Name: model of ischemic heart disease and video-based comparison of cardiomyocyte contraction using hipsc-derived cardiomyocytes
Uploaded: 2020-05-05T15:00:00
Duration: 5 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Model of Ischemic Heart Disease and Video-Based Comparison of Cardiomyocyte Contraction Using hiPSC-Derived Cardiomyocytes at JoVE.com

Cette étude a été soutenue par JSPS KAKENHI, Fund for the Promotion of Joint International Research (Fostering Joint International Research), 17KK0168. Les auteurs remercient le Laboratoire central de recherche de l’Okayama University Medical School pour l’aide du FACS.

1. culture d’entretien hiPSC
<ol><li>Enrober une plaque de culture de six puits de laminine (Table des matériaux).<ol>
<li>Diluer laminine à 0,5 μg/mL dans la solution saline tamponnée de phosphate (PBS).</li>
		<li>Ajouter la laminine diluée à une plaque de six puits à un volume de 2,0 mL/puits.</li>
		<li>Incuber la plaque à 37 °C pendant 30 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Retirer la solution de laminine des puits.</li>
	<li>Semences hiPSCs dans 2 mL de milieu d’entretien iPSC (Tableau des matériaux) sur les puits enduits à une densité de 3 × 104 cellules/puits sans sécher la surface.</li>
	<li>Sous-culture les hiPSCs.<ol>
<li>Préparer une solution d’enzymes de dissociation cellulaires de 0,5 ×(Table des matériaux).<ol>
<li>Mélanger 10 μL de 0,5 M d’éthylènediaminetétraacétique (EDTA) et 10 mL de PBS pour faire 0,5 mM EDTA/PBS.</li>
			<li>Diluer 10 mL des enzymes de dissociation cellulaire de 1× à 0,5 × en ajoutant 10 mL de 0,5 mM EDTA/PBS.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Apirate le milieu usé des puits.</li>
		<li>Ajouter 2 mL/puits de PBS pour laver les cellules, puis jeter le PBS.</li>
		<li>Ajouter 800 μL des enzymes de dissociation cellulaire de 0,5 × et incuber les cellules pendant 7 min à 37 °C dans un incubateur humidifié contenant 5 % de CO2. REMARQUE : 0,05 % de trypsin-EDTA peut être utilisé pour dissocier les cellules.</li>
		<li>Retirez doucement la solution d’enzymes de dissociation cellulaire de 0,5 ×.</li>
		<li>Laver les cellules avec 2 mL PBS, puis jeter le PBS. REMARQUE : Soyez doux parce que les cellules se détachent facilement après l’ajout d’enzymes de dissociation cellulaire.</li>
		<li>Ajouter 1 mL de support d’entretien iPS (Table des matériaux) contenant 10 μM Y-27632. REMARQUE : L’ajout de Y-27632 augmente le taux de survie des hiPSC.</li>
		<li>Déloger les cellules à l’aide d’un grattoir cellulaire et les récupérer dans un tube de centrifugeuse de 15 mL.</li>
		<li>Comptez le nombre de cellules. Ajuster la densité cellulaire à 1,5 × 104 cellules/mL en ajoutant un support d’entretien iPS contenant 10 μM Y-27632. REMARQUE : N’utilisez pas de centrifuge pour prévenir les dommages cellulaires.</li>
		<li>Graine 2 mL de mélange cellulaire sur la plaque de six puits recouverte de laminine (densité finale : 3 × 104 cellules/puits).</li>
		<li>Incuber les cellules à 37 °C dans un incubateur humidifié contenant 5% de CO2.</li>
		<li>Remplacez le support de culture par un support d’entretien iPS sans Y-27632 les jours 1, 4, 5 et 6.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sous-culture des cellules le jour 7. NOTE : Sous-culture des cellules par jour 7 afin d’inhiber la différenciation aléatoire des hiPSC.</li>
</ol>2. Induction de la différenciation cardiaque des hiPSC
<ol><li>Enrober une plaque de culture de 96 puits de laminine (Table des matériaux).<ol>
<li>Diluer laminine à 1,675 μg/mL avec PBS.</li>
		<li>Ajouter la solution de laminine diluée à une plaque de 96 puits à un volume de 0,1 mL/puits.</li>
		<li>Incuber la plaque à 37 °C pendant 30 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Graine hiPSCs sur une plaque de 96 puits à une densité de 3 × 104 cellules/puits.</li>
	<li>Proliférer les hiPSC à 37 °C dans un incubateur humidifié contenant 5 % de CO2.<ol>
<li>Un jour plus tard, remplacer le milieu par un milieu de croissance iPS de 200 μL/puits(Tableau des matériaux).</li>
		<li>Changez le milieu chaque jour pendant 2 à 3 jours supplémentaires jusqu’à ce que les cellules atteignent 70%–80% de confluence.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Appliquer des supports de différenciation.<ol>
