Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Wellcome Trust (091549 a SG y 109093 / Z / 15 / A a SM), la subvención básica del Centro Wellcome Trust para Biología Celular (092076) y la Beca de Investigación Senior No Clínica del Consejo de Investigación Médica (MR / R008205 / 1 a SG), la Organización Europea de Biología Molecular bajo una beca postdoctoral a largo plazo (ALTF 1070-2017 a R.A.C), y el Fondo de Investigación Independiente de Dinamarca (T.H.J).

A. Langford y W. Worboys están afiliados a UVO3, una compañía comercial. No tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación e interpretación de datos, o la decisión de presentar el trabajo para su publicación.

El método χCRAC, combinado con los nuevos dispositivos de reticulación y recolección celular, tiene un gran potencial porque es aplicable a una amplia gama de organismos modelo y, por lo tanto, debería ser de interés general para el campo del ARN. Hay muchas áreas en las que se puede utilizar χCRAC. Por ejemplo, el método podría usarse para medir el ensamblaje jerárquico de proteínas en grandes complejos macromoleculares, como el espliceosoma y el ribosoma, que a menudo implica interacciones dinámicas entre proteínas y moléculas de ARN. Ahora también lo usamos rutinariamente para monitorear las interacciones entre los factores de descomposición del ARN y sus sustratos cuando las células están sujetas a diversos tipos de estrés. Esto nos permite determinar en qué etapa de la respuesta adaptativa estos factores son más activos, a qué sustratos se unen y qué tan dinámicas son estas interacciones. Estos datos deberían permitir a los investigadores determinar la contribución relativa de cada factor en la adaptación a los cambios ambientales.
χCRAC utiliza etiquetas de purificación de afinidad dual (HTF o HTP) para purificar la proteína en condiciones altamente estrictas y desnaturalizantes. Esto asegura que el ARN copurificado esté altamente enriquecido para los ARN que fueron reticulados covalentemente a la proteína de interés. Sin embargo, confiar en las etiquetas de afinidad tiene desventajas. Por ejemplo, la etiqueta podría interferir con la función de la proteína, lo que podría dar una lectura distorsionada de su interactoma de unión al ARN. Además, para algunos organismos modelo puede que no siempre sea posible utilizar etiquetas porque las herramientas genéticas para integrar fragmentos de ADN en el genoma o para transformar plásmidos de expresión aún no están disponibles. Sin embargo, es sencillo alterar algunas partes del protocolo χCRAC para hacerlo compatible con los protocolos basados en CLIP que dependen de anticuerpos para la purificación de la RBP. De hecho, este estudio demostró que es posible combinar purificaciones basadas en iCLIP con nuestro reticulante. Ahora estamos en el proceso de desarrollar protocolos CLIP para estudiar la asociación temporal de proteínas de unión al ARN humano con transcripciones de ARN nacientes.
Cuando se realiza χCRAC en una nueva proteína, la exposición a los rayos UV debe optimizarse para inducir la máxima reticulación. Esto es importante porque las altas exposiciones a los rayos UV pueden reducir la recuperación del ARN durante la etapa de purificación. Las células que expresaban la RBP recombinante fueron expuestas a varias dosis UV, 100 mJ/cm 2, 250 mJ/cm 2, 500 mJ/cm 2 y 1 J/cm 2. Los RNP fueron capturados y los RNAs fueron fragmentados y radiomarcados. Posteriormente, las RNP fueron resueltas por SDS-PAGE y se tomó un autoradiograma para deducir qué exposición daba la señal más intensa (es decir, la reticulación máxima).
Una vez optimizadas las condiciones experimentales, se recomiendan varios experimentos de control al realizar χCRAC. Primero, se puede usar una muestra irradiada con UV y sin etiquetar para monitorear la unión de fondo a las perlas de purificación. En segundo lugar, cuando se aplica χCRAC durante un experimento de turno, una segunda serie temporal en la que las células se desplazan de nuevo al medio original permite investigar si la filtración de las células en sí induce cambios en los niveles de ARN o en las interacciones proteína-ARN.
