücrelerinde PDZ bağlayıcı motifli (TAZ) ile Evet ilişkili protein (YAP) ve transkripsiyonel koaktivatörün aynı anda yıkılması nın akciğerlerde metastatik yükün azalmasına yol açtığını ve bu azaltılmış yükün metastatik kolonizasyonun ve metastazların büyümesinin azalmasısonucu olduğunu göstermektedir.

Yukarıdaki yaklaşımı göstermek için, kritik bir çoğaltma faktörü olan RPA3'ün metastatik fare meme karsinomu hücre hattında (4T122)yıkıldığı bir kavram deneyinin kanıtını gerçekleştirdik. Protokol, hücrelerin genetik manipülasyondan önce hem luciferase hem de floresan proteinlerle etiketlendiğini açıklarken, rnai vektörleri de ZsGreen'i teslim ettiği için modifiye edilmiş bir yaklaşım kullandık (Şekil 2A). İlk ola...

Watch this Scientific Journal Video about Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs at JoVE.co

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Açıklanan yaklaşım, akciğerlerdeki metastaz sayısı ve boyutunun ölçülmesine ek olarak meme kanseri metastazı oluşumunun ve büyümesinin gerçek zamanlı olarak izlenmesine olanak sağlamak için deneysel kuyruk ven metastazı tahlillerini in vivo canlı hayvan görüntülemeile birleştirir.

Kuyruk Ven Metastaz Tahlilleri ve Gerçek Zamanlı Vivo Görüntüleme Kombine Kullanımı Meme Kanseri Metastatik Kolonizasyon ve Yük Akciğerlerde Quantify için