<li>Remplacer le milieu usé et le remplacer lentement par 200 μL/puits de milieu de différenciation préchauffé A (Tableau des matériaux).</li>
		<li>Placer la plaque à 37 °C dans un incubateur humidifié contenant 5 % de CO2.</li>
		<li>Après 48 h, remplacer le milieu et le remplacer lentement par 200 μL/puits de milieu de différenciation préchauffé B (Tableau des matériaux).</li>
		<li>Placer la plaque à 37 °C dans un incubateur humidifié contenant 5 % de CO2. REMARQUE : Il est extrêmement important que les supports de différenciation soient conservés frais. Ils perdront progressivement leur effet de différenciation, généralement dans les deux semaines. Si nécessaire, aliquot milieu frais et conserver à −20 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Appliquer un milieu d’entretien des cardiomyocytes.<ol>
<li>Après 48 h, remplacer le milieu et le remplacer lentement par 200 μL/puits de milieu d’entretien cardiomyocyte préchauffé (Tableau des matériaux).</li>
		<li>Placer la plaque à 37 °C dans un incubateur humidifié contenant 5 % de CO2.</li>
		<li>Remplacer le milieu de différenciation des cardiomyocytes tous les deux jours jusqu’au jour 30. REMARQUE : Il est important que la durée de l’application des milieux de différenciation A et B soit réglée avec précision à 48 h afin d’assurer la séquence d’expression précise des gènes requis pour la différenciation.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Exposition à l’ischémie
<ol><li>Priver le milieu de culture de nutriments et d’oxygène.<ol>
<li>Préparer le milieu aigle modifié de Dulbecco (DMEM) sans glucose et sérum.</li>
		<li>Aspirate culture moyenne des puits de la plaque de 96 puits contenant hiPS-CM.</li>
		<li>Ajouter le milieu pauvre en nutriments aux puits à un volume de 200 μL/puits.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Placez la plaque de culture dans un incubateur hypoxique (Table des matériaux).</li>
	<li>Infuser du gaz azoté et maintenir la concentration interne d’oxygène à 2% et la concentration de CO2 à 5% pour 24 h.</li>
	<li>Procéder aux analyses souhaitées : p. ex., analyse de viabilité, évaluation de la contractilité ou évaluation des dommages cellulaires.</li>
</ol>4. Évaluation de la viabilité cellulaire à l’aide de l’essai MTT
<ol><li>Utilisez le kit d’analyse MTT (Table des matériaux)pour évaluer quantitativement la viabilité des cellules. REMARQUE : L’exposition au peroxyde d’hydrogène de 1 mM dans le DMEM pendant 1 h peut être utilisée pour endommager les cellules (contrôle positif). L’exposition au peroxyde d’hydrogène de 0 mM dans le DMEM peut être utilisée pour le contrôle négatif.<ol>
<li>Ajoutez 10 μL de réactif MTT aux cellules à l’aide d’un pipettor répétitif.</li>
		<li>Mélanger délicatement pendant une minute sur un shaker orbital.</li>
		<li>Incuber les cellules pendant 3–4 h à 37 °C dans un incubateur de CO2 de 5 %. Après l’incubation, le formazan produit dans les cellules apparaîtra sous forme de cristaux foncés au fond des puits.</li>
		<li>Après avoir enlevé le supernatant, dissoudre les cristaux insolubles de formazan dans 100 μL de solution de sulfoxyde de diméthyle (DMSO). Cette solution va dissoudre les cristaux de formazan, produisant une solution pourpre. ATTENTION : Le DMSO peut irriter les yeux, le système respiratoire et la peau. Portez des gants appropriés et une protection œil/visage.</li>
		<li>Mesurer l’absorption de chaque échantillon à l’aide d’un lecteur de microplaques à une longueur d’onde de 570 nm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Évaluation de la contractilité des iPS-CM
<ol><li>Si vous n’êtes pas installé, obtenez le plugin ImageJ de l’image de l’image de l’image de particules11 à https://sites.google.com/site/qingzongtseng/piv et installez-les.</li>
	<li>À l’aide d’un microscope de contraste de phase, enregistrez les images vidéo des hiPS-CM à l’aide de l’objectif de 4 × à ~20 images par seconde pour ~10 s, et enregistrez comme « analyze.avi ». Pour une comparaison de la contractilité entre l’ischémie avant et après, confirmez que le lieu d’intérêt est enregistré. REMARQUE : Un microscope avec une étape automatisée est utile pour cibler l’emplacement d’intérêt. Le fichier de film doit être dans le format .avi pour l’analyse ultérieure. Sinon, convertissez le film en .avi.</li>