Como se mencionó en la Introducción, numerosos artículos publicados recientemente sugieren una serie de optimizaciones al protocolo CLIP. Esto incluye el uso de adaptadores marcados con fluorescencia para detectar el complejo proteína-ARN a través del escaneo infrarrojo10, así como optimizaciones para varios pasos de purificación de ácidos nucleicos y selección de tamaño que han demostrado aumentar la complejidad de las bibliotecas resultantes12,45. Actualmente estamos implementando algunas de estas mejoras para refinar aún más el protocolo χCRAC. El protocolo presentado aquí ya contiene una serie de mejoras a los protocolos CRAC y χCRAC originales que aumentan la complejidad de los datos. Por ejemplo, anteriormente, después de resolver los complejos radiactivos de proteína-ARN reticulados en geles SDS-PAGE, se transferían a una membrana de nitrocelulosa y el ARN reticulado se aislaba de la mancha. Sin embargo, la transferencia del RNP y la posterior extracción de ARN pueden ser muy ineficientes, particularmente cuando se trata de grandes RBP como las subunidades de ARN polimerasa. Esto puede resultar en una reducción significativa en la recuperación del ARN reticulado. En el protocolo actual, el ARN reticulado se extrae directamente de las rodajas de gel SDS-PAGE, como se ilustra en la Figura 1. Esto aumentó la recuperación de ARN reticulados. Además, después de la amplificación por PCR de los ADNc, el producto se resolvió originalmente en geles de agarosa al 3%, a baja temperatura de fusión, y luego se extrajeron productos de PCR de 175-300 pb del gel. Sin embargo, estos geles pueden sobrecargarse fácilmente, lo que resulta en una separación muy pobre del ADN. La sustitución de los geles de agarosa por geles TBE prefabricados dio como resultado una separación de tamaño más consistente y una mejor recuperación de los productos de PCR.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61027">Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using &#967;CRAC</a>. The Authors section was updated from:
Stuart W. McKellar1 
Ivayla Ivanova1 
Robert W. van Nues2 
Ross A. Cordiner3 
Will Worboys4 
Andrew Langford4 
Torben Heick Jensen3 
Sander Granneman1 
1Centre for Synthetic and Systems Biology, University of Edinburgh 
2Institute of Cell Biology, University of Edinburgh 
3Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 4UVO3 Ltd.
to:
Stuart W. McKellar1 
Ivayla Ivanova1 
Robert W. van Nues2 
Ross A. Cordiner3 
Mehak Chauhan1 
Niki&#160;Christopoulou1 
Will Worboys4 
Andrew Langford4 
Torben Heick Jensen3 
Sander Granneman1 
1Centre for Engineering Biology, University of Edinburgh 
2Institute of Cell Biology, University of Edinburgh 
3Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 4UVO3 Ltd.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61027">Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using &#967;CRAC</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using &#967;CRAC

Los ARN a menudo dependen de las RBP para ejercer su función, lo que ha llevado a un gran interés en comprender la dinámica entre estas moléculas. Se han identificado muchas prácticas comerciales restrictivas en una amplia variedad de organismos. Sin embargo, siempre ha sido notoriamente difícil estudiar las interacciones RBP-ARN in vivo. Un gran avance en el estudio de tales interacciones se produjo con la aparición de CLIP1. Este método utiliza irradiación ultravioleta (UV, 254 nm) para inducir enlaces covalentes entre las RBP y sus ARN directamente unidos (es decir, reticulación a distancia cero). Posteriormente, la RBP de interés se inmunopurifica bajo condiciones estrictas para garantizar que solo se identifiquen los ARN reticulados covalentemente a las proteínas. Los ARN unidos se digieren parcialmente con RNasas y posteriormente se convierten en bibliotecas de ADNc para su secuenciación. El alto rigor de purificación es importante ya que aumenta en gran medida la especificidad de la recuperación de proteínas y ARN, que también se mejora aún más a través de la purificación SDS-PAGE del complejo ribonucleoproteína reticulada (RNP). CLIP y métodos relacionados también proporcionan información sobre la resolución de nucleótidos en el sitio de unión a proteínas, porque durante la preparación de la biblioteca de secuenciación, los aminoácidos que se entrecruzan al ARN con frecuencia terminan la transcriptasa inversa o hacen que la enzima introduzca mutaciones en este sitio 1,2,3.
Desde su introducción, el protocolo CLIP original ha producido una notable variedad de metodologías derivadas. Un avance particularmente importante se produjo con el desarrollo de HITS-CLIP (o CLIP-seq), que combina la secuenciación de alto rendimiento con el enfoque CLIP3. Desde entonces, esto ha sido adoptado por todas las metodologías basadas en CLIP. iCLIP introdujo mejoras en las técnicas de recorte y ligadura de adaptadores mediadas por RNasa que facilitan un mapeo más preciso de los sitios de unión de RBP4. PAR-CLIP combinó el etiquetado de 4tio-uridina/uracilo con la reticulación a 365 nm, lo que permitió mapear sitios de reticulación mediante el análisis de sustituciones T-C5. CRAC, urea-iCLIP, dCLIP y uvCLAP introdujeron condiciones de desnaturalización y pasos de purificación de afinidad dual que reducen aún más la unión de fondo a la resina de afinidad y aumentan aún más la especificidad de la captura de proteínas 2,6,7,8,9. Además, CRAC, uvCLAP y dCLIP introdujeron el etiquetado del RBP de interés con una etiqueta de afinidad, superando así la necesidad de generar anticuerpos específicos.
También se han realizado varias optimizaciones para acelerar la metodología CLIP. El protocolo CLIP original utilizaba radiomarcaje de los ARN capturados para visualizar los complejos RBP-ARN después de SDS-PAGE. Sin embargo, el uso de la radiactividad puede ser problemático para los laboratorios que no están preparados para este tipo de trabajo. irCLIP incorpora un adaptador acoplado a fluoróforos que facilita la visualización a través de imágenes infrarrojas10 y sCLIP utiliza biotinilación de ARN capturados para visualizarlos a través de HRP11 conjugado con estreptavidina. Además, eCLIP renuncia por completo al etiquetado de ARN; En cambio, la proteína se extirpa basándose únicamente en su tamaño conocido12. La purificación basada en estreptavidina también se ha utilizado para acelerar el proceso de preparación de la biblioteca en FAST-iCLIP, donde un adaptador 3' biotinilado se liga a los ARN y se utiliza para permitir la purificación después de la transcripción inversa y la circularización13. Las mejoras adicionales al protocolo iCLIP también aumentaron considerablemente la complejidad de las bibliotecas4.