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Protokolümüz metastatik kolonizasyon ve büyüme de herhangi bir aday genin rolünü hızlı ve kolay bir şekilde test etmek için kullanılabilir. Protokol aynı zamanda metastaz, oluşum ve büyümenin gerçek zamanlı olarak izlenmesine ve aynı hayvanlarda metastaz sayısı nın ve büyüklüğünün rezeksiyon veya histolojik boyamaya gerek kalmadan ölçülmesine olanak sağlar. Plaka dört T1 hücreleri 150, 000 hücreleri iyi başına 12-iyi plaka tam büyüme ortamı.Bir gecede 37 santigrat derecede %5 karbondioksit le kuluçkaya yat. Ertesi gün, hücrelerden büyüme ortamı aspire. Aynı anda hem luciferase ve floresan protein viral supernatants ile hücreleri enfekte etmek için luciferase viral supernatant ve floresan protein viral supernatant 500 mikrolitre ekleyin.Daha sonra, mililitre hekaksimethrine bromür başına sekiz miligram bir mikrolitre ekleyin ve 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit 24 ila 48 saat için kuluçka. Dört T1 hücresini 500 mikrolitre tripsin ile deneyin. İki ila beş dakika sonra, seçim medya dört mililitre içinde altı santimetre lik bir çanak için tüm hücreleri aktarın, bu nedenle trippsin söndürme.Seçim tamamlandıktan sonra, enfekte dört T1 hücreleri 50 ila 100 kez büyütme bir ters floresan mikroskop kullanarak ZsGreen floresan protein ifade olduğunu onaylayın. Ayrıca enfekte dört T1 hücreleri bir ticari luciferase aktivite kiti kullanarak luciferase ifade olduğunu onaylayın. Metin protokolünde açıklandığı gibi in vivo deneysel tasarımın optimizasyonunu gerçekleştirmeye devam edin.Ortamı aspire edin ve hücre plakalarını 1X PBS ile durula. Hücreleri 15 santimetre lik plaka başına beş mililitre tripsin ile 2-5 dakika boyunca deneyin ve tüm hücreleri konik bir tüpe aktarın. Tripsini söndürmek için yeterli tam büyüme ortamı ile doku kültürü çanak kalan hücreleri yıkayın.Yıkamayı aynı konik tüpe ekleyin. Toplam hücre sayısını belirlemek için otomatik hücre sayacı kullanarak hücreleri say. Daha sonra hücreleri 122 kez G'de üç dakika santrifüj edin ve süpernatantı aspire edin.İstenilen konsantrasyonda 1X PBS'deki hücreleri yeniden askıya alın. Burada, her fareye 25.000 hücre ve 100 mikrolitre PBS enjekte ediliyor. Yani yeniden askıya alınan hücreler mililitrebaşına 250.000 hücrede.İğne yenene kadar hücre süspansiyonlarını buzda tutun. Hayvan tesisinde bir başlık içinde çalışan, yavaşça ama iyice tüp ters veya tek bir mililitre şırınga kullanarak eşit olarak yeniden askıya olduğundan emin olmak için hücreleri karıştırın. Şimdi, hücre süspansiyonu ile bir mililitre Luer Lock şırınga yükleyin ve aşırı hava kabarcıkları sınırdışı.Yarım inç 30 gauge iğne yiyiş yukarı ve hava kabarcıkları dışarı ile şırınga yerleştirin. Fareyi nazikçe bir kemirgen dizginleyiciye yerleştirin. Lateral kuyruk damarı görünür ve genişlemiş olmalıdır.Değilse, yavaşça kuyruk tabanı çimdik ve damarları dilate için sıcak musluk suyuna kuyruk daldırma. Kuyruk temizlemek için bir alkol silme kullanın, sonra kuyruk damar içine iğne eklemek, yukarı eğimli tarafı, ve hücre süspansiyon 100 mikrolitre enjekte. İğne damara düzgün bir şekilde yerleştirilirse, kolayca ileri ve geri kaydırmalı ve piston itildiğinde direnç olmamalıdır.Başarılı enjeksiyonlar da hangi ven mavi renk enjeksiyondan sonra birkaç saniye için beyaz döner bir floş neden olmalıdır. Yavaş yavaş iğne kaldırmak ve steril bir gazlı bez kullanarak, herhangi bir kanamayı durdurmak için enjeksiyon bölgesine basınç uygulayın. Tam iyileşmesağlamak için fareyi kafesine ve monitöre 15 dakika döndürün.In vivo canlı hayvan görüntüleme cihazını açın, görüntü yazılımını açın ve oturum açın. Başlatma düğmesini tıklatın ve makinenin başlatılmasını bekleyin. Görünüm alanını D.İlk kez kullanım için değiştirin, düzenleme, tercihler, edinim ve otomatik pozlama'yı tıklatarak pozlama ayarlarını düzenlemeyi tıklatın.Varsayılan 60 saniyeden 300 saniyeye maksimum pozlama süresini değiştirin ve tamam'ı tıklatın. D-luciferin ile bir mililitreşşü yükle, sonra şırınga için yarım inç 30 gauge iğne ekleyin ve hava kabarcıkları kovmak. Anestezili farenin kütlesini ölçün ve kaydedin.Başparmak ve işaretçi parmaklarını kullanarak boynun ensesini çimdikleyerek ve serçe parmağın ve elin tabanı arasındaki kuyruğu kavrayarak fareyi dizginle. Fareyi 45 derecelik bir açıyla ters çevirin ve başı aşağıya doğru işaret edin. İğneyi, eğimli tarafı yukarı, farenin sol tarafındaki IP boşluğuna yerleştirin.Küçük bir hacim çizerek IP alanına girişi onaylayın. IP alanında geri çekerken iğnenin tabanında renk olmamalıdır. Kilogram başına 150 miligram doz için Uygun D-luciferin hacmini enjekte edin.D-luciferin yönetiminden hemen sonra, bir zamanlayıcı başlatın. Fareyi burun konisinde burnu olan görüntüleme cihazında sırtüstü yerleştirin ve yüzde bir buçuk isofluran uygulandığından emin olun. Parlak ve fotoğraf kutuları tıklatın.Pozlama süresini otomatik olarak değiştirin ve ardından edinme denetim panelinde edinme'yi tıklatın. Görüntülemeden sonra, tam iyileşmesağlamak için fareyi kafesine ve monitöre 15 dakika döndürün. Ötenaziden sonra, metin protokolünde açıklandığı gibi, fazla kanı çıkarmak için her fareden akciğerleri izole edin ve 1X PBS ile durulayın.Bir GFP geniş bant filtresi ile floresan stereoskop kullanarak Brightfield ve floresan 10X de loblarda ZsGreen metastaz görüntüleri edinin. Görüntülerdeki metastazların boyutunu ve sayısını ölçmek için görüntü analizi yazılımını kullanın. In vivo live animal imaging cihazı ile elde edilen görüntülerden elde edilen verileri işlemek ve analiz etmek için, görüntü yazılımındaki her fare için tüm görüntü dosyalarını açın.Ünitelerin, görüntü penceresinin sol üst kısmındaki oku tıklatArak ve uygun birime değiştirerek, floresan veriler için biyolüminesans veri ve verimlilik açısından parlaklıkta olduğundan emin olun. Araç paleti penceresindeki Yatırım Getirisi araçlarını ilk tıklatarak ilgi çekici bir bölge veya YG oluşturmak için son zaman noktasındaki görüntüyü kullanın. Ardından, oku tıklatıp bir tane sini seçerek bir yg' ekleyin.YG'nin kenarlığı'nı tıklatın ve farenin göğsüne taşıyın. Farenin göğsünü kaplayabilmesi ve sinyali dışlamaması için YG'nin boyutunu ayarlayın. Ardından, ROI'ları ölçün ve ham sayıyı bir Excel sayfasına kopyalayın veya yazın.Metin protokolünde açıklandığı gibi verileri çizin ve analiz edin. YG'yi kopyalamak için resim dosyasına sağ tıklayın, ardından diğer zaman noktalarından resim dosyalarına yapıştırın ve ÖLÇÜM ROI'larını tıklatın. Hem YAP hem de TAZ'ı hedefleyen miR-30 tabanlı shRNA'ları ifade eden retroviral vektör, dört T1 hücrede YAP ve vergi protein ekspresyonu ve transkripsiyonel aktiviteyi azaltır.Dört T1 luciferase hücresi, bu tandem YAP/TAZ shRNA vektörünün veya kontrollü miR-30 tabanlı shRNA'nın ZsGreen ekspresversiyonu ile birlikte transe geçirildi. Biyolüminesans görüntüler, kontrol hücreleri enjekte edilen farelerde yap/TAZ nakavt hücrelerine enjekte edilen farelere kıyasla metastatik yükün artma hızının önemli ölçüde daha hızlı olduğunu göstermektedir. Deney boyunca her fare için ölçülen log10 dönüştürülmüş luciferase sinyalinin bir çizimi, KONTROL hücreleri ile enjekte edilen farelerde YAP/TAZ nakavt hücrelerine enjekte edilen farelere kıyasla oranın daha hızlı olduğunu da göstermektedir.YAP/TAZ nakavt hücrelerine enjekte edilen farelerde elle sayıldığında kontrol hücreleri olan farelere göre önemli ölçüde daha az metastaz oluşmuştur. Aynı eğilim görüntü analizi yazılımı kullanırken gözlendi. Sadece kontrol farelerde çok daha fazla metastaz formu yaptı, ama genellikle daha büyüktü.Sürekli olarak, akciğerlerdeki metastatik yük de YAP/TAZ'ın yıkılması ile büyük ölçüde azaltıldı. Yüksek kaliteli veri sağlamak için her fareye eşit sayıda sağlıklı hücrenin başarılı bir şekilde enjekte edilmesini sağlamak çok önemlidir. Özellikle virüsler insan bulaşıcıise, bulaşıcı retrovirüsler ve lentivirüslerle çalışırken dikkatli olmayı ve güvenlik yönergelerine uymayı unutmayın.Bu teknik bize aday genler ve metastatik kolonizasyon ve büyüme rollerini göstermek için izin verdi, tanımlamak ve metastatik hastalığın tedavisi için yeni terapötik hedefleri test etmek için bir yol sağlayan. Bu prosedürü takiben, akciğerleri içeren metastazlar, değiştirilmiş genin metastazları nasıl etkilediğini araştırmak ve dahil olabilecek diğer proteinleri belirlemek için immünfloresans veya histolojik boyama ile daha fazla analiz edilebilir.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis

Mikroskopik Kemik Metastazı Verimli ve Seçici Modelleme için intra-iliak arter Enjeksiyon

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely ...

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Coculture Tahliller Glioblastoma Invasion Makrofaj ve Mikroglia Stimülasyon Eğitim için

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

İleri Hayvan Karaciğer Kolorektal Metastaz Model: Görüntüleme Teknikleri ve Metastatik Klonların Özellikleri

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

İşlevsel Genomik Tarama kullanılması Kanser Hücre Sfero Kültürleri Potansiyel Yeni İlaç Hedefleri Belirlemek İçin

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Bir Portal Ven Enjeksiyon Modeli Karaciğer Metastazı Meme Kanseri Eğitim için

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

Metastatik akciğer kolonizasyon pulmoner metastaz tahlil kullanarak osteosarkom içinde eğitim pratik düşünceler

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Akım moleküler Analizi ve metastatik potansiyel değerlendirme için sirkülasyon tümör hücrelerinin mikromanipülasyon

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Tümör Hücrelerinin Lateral Kuyruk-Damar Enjeksiyonu Sonrasında Akciğer Metastazının Patolojik Analizi

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

4T1 Meme Kanseri Modelinde Akciğer Metastazının Nicelleştirilmesini Geliştirmek Için Bilgisayar Tabanlı Görüntü Analizinin Kullanılması

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

Modeling Brain Metastasis Via Tail-Vein Injection of Inflammatory Breast Cancer Cells

İnflamatuar Meme Kanseri Hücrelerinin Kuyruk-Ven Enjeksiyonu ile Beyin Metastazının Modellenmesi

Metastatic spread to the brain is a common and devastating manifestation of many types of cancer. In the United States alone, about 200,000 patients are ...