	<li>Créer la structure des dossiers comme indiqué dans la figure 1. Un exemple de « joblist.txt » est indiqué dans le fichier supplémentaire.</li>
	<li>Analyser les champs vecteurs bidimensionnels discrets du déplacement cellulaire.<ol>
<li>Lancement du logiciel Fiji (ImageJ)12, accédez à Plugins > Macros > Modifier et ouvrir « vector_analysis.ijm » (Fichier de codage supplémentaire).</li>
		<li>Cliquez sur Exécuter. L’analyse sera effectuée automatiquement. REMARQUE : Les vecteurs de déplacement D(x,y) sont calculés pour chaque 16 × 16 pixels entre le cadre de référence (le premier cadre) et toutes les images suivantes (cadres 1 vs 2, 1 contre 3, 1 contre 4, etc.). Le résultat est calculé pour chaque image et enregistré comme « vec_x.txt » (x est un numéro de cadre). Un vecteur de déplacement maximal, M(x, y), est défini pour chaque paire (x, y) comme suit : <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61104/61104equ01.jpg"> où k représente le numéro d’image auquel | Dk (x,y)| = max [| D2 (x,y)|, | D3 (x,y)|, ..., | Dn (x,y)|] et n désigne le dernier cadre. Le résultat est enregistré sous le nom de « Max_vector.txt ». | M(x, y)| représente le déplacement maximal causé par la contraction des cardiomyocytes au point d’analyse (x, y). La valeur contractilité C en unités arbitraires est calculée comme suit : <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61104/61104equ02.jpg"> Cette valeur est enregistrée à la colonne 7, ligne 1 dans le « Max_vector.txt ». C représente la somme du déplacement pour tous (x, y). Plus la partie où le déplacement dû à la contraction myocardique est important est grande, plus la valeur de C est grande. Le champ vectoriel de déplacement maximal, M(x, y), est recouvert d’une image de contraste de phase du premier cadre (« Phase_contrast.png ») et enregistré sous le nom de « Overlaid.png ». Comme l’ampleur du vecteur de déplacement est calculée sur la base du premier cadre de la vidéo, il est préférable que les hiPS-CM soient à la période diastolique de repos pour le premier cadre.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Évaluation des dommages cellulaires à l’aide de la cytométrie du débit
<ol><li>Diluer une solution de 1 mg/mL d’iodure de propidium à 1:1 000 dans PBS.</li>
	<li>Tacher les cellules détachées d’iodure propidium.<ol>
<li>Apirate le milieu et le placer dans un tube de centrifugeuse de taille appropriée.</li>
		<li>Centrifugez le tube à 1 000 × g pendant 5 min, et retirez soigneusement le supernatant afin de ne pas perdre de cellules sédimentées.</li>
		<li>Incuber les cellules avec la solution diluée d’iodérifation de propidium à température ambiante pendant 15 min dans l’obscurité.</li>
		<li>Centrifugez le tube à 1 000 × g pendant 5 min, et retirez soigneusement le supernatant afin de ne pas perdre de cellules sédimentées.</li>
		<li>Reconstituer les cellules en ~1 mL de PBS. REMARQUE : Il est important de recueillir les cellules flottantes détachées du milieu pour quantifier avec précision les dommages cellulaires.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cellules attachées de tache avec l’iodé de propidium.<ol>
<li>Laver les cellules attachées deux fois avec pbs doucement, puis jeter PBS.</li>
		<li>Incuber les cellules avec la solution diluée d’iodure de propidium pendant 15 min dans l’obscurité.</li>
		<li>Apirate la solution d’iodure propidium.</li>
		<li>Détachez les cellules à l’aide de la trypsie à 0,25 %. Déplacez la solution cellulaire dans un tube de centrifugeuse.</li>
		<li>Centrifugez le tube à 1 000 × g pendant 5 min, et retirez soigneusement le supernatant afin de ne pas perdre de cellules sédimentées.</li>
		<li>Reconstituer les cellules en ~1 mL de PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mélanger les cellules flottantes et attachées pour l’analyse du tri des cellules activées par fluorescence (FACS).</li>
	<li>Passez la solution cellulaire à travers un filtre de 30 μm. REMARQUE : Le passage des cellules à un filtre est très important pour une mesure précise du FACS.</li>
	<li>Analyser les échantillons à l’aide d’un système FACS.</li>