Finalmente, CLIP ha sido modificado para permitir la captura de RBPs de diferentes subcompartimentos celulares 14,15, para visualizar RNAs recién transcritos usando inducción pulsada de ribonucleósidos fotoactivables 5,16,17, para capturar RNAs metilados18,19,20, para examinar las interacciones ARN-ARN 21,22, y para mapear 3' extremos 23,24.
A pesar de las grandes contribuciones de las técnicas basadas en CLIP para ayudar a nuestra comprensión de las interacciones entre las RBP y los ARN, se ha visto limitado por la ineficiencia de la reticulación UV. Aunque las células de cultivo cultivadas en una monocapa son generalmente relativamente fáciles de reticular, esto es significativamente más desafiante en tejidos o células en solución. Los tejidos pueden requerir múltiples rondas de exposición a los rayos UV para penetrar en las capas celulares requeridas, mientras que las células microbianas a menudo se cultivan en medios ricos que contienen compuestos aromáticos que absorben los rayos UV25. De hecho, se han utilizado tiempos de irradiación UV de hasta 30 min para generar suficiente reticulación entre las RBP y sus ARN unidos para tales muestras26,27,28. Esta exposición prolongada a los rayos UV induce respuestas de estrés dentro de la célula, como el daño del ADN inducido por los rayos UV, que puede contaminar los datos finales en algunas aplicaciones.
La mayoría de los estudios CLIP se han centrado en generar "instantáneas" únicas de interacciones específicas proteína-ARN en una célula. Sin embargo, las interacciones proteína-ARN son inherentemente dinámicas, particularmente cuando las células están sujetas a cambios en su entorno. Esto puede incluir una reducción repentina en la disponibilidad de nutrientes esenciales o cambios rápidos en la temperatura. Como tal, para comprender realmente el papel de una RBP durante el estrés, es mejor realizar análisis resueltos en el tiempo porque pueden capturar el espectro completo de objetivos de RBP durante el estrés y determinar en qué etapa de la respuesta al estrés está activa la RBP elegida. En particular, los estudios en levaduras mostraron que los primeros minutos de adaptación son absolutamente cruciales para la supervivencia y las vidas medias de ARN en bacterias pueden variar de minutos a segundos 29,30,31,32,33. Por lo tanto, tales análisis resueltos en el tiempo idealmente deberían realizarse a alta resolución temporal. Sin embargo, los largos tiempos de reticulación hacen que el estudio de las respuestas adaptativas en etapa temprana sea particularmente desafiante.
Para superar estos problemas, recientemente desarrollamos un método mejorado que es capaz de entrecruzar y recolectar células en escalas de tiempo de un minuto. Nuestro método χCRAC permite la medición cuantitativa de cambios dinámicos en las interacciones RBP-ARN a una resolución previamente no presenciada. Crucial para este método fue el desarrollo de un nuevo dispositivo de irradiación UV32 que reduce el tiempo de reticulación requerido en levaduras y bacterias en solución alrededor de 10 veces, congelando efectivamente las interacciones RBP-ARN instantáneamente. Además, para cosechar rápidamente las células después de la irradiación UV, desarrollamos un dispositivo de filtración al vacío que puede cosechar levadura de crecimiento exponencial en un cultivo de 0,5 L en alrededor de 30 s32. Estas innovaciones tecnológicas permiten el estudio de la dinámica de RBP-RNA a escala de minutos. Además, también introdujimos varias optimizaciones al protocolo CRAC original2 para aumentar su practicidad.
