La recherche sur les maladies cardiaques est souvent effectuée chez les petits mammifères comme les rongeurs. Cependant, la physiologie du cœur humain diffère considérablement de celle du cœur des rongeurs. Notre protocole utilise des cardiomyocytes différenciés des cellules iPS humaines pour modéliser les cardiopathies ischémiques et quantifier les dommages et l’affaiblissement fonctionnel des cardiomyocytes ischémiques.
Ce protocole peut fournir une méthode pratique pour le dépistage personnalisé des médicaments à l’aide de cellules iPS dérivées de patients individuels, la manipulation appropriée des cellules iPS, comme dans l’utilisation d’un milieu frais, et le changement du milieu lentement et ponctuellement est essentiel pour assurer une différenciation réussie en cardiomyocytes fonctionnels. Chen Wang, doctorant d’un laboratoire, démontrera la procédure avec Yun Liu, Yin Liang et Mengxue Wang. Pour induire la différenciation des cellules souches pluripotentes induites par l’homme en cellules cardiaques, enduire d’abord les puits d’une plaque de culture de puits de 96 avec 100 microlitres de 1.675 microgrammes par millilitre de laminine dans PBS.
Après une incubation de 30 minutes à 37 degrés Celsius, voir trois fois 10 à la quatrième cellules souches dans 200 microlitres de milieu de maintenance IPS complété par 10 micromolaires Y27632 dans chaque puits, et retourner la plaque à l’incubateur de culture cellulaire. Après 24 heures, remplacer les super moyens par 200 microlitres de milieu de croissance IPS par puits, et retourner la plaque à l’incubateur de culture cellulaire pour deux à trois jours supplémentaires. Lorsque les cellules atteignent 70 à 80%confluency.
Remplacez le milieu de chaque puits par 200 microlitres de milieu de différenciation préchauffé A et retournez la plaque à l’incubateur de culture cellulaire pendant encore 48 heures. À la fin de l’incubation a lentement remplacé le supernatant dans chaque puits avec 200 microlitres de préchauffé milieu de différenciation B et retourner la plaque à l’incubateur de culture cellulaire. Après deux jours, remplacer les supernatants par 200 microlitres de milieu d’entretien des cardiomyocytes préchauffés par puits et retourner la plaque à l’incubateur de culture cellulaire pour un temps jusqu’à 30 jours.
Pour évaluer la contractilité des cardiomyocytes, installez l’image de velocimétrie d’image de particule j plugin et utilisez un microscope de contraste de phase et l’objectif de fourches pour enregistrer des images vidéo des cellules à environ 20 images par seconde pendant environ 10 secondes. Enregistrez ensuite le fichier vidéo tel qu’analysé notre API et créez une structure de dossier comme indiqué. Pour analyser les champs vectoriels bidimensionnels discrets du déplacement cellulaire, lancez VG et sélectionnez des plugins, des macros et modifiez pour ouvrir l’analyse vectorielle.
ijm, puis cliquez sur exécuter l’analyse sera effectuée automatiquement. Pour le traitement ischémique, remplacer le supernatant dans chaque puits par 200 microlitres de dmem sans glucose et sérum, puis placer la plaque dans une chambre hypoxique puis infuser le gaz azoté dans la chambre, en maintenant la concentration interne d’oxygène à 2% et la concentration de dioxyde de carbone à 5% pendant 24 heures. Les cellules différenciées avec succès, démontre la contraction spontanée comme observé sous le microscope avec 50% des puits de culture présentant typiquement la contraction spontanée en moins de 20 jours.
La protéine de marqueur cardiaque peut également être employée pour confirmer une différenciation réussie Cellules du groupe ischémique montrent typiquement une viabilité inférieure dans des analyses de MTT, et une contractilité inférieure que ceux du groupe témoin normoxique. Le rapport des cellules positives d’iodure de propidium est également plus élevé dans le groupe ischémique, que dans le groupe témoin, indiquant une incidence plus élevée des dommages cellulaires. Il est important que vous localisez avec précision les régions d’intérêt dans la plaque de capture pour permettre la comparaison de la contractilité des cardiomyocytes.
Cette technique peut être utilisée pour le dépistage des médicaments, en utilisant des cellules iPS dérivées du patient. Il fournit également une plate-forme unique pour élucider davantage les mécanismes sous-jacents aux maladies cardiaques ischémiques