</ol>7. Immunostaining
<ol><li>Fixez l’échantillon de cellule.<ol>
<li>Apirate le milieu de la culture.</li>
		<li>Ajouter 4 % de paraformaldéhyde dans pbs pendant 10 min à température ambiante.</li>
		<li>Laver les cellules trois fois avec PBS. REMARQUE : La solution de paraformaldéhyde frais est recommandée pour une fixation optimale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Permeabiliser les cellules avec 0,2% Triton X-100 pendant 15 min, puis jeter le réactif.</li>
	<li>Ajouter 3% d’albumine de sérum bovin pour bloquer les cellules pendant 30 min.</li>
	<li>Appliquer un anticorps primaire.<ol>
<li>Jeter la solution d’albumine de sérum bovin de la plaque de culture.</li>
		<li>Incuber les cellules avec des anticorps primaires pendant la nuit à 4 °C.</li>
		<li>Retirez la solution d’anticorps.</li>
		<li>Laver les cellules trois fois avec PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Appliquer un anticorps secondaire.<ol>
<li>Jetez la solution PBS de la plaque de culture.</li>
		<li>Incuber les cellules avec des anticorps secondaires pendant 30 min à température ambiante dans l’obscurité. REMARQUE : L’anticorps monoclonal de souris anti-cardiaque primaire T (TNNT2) est utilisé à une dilution de 1:750 dans 3% BSA. L’anticorps anti-souris de chèvre secondaire conjugué Alexa Fluor 488 est dilué à 1:1 000 dans 3 % de BSA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloration supplémentaire du noyau et des fibres d’actine.<ol>
<li>Retirez la solution d’anticorps.</li>
		<li>Incuber les cellules dans le réactif de coloration du noyau (Table des matériaux) et le réactif de coloration actin ( Table desmatériaux) dans PBS pendant 30 min à température ambiante dans l’obscurité. NOTE: 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) ou Hoechst 33342 peut être utilisé pour la coloration nucléaire.</li>
		<li>Laver les cellules trois fois avec PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Capturez des images de fluorescence à l’aide d’un microscope à fluorescence.</li>
</ol>

<ol>
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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+cardiomyocytes+and+tissue+engineering+strategies+for+disease+modeling+and+drug+screening.">Human iPSC-derived cardiomyocytes and tissue engineering strategies for disease modeling and drug screening.</a> Biotechnology Advances. 35 (1), 77-94 (2017).</li><li>Sitkovsky, M., Lukashev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+immune+cells+by+local-tissue+oxygen+tension:+HIF1+alpha+and+adenosine+receptors.">Regulation of immune cells by local-tissue oxygen tension: HIF1 alpha and adenosine receptors.</a> Nature Reviews Immunology. 5 (9), 712-721 (2005).</li><li>McDougal, A. D., Dewey, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+oxygen+requirements+in+ischemic+cardiomyocytes.">Modeling oxygen requirements in ischemic cardiomyocytes.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (28), 11760-11776 (2017).</li><li>Rounds, S. A., Wilde, F. D., Ritz, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+A6.+Section+6.2.">Chapter A6. Section 6.2.</a> Dissolved oxygen. Report No. 09-A6.2. , (2006).</li><li>Al-Ani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygenation+in+cell+culture:+Critical+parameters+for+reproducibility+are+routinely+not+reported.">Oxygenation in cell culture: Critical parameters for reproducibility are routinely not reported.</a> PLoS One. 13 (10), 0204269 (2018).</li><li>Cadet, J. S., Kamp, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Recipe+for+T-Tubules+in+Human+iPS+Cell-Derived+Cardiomyocytes.">A Recipe for T-Tubules in Human iPS Cell-Derived Cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 121 (12), 1294-1295 (2017).</li><li>Halloin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+WNT+Control+Enables+Advanced+hPSC+Cardiac+Processing+and+Prognostic+Surface+Marker+Identification+in+Chemically+Defined+Suspension+Culture.">Continuous WNT Control Enables Advanced hPSC Cardiac Processing and Prognostic Surface Marker Identification in Chemically Defined Suspension Culture.</a> Stem Cell Reports. 13 (2), 366-379 (2019).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à révéler.