Usando χCRAC, recientemente estudiamos el objetivo de una RBP nuclear de levadura, Nab3, en respuesta a la privación de glucosa. En Saccharomyces cerevisiae, Nab3 puede formar un complejo con Nrd1, un RBP, y la helicasa de ARN Sen1 para formar el complejo NNS. La unión de NNS a la ARN polimerasa y la transcripción naciente puede desencadenar la terminación transcripcional34. Este complejo está involucrado principalmente en la eliminación de transcripciones crípticas de ARN no codificante, pero también se ha demostrado que regula la expresión de genes codificadores de proteínas. El estudio mostró una focalización diferencial de Nab3 a transcripciones no codificantes y codificantes después de solo un minuto de estrés32. Demostramos que la terminación co-transcripcional por Nab3 da como resultado una expresión muy transitoria, similar a un pulso, de genes de retrotransposón, que habría sido difícil de detectar utilizando enfoques tradicionales basados en CLIP. Además, los cortos tiempos de irradiación UV en nuestro reticulante UV también aumentaron significativamente la recuperación de ARN no codificantes de corta duración32. Es probable que χCRAC sea una herramienta crucial para dilucidar no solo cómo las RBP dan forma a la respuesta al estrés en escalas de tiempo inmediatas, sino también sus roles cambiantes durante todo el ciclo de vida de una respuesta. Este manuscrito proporciona una descripción detallada de todos los pasos del protocolo χCRAC. Con fines ilustrativos, el método se utilizó para estudiar la proteína de levadura Nrd1, que está involucrada en la terminación transcripcional y la desintegración del ARN35,36, y su objetivo de ARN en respuesta a la privación de glucosa en una multitud de puntos temporales. Finalmente, también demostramos que nuestra unidad de irradiación UV puede entrelazar rápidamente RBP con ARN en células HeLa, lo que permite realizar también análisis de alta resolución resueltos en el tiempo en células adherentes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:876px;" width="876">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">1,4-dithioreitol</td>
			<td style="width:85px;">Merck</td>
			<td style="width:101px;">10708984001</td>
			<td style="width:495px;">Buffer component in mammalian cell lysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">1.5 mL tubes</td>
			<td style="width:85px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:101px;">0030 120.086</td>
			<td>General reaction tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">2 mL tubes</td>
			<td style="width:85px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:101px;">0030 123.344</td>
			<td>For holding columns and collection of waste</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">32P-yATP</td>
			<td style="width:85px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:101px;">NEG502Z-250</td>
			<td>For radiolabelling the 5&#39; end of the RNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">4-12% Bis-Tris gel</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">NP0321BOX</td>
			<td>SDS-PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">4X loading buffer</td>
			<td style="width:85px;">Novex</td>
			<td style="width:101px;">NP0008</td>
			<td>Protein loading dye concentrate</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">50 bp ladder</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">N3236</td>
			<td>Reference ladder for excising region of interest from the amplified cDNA library</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">50% PEG</td>
			<td style="width:85px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">B100045</td>
			<td>For the L5 linker ligation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">6% TBE gel</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td>EC6265BOX</td>
			<td>For separation and purification of the cDNA library</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Acetone</td>
			<td style="width:85px;">ACROS Organics</td>
			<td style="width:101px;">423245000</td>
			<td>Washing of TCA-precipitated proteins</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">anti-FLAG beads</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">M8823-1ML</td>
			<td>For purifcation of FLAG-tagged RBPs</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">ATP (100 mM)</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">R0441</td>
			<td>For ligation of the L5 linker onto the 5&#39; end of captured RNAs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Beta-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">M3148-100ML</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Biomax MS intensifying screen</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">Z363162-1EA</td>
			<td>For intensifying the autoradiogram signal</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Chloroform</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">1010219</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:85px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">11873580001</td>
			<td>For inhibition of cellular proteases after lysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Complete supplement mixture -TRP</td>
			<td style="width:85px;">Formedium</td>
			<td style="width:101px;">DCS0149</td>
			<td>For preparation of synthetic defined medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Costar Spin-X 0.22 &#181;m filters</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">CLS8160</td>
			<td>For isolating the excised cDNAs following gel extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">DNase RQ1</td>
			<td style="width:85px;">Promega</td>
			<td style="width:101px;">M6101</td>
			<td>For DNA digest following cell lysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">dNTPs (10 mM)</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">4638956001</td>
			<td>For reverse transcription and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Ethanol</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">10041814</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification and DNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">AM9261</td>
			<td>For protease K buffer</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Exonuclease I</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">M0293</td>
			<td>For degradation of primers following PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Glass microfiber filters</td>
			<td style="width:85px;">Whatman</td>
			<td style="width:101px;">1823-010</td>
			<td>For isolating the excised cDNAs following gel extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Glucose</td>
			<td style="width:85px;">Formedium</td>
			<td style="width:101px;">GLU03</td>
			<td>For preparation of glucose-containing, synthetic defined medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Glycogen (20 mg/mL)</td>
			<td style="width:85px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">10901393001</td>
			<td>Precipitation of proteins, RNA and DNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">GST-TEV</td>
			<td style="width:85px;">Homemade</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>Construct and purification protocol is available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Guanidium hydrochloroide</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">10071503</td>
			<td>Required for pulldown denaturing conditions and washing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">IgG beads</td>
			<td style="width:85px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:101px;">17-0969-01</td>
			<td>For purification of protein A-tagged RBPs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Imidazole</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">I2399-100G</td>
			<td>For elution of captured proteins from Nickel beads</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Isoamyl alcohol</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">A393-500</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Luna Universal One-Step RT-qPCR</td>
			<td style="width:85px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">E3005S</td>
			<td>For qPCR of the cDNA in order to calculate required number of PCR cycles</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:85px;">Fluka Analytical</td>
			<td style="width:101px;">63020-1L</td>
			<td>For PNK buffer</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:195px;">Membrane filters</td>
			<td style="width:85px;">Millipore</td>
			<td style="width:101px;">AAWP09000 for yeast or HAWP09000 for bacteria</td>
			<td>For vacuum filtration of cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Micro bio-spin columns</td>
			<td style="width:85px;">Biorad</td>
			<td style="width:101px;">732-6204</td>
			<td>For collecting eluate after gel extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Ni-NTA beads</td>
			<td style="width:85px;">Qiagen</td>
			<td style="width:101px;">30210</td>
			<td>For secondary protein capture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">NP-40</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">I8896-100ML</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Pfu polymerase</td>
			<td style="width:85px;">Promega</td>
			<td style="width:101px;">M7741</td>
			<td>For amplification of the cDNA library</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Phenol</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">P4682-400ML</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Pierce spin columns</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">69725</td>
			<td>For on-column enzymatic reactions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Protease K</td>
			<td style="width:85px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">3115887001</td>
			<td>For degradation of the RBP following gel extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Quartz Petri dish</td>
			<td style="width:85px;">UVO3</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td>For cross-linking of adherent cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 400 GBP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Radiography films</td>
			<td style="width:85px;">Amersham</td>
			<td style="width:101px;">28906843</td>
			<td>For autoradiography visualisation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">RNAClean XP beads</td>
			<td style="width:85px;">Beckmann</td>
			<td style="width:101px;">A63987</td>
			<td>SPRI beads for clean up of RNAs and cDNAs</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">RNase H</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">M0297</td>
			<td>For degradation of RNAs following reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">RNase-It</td>
			<td style="width:85px;">Agilent</td>
			<td style="width:101px;">400720</td>
			<td>For RNA digestion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">rRNasin</td>
			<td style="width:85px;">Promega</td>
			<td style="width:101px;">N2511</td>
			<td>For inhibition of any contaminating RNases during enzymatic reaction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sodium acetate</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">S2889-1KG</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification and DNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">7647-14-5</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">D6750-100G</td>
			<td>Buffer component in mammalian cell lysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sodium dodecylsulfate</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">L3771-1KG</td>
			<td>For protease K buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">SUPERase-In</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">AM2694</td>
			<td>For inhibition of cellular RNases after lysis</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">SuperScript IV</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">18090010</td>
			<td>For reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">T4 PNK</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">M0201</td>
			<td>For radiolabelling the 5&#39; end of the RNA</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">T4 RNA ligase 1</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">M0204</td>
			<td>For ligation of the L5 adaptor onto the RNA 5&#39; end</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">T4 RNase ligase 2, truncated K222Q</td>
			<td style="width:85px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">M0351S</td>
			<td>For ligation of the App_PE linker onto the 3&#39; end of captured RNAs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">TBE buffer (10X)</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td>15581-028</td>
			<td>For running TBE gels</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">TEV protease</td>
			<td style="width:85px;">Homemade</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>For eluting captured proteins following FLAG capture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Thermosensitive alkaline phosphatase</td>
			<td style="width:85px;">Promega</td>
			<td style="width:101px;">M9910</td>
			<td>For 5&#39; and 3&#39; dephosphorylation of RNAs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Trichloroacetic acid (100%)</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T0699-100ML</td>
			<td>For precipitation of RBP-RNA complexes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Tris hydrochloride</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">15504-020</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T8787-100ML</td>
			<td>Buffer component in mammalian cell lysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Vari Filter</td>
			<td style="width:85px;">UVO3</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td>Device for vacuum harvesting cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 100 GBP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Vari-X-Linker</td>
			<td style="width:85px;">UVO3</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td>Cross-linker for cross-linking cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 16,000 GBP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Yeast nitrogen base</td>
			<td style="width:85px;">Formedium</td>
			<td style="width:101px;">CYN0410</td>
			<td>For preparation of synthetic defined medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Zirconia beads</td>
			<td style="width:85px;">Thistle</td>
			<td>11079105Z for yeast or 11079101Z for bacteria</td>
			<td>For cell lysis via bead beating</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring protein-rna interaction dynamics in vivo at high temporal resolution using &#967;crac

La interacción entre las proteínas de unión al ARN (RBP) y sus sustratos de ARN exhibe fluidez y complejidad. Dentro de su vida útil, un solo ARN puede estar unido por muchas RBP diferentes que regularán su producción, estabilidad, actividad y degradación. Como tal, se ha hecho mucho para comprender la dinámica que existe entre estos dos tipos de moléculas. Un avance particularmente importante se produjo con la aparición de 'cross-l inking and immunoprecipitation' (CLIP). Esta técnica permitió una investigación rigurosa sobre qué ARN están unidos por un RBP particular. En resumen, la proteína de interés es UV reticulada a sus sustratos de ARN in vivo, purificada bajo condiciones altamente estrictas, y luego los ARN reticulados covalentemente a la proteína se convierten en bibliotecas de ADNc y se secuencian. Desde su concepción, se han desarrollado muchas técnicas derivadas para hacer que CLIP sea susceptible a campos particulares de estudio. Sin embargo, la reticulación mediante luz ultravioleta es notoriamente ineficiente. Esto da como resultado tiempos de exposición prolongados que hacen imposible el estudio temporal de las interacciones RBP-ARN. Para superar este problema, recientemente diseñamos y construimos dispositivos de irradiación UV y recolección de células muy mejorados. Usando estas nuevas herramientas, desarrollamos un protocolo para análisis resueltos en el tiempo de las interacciones RBP-ARN en células vivas a alta resolución temporal: enlace cinético CRoss-linking y Analysis of cDNAs (χCRAC). Recientemente utilizamos esta técnica para estudiar el papel de las RBP de levadura en la adaptación al estrés nutricional. Este manuscrito proporciona una descripción detallada del método χCRAC y presenta resultados recientes obtenidos con el RBP Nrd1.