Les chercheurs utilisent souvent des modèles de laboratoire pour les petits animaux pour mener des expériences sur l’IHD. Ici, nous avons développé un modèle de culture cellulaire de l’IHD humain pour mener de telles expériences.
Le principal problème auquel un utilisateur de ce protocole peut faire face est le faible taux de cardiomyocytes différenciés. Plusieurs mesures doivent être prises avec grand soin pour améliorer le taux de différenciation réussie : a) être doux lors du pipetage parce que les cellules se détachent facilement après l’addition des enzymes de dissociation cellulaire réactif, (b) ajoutant Y-27632 augmente le taux de survie des cellules iPS lors du détanage, et (c) le moment des changements moyens au début de la différenciation devrait être précisément 48 h d’intervalle pour assurer l’expression contrôlée des gènes impliqués dans la différenciation.
En ce qui concerne les protéines de matrice extracellulaire utilisées pour recouvrir la surface de la plaque de culture, d’autres matériaux que laminine que nous avons utilisés dans ce protocole peuvent être utilisés. Par exemple, Matrigel14,15, et gélatine 16,17sont utilisés pour la culture d’entretien sans alimentation des hiPSCs.17 Selon Haraguchi et coll., les hiPSC ensemencés sur Matrigel ont été différenciés avec succès en feuille de cellules cardiaques18.
Il existe un certain nombre d’études précédentes concernant les modèles de culture pour la modélisation des maladies à l’aide de cardiomyocytes dérivés de hiPSCs. En ce qui concerne la modélisation des lésions de l’ischémie-reperfusion, des manipulations de l’environnement cellulaire, telles que l’hyperkaliémie, l’acidose et l’accumulation de lactate, ont été introduites19. D’autres méthodes incluent le granulé cellulaire pour entraver la diffusion de l’oxygène20 et l’inhibition métabolique utilisant le cyanure21. Dans le protocole actuel, les lésions cellulaires ont été obtenues par une méthode relativement simple, à savoir la privation de 24 h d’oxygène et de nutriments. Cependant, il faut prendre soin d’examiner les processus pathophysiologiques précis de la maladie cardiaque ischémique, car il y a effectivement des différences entre la maladie in vivo et le modèle de la maladie du protocole actuel, comme la présence ou l’absence d’environnement cellulaire tridimensionnel et le sang.
En ce qui concerne l’aspect technologique de l’évaluation de la fonction cardiomyocyte, Toepfer et coll. ont signalé un algorithme basé sur MatLab pour déterminer la contraction et la relaxation du sarcomère dans les hiPS-CM22. Smith et coll. ont signalé une méthode avancée d’analyse électrophysiologique à haut débit des cellules excitables dérivées de hiPS-CM, à l’aide de tableaux multiélectrodes sophistiqués à motifs nanotopographiques23,24. L’avantage de notre protocole est qu’il ne nécessite que des logiciels et des consommables conventionnels, tels que le logiciel imageJ et des plaques de 96 puits.