Para demostrar la eficacia del método χCRAC, se realizó un experimento de curso temporal con cepas de levadura que expresan una proteína Nrd1 marcada con HTP. En la figura 1 se proporciona una representación esquemática detallada que describe cómo funciona el método. Al igual que Nab3, Nrd1 está involucrado en la desintegración del ARN nuclear de una variedad de transcripciones de ARN37. Trabajos previos del laboratorio de Corden sugirieron que la unión de Nrd1 a sus objetivos de ARN cambia significativamente cuando las células son sometidas a falta de glucosa28,38. Como tal, las células que crecen exponencialmente en un medio que contiene glucosa (SD-TRP) se cambiaron al mismo medio sin glucosa (S-TRP) durante un curso de tiempo para monitorear los cambios dinámicos en las interacciones Nrd1-ARN. Las muestras se tomaron y se reticularon en la cámara de enlace Vari-X (Figura 3A) antes del turno y luego después de 1, 2, 4, 8, 14 y 20 min. El medio utilizado para el crecimiento celular fue deliberadamente deficiente en triptófano para reducir la absorción UV por este aminoácido aromático. Tenga en cuenta que es mejor utilizar un medio sintético que esté esterilizado por filtro, ya que el autoclave del medio puede conducir a la caramelización de los azúcares. Esto reduce la eficiencia de reticulación.
La figura 4A muestra una autorradiografía representativa de un experimento χCRAC. Tenga en cuenta que en este ejemplo, las muestras no se agruparon. En cambio, cada uno se ejecutó individualmente en el gel. Esto se recomienda para las pruebas experimentales iniciales para demostrar que la proteína se cruza eficazmente con el ARN en todos los puntos de tiempo probados. Se observó una señal particularmente intensa en el peso molecular esperado de la RBP, que representa la proteína unida a ARN radiomarcados muy cortos que no son susceptibles de secuenciación. Por lo tanto, se aisló la señal de mancha por encima de esta banda, que es la proteína reticulada a fragmentos de ARN más largos. El fragmento fue cortado justo por encima de la banda de proteína más alrededor de 30 kDa. La figura 4B muestra un autorradiograma después de la escisión, con la proteína reticulada a ARN cortos que quedan en el gel y la señal previamente manchada ahora extirpada.
Después de la transcripción inversa, la biblioteca de ADNc debe amplificarse mediante PCR. Sin embargo, se debe evitar la sobreamplificación de la biblioteca, ya que esto puede introducir sesgos hacia secuencias amplificadas preferentemente por la polimerasa y generar artefactos de PCR. Las bibliotecas sobreamplificadas también contienen un gran número de secuencias duplicadas que desperdician lecturas en el secuenciador. Para calcular el número ideal de ciclos de PCR para la amplificación de la biblioteca final, se amplificó una alícuota del ADNc mediante qPCR utilizando los oligonucleótidos P5 y BC. El primer ciclo en el que la biblioteca alcanzó la fluorescencia máxima se eligió como el recuento del ciclo de PCR. La Figura 4C da un ejemplo de una qPCR de una biblioteca típica de ADNc, que produjo un recuento de ciclos máximos de 16. Este valor se utilizó para la PCR final de χCRAC. Para procesar los datos secuenciados, utilizamos un software previamente desarrollado en nuestro laboratorio (pyCRAC) y el pipeline correspondiente para el análisis de los datos cinéticos de CRAC (Nues et al., 2017; https://git.ecdf.ed.ac.uk/sgrannem/pycrac, https://bitbucket.org/sgrann/kinetic_crac_pipeline/src/default/). Estas herramientas de software de código abierto permiten la demultiplexación y el recorte de los datos, la eliminación de duplicados de PCR, la identificación de picos estadísticamente significativos, las lecturas de clúster en secuencias contiguas y la identificación de motivos de unión39. Más detalles sobre cómo funcionan estas herramientas se encuentran en sus respectivas páginas web.
También comenzamos a desarrollar un protocolo χCRAC para células de mamíferos. La mayoría de las líneas celulares de mamíferos se cultivan como una monocapa y la bandeja en nuestro reticulante con la bolsa permeable a los rayos UV no es adecuada para experimentos con células adherentes. Para superar este problema, desarrollamos una etapa en la que los usuarios pueden irradiar UV 1-2 placas de Petri (150 mm de diámetro y 25 mm de profundidad) con células adherentes (Figura 3B). Como primera prueba, la eficiencia del reticulante para células de mamíferos se midió a través de la reticulación y la captura de GFP-RBM7 marcados de manera estable utilizando anticuerpos anti-GFP y una purificación tradicional basada en CLIP. Como se muestra en la Figura 5A, el reticulante fue capaz de recuperar complejos proteína-ARN de células de mamíferos cultivadas como una monocapa utilizando irradiación UV de 254 nm con eficiencias comparables a un dispositivo de irradiación UV ampliamente utilizado. Sin embargo, los artículos de plástico de cultivo celular estándar que normalmente se usan para experimentos de reticulación UV son impenetrables a 254 nm UV. Por lo tanto, en nuestro reticulante las células sólo recibirían irradiación del banco superior de lámparas UV. Para superar esto, desarrollamos una placa de Petri de cuarzo permeable a los rayos UV para el crecimiento celular y la reticulación. El uso del material de cultivo de cuarzo mostró una recuperación robusta de complejos proteína-ARN con tan solo 2 s de irradiación UV (Figura 5B). Cuando se combinan con métodos de captura de RBP para células de mamíferos como las tecnologías CLIP, estos cortos tiempos de reticulación son susceptibles con cursos de tiempo para recuperar perfiles de unión al ARN espaciotemporal de RBP en respuesta a tensiones genotóxicas o agotamientos rápidos de factores proteicos, o en paralelo con la sincronización transcripcional o del ciclo celular.