En ce qui concerne le niveau d’oxygène dans le cœur, la pression d’oxygène dans les veines qui atteignent le cœur est pensé pour être 40 mmHg25. Selon McDougal et coll., la pression d’oxygène extracellulaire sous hypoxie est estimée à 12,8 mmHg26. En appliquant la méthode de Rounds et al.27, la pression d’oxygène dans le milieu de culture (salinité: 35‰) sous l’état hypoxique (2% d’oxygène) à 37 °C traités avec le protocole actuel est calculée à 14,9 mmHg, ce qui est supérieur à l’estimation ci-dessus. Fait intéressant, Al-Anis et coll. ont signalé qu’il y a un gradient de pression d’oxygène dans le milieu de culture, et que la pression d’oxygène est affectée par le type de cellule, la densité d’ensemencement et le volume moyen28. Typiquement, la concentration d’oxygène au bas de la plaque de culture où les cellules résident est la plus faible. Par conséquent, l’effet de la profondeur dans le milieu de culture réduirait encore la pression efficace d’oxygène près de hiPS-CM. Afin d’induire des dommages suffisants aux hiPS-CM en utilisant l’état hypoxique, une attention particulière doit être accordée à la profondeur du milieu et à la densité des cellules.
Notre modèle hiPS-CM, qui est très proche des conditions physiologiques des myocytes cardiaques humains, imite avantageusement l’IHD humain. Les approches fondées sur des modèles animaux comprennent des questions éthiques, techniques et académiques. En particulier, les modèles in vivo nécessitent une technique avancée de microchirurgie pour obtenir des données reproductibles : par exemple, l’occlusion de la branche descendante antérieure de l’artère coronaire gauche chez les rongeurs3. Le modèle hiPS-CM décrit ci-après surmonte ces barrières critiques et fournit une plate-forme utile, pertinente et répétable pour les maladies cardiovasculaires.
Toutefois, certaines limitations doivent être notées. Une différence évidente entre les cardiomyocytes iPS-induits et les cardiomyocytes normaux est l’absence de T-tubules29, et nous n’avons pas inclus des facteurs humoristiques tels que les dommages tissulaires induits par les leucocytes et l’activation d’un système de complément dans notre étude. En outre, le taux de cardiomyocytes différenciés dans ce modèle (20,7 ± 9,6 %, figure supplémentaire 3)devrait être amélioré. La publication récente de Halloin et coll. décrit une méthode évolutive et définie chimiquement pour induire la pureté hiPS-CM de >95% par les modulateurs chimiques de voie WNT sans exigence d’aucune sélection par les marqueurs30. Néanmoins, notre modèle d’IHD humain est relativement simple et cliniquement applicable (p. ex., dépistage médicamenteux utilisant des cellules iPS dérivées par le patient). Notre modèle est également une plate-forme unique pour élucider davantage les mécanismes sous-jacents IHDs.

La cardiopathie ischémique (IHD) est reconnue dans le monde entier comme la principale cause de décès, et on estime qu’elle est responsable de plus de neuf millions de décès en 20161. La prévalence des maladies cardiovasculaires continue d’augmenter, et la mondialisation semble avoir contribué à la prévalence des facteurs de risque de maladies cardiaques dans les pays en développement. Par conséquent, l’étude de l’IHD devient de plus en plus urgente2.
Les modèles expérimentaux des maladies cardiovasculaires sont essentiels pour étudier les mécanismes de la maladie, l’exactitude du diagnostic et le développement de nouvelles thérapies. Plusieurs modèles expérimentaux ont été proposés par de nombreux laboratoires. Il est de la plus haute importance de choisir un modèle avec des avantages significatifs; la faisabilité, la répétabilité et la similitude avec les maladies humaines sont des facteurs clés dans la sélection des modèles de maladies cardiovasculaires3. Les cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSCs) porteuses de mutations spécifiques associées à la cardiomyopathie sont une alternative prometteuse aux modèles animaux4. Bien que de nombreuses stratégies ont été décrites pour induire des cardiomyocytes à l’aide d’iPSCs5,6,7,8,9, ici nous fournissons une méthode simple pour produire un modèle IHD en utilisant des cardiomyocytes différenciés des hiPSCs, dans lequel la sélection laborieuse de cardiomyocyte utilisant des marqueurs n’est pas appliquée. Dans cette méthode, les cardiomyocytes sont sélectionnés fonctionnellement en analysant la contraction spontanée.