La Figura 6 muestra varios ejemplos de los datos Nrd1 procesados por la canalización χCRAC. Esta figura se preparó utilizando los archivos bedgraph generados por la canalización y el paquete python GenomeBrowser (https://pypi.org/project/GenomeBrowser/1.6.3/), que diseñamos para simplificar la creación de imágenes de los datos del navegador del genoma con calidad de publicación. Los rectángulos grises representan regiones genómicas que expresaron ARN no codificantes, como la transcripción inestable críptica (CUT), las transcripciones estables no caracterizadas (SUT)40 y las transcripciones inestables sensibles a Xrn1 (XUT)41. Los datos de la Figura 6 muestran que Nrd1 se une a muchas de estas transcripciones de ARN no codificantes, lo que coincide con la idea de que esta proteína está implicada en la degradación de esta clase de transcripciones42. La Figura 6A muestra una región de ~15 kb en el cromosoma IV. Aquí hubo un aumento significativo en la unión de Nrd1 a las transcripciones que codifican los transportadores de glucosa de alta afinidad HXT6 y HXT7, los cuales están regulados al alza durante la inanición de glucosa. Es probable que la terminación de la transcripción por el complejo NNS pueda influir en la cinética de inducción de estos genes durante la falta de glucosa. La Figura 6B muestra un ejemplo de enlace cruzado Nrd1 a la transcripción Imd3, que se sabe que está regulada por Nab343. En este caso, los datos demostraron una reducción significativa en la unión a la falta de glucosa. Trabajos previos mostraron una disminución de la unión de Nab3 a la transcripción de Tye7 durante la falta de glucosa44. De acuerdo con esta observación, los datos de χCRAC sugieren que la unión de Nrd1 disminuyó durante la inanición de glucosa y la reticulación de Nrd1 a Tye7 estaba en su punto más bajo después de 8 min de estrés (Figura 4C). Sin embargo, parece que este efecto fue solo transitorio, porque después de 14 minutos de inanición de glucosa, la unión a Nrd1 volvió a los niveles iniciales.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig1v2.jpg"> Figura 1: Representación esquemática del protocolo χCRAC. Las cepas etiquetadas se cultivaron hasta la densidad deseada. RBP indica proteína de unión al ARN. Posteriormente, se tomó una muestra de referencia y se entrecruzó con luz UV de 254 nm. Las células restantes se cosecharon por filtración y luego se cambiaron rápidamente al medio inductor de estrés. Para el experimento χCRAC descrito aquí, se tomaron muestras y se entrecruzaron 1, 2, 4, 8, 14 y 20 minutos después del turno (1). El RBP de interés se purificó utilizando una purificación de afinidad de dos pasos altamente estricta (2). A continuación, los ARN reticulados capturados se digirieron parcialmente con RNasas, se marcaron radiactivamente en el extremo 5' y los adaptadores se ligaron a ellos (3). Los adaptadores de 5' contenían secuencias de códigos de barras únicas "en lectura" para que las muestras individuales pudieran separarse bioinformáticamente después de la secuenciación. Los complejos RBP-RNA se eluyeron, se agruparon y precipitaron juntos (4), se resolvieron mediante SDS-PAGE y se visualizaron mediante autorradiografía (5). Posteriormente, una sola rebanada de gel que contenía la señal radiactiva justo encima de la banda principal, ilustrada con una caja roja discontinua en la imagen de autorradiografía, se cortó del gel (5). Las rodajas de gel se trataron con proteasa K y posteriormente se extrajo el ARN (6), se convirtió en ADNc y se amplificó mediante PCR (7). El paso PCR introdujo códigos de barras adicionales (bloque amarillo introducido por P7 oligo) para que muchas bibliotecas pudieran multiplexarse en un solo carril. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig1v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig2v2.jpg"> Figura 2: Reticulación y filtración al vacío. (A) El reticulante. La suspensión celular se vierte en un embudo ubicado en la parte superior derecha de la máquina (consulte también la Figura 3A para un primer plano) y se mantiene en una bolsa transparente a los rayos UV ubicada en la bandeja central. Esta bolsa está flanqueada por dos persianas que permanecen cerradas hasta que el usuario indica a la máquina que inicie el paso de irradiación. Las células se irradian con luz UV de las bandejas tanto arriba como abajo. La máquina viene suministrada con lámparas UV de 254 y 365 nm, siendo esta última aplicable para experimentos PAR-CLIP. La máquina se opera a través de un panel de pantalla táctil ubicado en la parte superior derecha que permite controlar la dosis de UV o el tiempo de exposición. (B) Después de la reticulación, las celdas se drenan desde el lado izquierdo de la máquina. Las suspensiones celulares se recuperan al vacío y se drenan en un matraz de vidrio donde posteriormente se pueden verter en un dispositivo de filtración al vacío para su recolección. (C) Dispositivos de filtración al vacío. Estos se abren y cierran a través de un clip y se inserta un filtro entre ellos. Se utilizaron cuatro dispositivos de filtración en paralelo durante series temporales muy cortas para no perder tiempo como resultado del cambio de filtros. (D) Después de la filtración, el sobrenadante del medio se drenó en matraces para su posterior eliminación. Se instalaron válvulas debajo de los dispositivos de filtración al vacío para mantener el vacío en el sistema cuando se retira el filtro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig2v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig3v2.jpg"> Figura 3: Reticulación de células suspendidas vs. adherentes. (A) El reticulante con la cámara de reticulación Vari-X para celdas de suspensión. El cultivo celular se vierte en la entrada de la muestra (embudo) ubicada en la parte superior derecha de la bandeja. (B) Bandeja que puede contener placas de Petri de plástico o cuarzo para reticular células adherentes o pequeños volúmenes de células de suspensión. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig3v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig4v2.jpg"> Figura 4: Preparación de la biblioteca. (A) Ejemplo de un autorradiograma de un experimento Nrd1-HTP χCRAC. La señal fuerte y concentrada representa la proteína reticulada a ARN muy cortos, mientras que el frotis anterior representa la proteína reticulada a ARN de longitud suficiente para la secuenciación. (B) El frotis fue extirpado como se muestra en un autoradiograma tomado después de la escisión en gel. (C) Una qPCR representativa de una biblioteca de ADNc χCRAC. En este ejemplo, la amplificación máxima del ADNc se alcanzó a los 16 ciclos. Por lo tanto, se utilizaron 16 ciclos para la amplificación final. La barra de error representa la desviación estándar de tres réplicas técnicas de qPCR. (D) Ejemplo de una imagen de fósforo de una biblioteca de ADNc en un gel TBE al 6%. (E) análisis de longitud y calidad del ADNc a partir de una electroforesis capilar basada en chips. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig4v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig5v2.jpg"> Figura 5: Prueba de alta RNasa Experimento iCLIP para probar la reticulación en células de mamíferos. Se muestran autoradiogramas de experimentos GFP-RBM7 iCLIP que probaron la eficiencia de la recuperación de RNP a través de varias energías de reticulación. Las inmunoprecipitaciones se realizaron utilizando anticuerpos anti-GFP acoplados a perlas magnéticas en células reticuladas que expresaron de manera estable GFP-RBM7. Los inmunoprecipitados se incubaron con altas concentraciones de RNasa I para recortar los ARN asociados a longitudes cortas y uniformes. Las RNP fueron visualizadas por el etiquetado 32Py SDS-PAGE y migran como una banda definida, cerca de la migración de la proteína no reticulada. La cuantificación indica los resultados de los análisis densitométricos de la señal de ARN RBM7 radiomarcada normalizada a la señal Western blot anti-GFP. (A) Curso temporal de reticulación del reticulante UVP comúnmente utilizado frente a nuestro reticulante (Vari-X-linker; VxL). (B) Entrecruzamiento del curso temporal de nuestro reticulante en artículos de cultivo de cuarzo (izquierda) y plástico (derecha). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig5v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig6v2.jpg"> Figura 6: Ejemplos de gráficos del navegador del genoma que muestran el poder de χCRAC para mostrar la unión temporal diferencial de Nrd1 a sus objetivos. Cada cuadro muestra gráficos para regiones genómicas individuales. Las flechas indican en qué hebra están codificados los genes (flecha que apunta a la izquierda = menos hebra; flecha que apunta a la derecha = hebra más). Los puntos de tiempo (min) se indican mediante t0, t1, t2, etc. en los ejes y de cada subgráfico. Se muestran números romanos que indican los cromosomas y las coordenadas. (A) Tras la privación de glucosa, Nrd1 se une a dos transportadores de glucosa de alta afinidad, HXT6 y HXT7, que están regulados al alza en esta condición. (B) Se observa que Nrd1 se une a Imd3, un objetivo ya validado de Nab344, con una intensidad reductora después de la falta de glucosa. (C) La unión Nrd1 de Tye7 exhibe una naturaleza dinámica y transitoria, disminuyendo después de la falta de glucosa a un mínimo después de 8 min de estrés. Sin embargo, la unión posteriormente vuelve a los niveles basales después de 14 min. Las lecturas se normalizaron a "lecturas por millón" (RPM; eje y). Los recuadros grises indican regiones que codifican ARN no codificantes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig6v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

La reticulación cinética y el análisis del ADNc es un método que permite la investigación de la dinámica de las interacciones proteína-ARN en células vivas a alta resolución temporal. Aquí se describe el protocolo en detalle, incluido el crecimiento de células de levadura, la reticulación UV, la recolección, la purificación de proteínas y los pasos de preparación de la biblioteca de secuenciación de próxima generación.

Monitorización de la dinámica de interacción proteína-ARN in vivo a alta resolución temporal utilizando χCRAC

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