L’induction des cardiomyocytes utilisant hiPSC évite le sacrifice animal et la chirurgie techniquement difficile. L’établissement de modèles animaux de l’IHD nécessite des techniques chirurgicales difficiles10. Il est presque impossible de simuler parfaitement les divers aspects pathophysiologiques des maladies cardiaques humaines, tels que la fréquence cardiaque et les potentiels d’action de la physiologie des rongeurs. Couplé à la moralité et à l’éthique de l’utilisation de modèles animaux, le développement de nouveaux modèles expérimentaux autres que les modèles animaux est impératif. Les cardiomyocytes différenciés des cellules iPS humaines imitent mieux l’état physiologique du coeur humain. Dans ce protocole, nous établissons un modèle d’IHD utilisant des cardiomyocytes dérivés des cellules hiPS (hiPS-CM). Dans notre modèle, la privation d’oxygène et de glucose conduit à une diminution de la force contractile et la viabilité des hiPS-CM. Notre méthode fournit une nouvelle approche pour le modèle IHD et démontre une nouvelle plate-forme pour l’étude de cette maladie.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Actin staining reagent (ActinRed 555 ReadyProbes Reagent)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>R37112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti cardiac troponin T antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>MA5-12960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiomyocyte maintenance medium (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>A2921201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell dissociation enzymes (TrypLE Select)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>12563011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differentiation medium A (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>A2921201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differentiation medium B (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>A2921201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Aria III system</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescenct microscope</td>
			<td>KEYENCE, Osaka, Japan</td>
			<td>BZ-X710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 secondary antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>A28175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human iPS cells</td>
			<td>RIKEN, Tsukuba, Japan</td>
			<td>201B7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxic incubator</td>
			<td>SANYO, Osaka, Japan</td>
			<td>MCO-175M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC growth medium (Essential 8 Medium)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>A1517001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC maintenance medium (StemFit AK02N)</td>
			<td>Ajinomoto, Tokyo, Japan</td>
			<td>RCAK02N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin (iMatrix-511)</td>
			<td>Nippi, Tokyo, Japan</td>
			<td>iMatrix-511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT assay kit (MTT Cell Proliferation Assay Kit)</td>
			<td>Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA</td>
			<td>10009365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleus staining reagent (NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>R37606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Nacalai Tesque, Kyoto, Japan</td>
			<td>35501-02</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

model of ischemic heart disease and video-based comparison of cardiomyocyte contraction using hipsc-derived cardiomyocytes

La cardiopathie ischémique est une cause importante de décès dans le monde entier. Il a donc fait l’objet d’une énorme quantité de recherches, souvent avec des modèles de petits animaux tels que les rongeurs. Cependant, la physiologie du cœur humain diffère considérablement de celle du cœur des rongeurs, soulignant la nécessité de modèles cliniquement pertinents pour étudier les maladies cardiaques. Ici, nous présentons un protocole pour modéliser la maladie cardiaque ischémique utilisant des cardiomyocytes différenciés des cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPS-CM) et pour quantifier les dommages et l’affaiblissement fonctionnel des cardiomyocytes ischémiques. L’exposition à 2% d’oxygène sans glucose et sérum augmente le pourcentage de cellules blessées, ce qui est indiqué par la coloration du noyau avec l’iodure de propidium, et diminue la viabilité cellulaire. Ces conditions diminuent également la contractilité des hiPS-CM comme confirmée par l’analyse de champ vectoriel de déplacement des images vidéo microscopiques. Ce protocole peut en outre fournir une méthode pratique pour le dépistage personnalisé des médicaments en facilitant l’utilisation de cellules hiPS de patients individuels. Par conséquent, ce modèle de cardiopathie ischémique, basé sur iPS-CMs d’origine humaine, peut fournir une plate-forme utile pour le dépistage des médicaments et la poursuite de la recherche sur les maladies cardiaques ischémiques.

Les cellules différenciées avec succès montrent une contraction spontanée au microscope (Vidéo 1). En règle générale, 50 % des puits présentent une contraction spontanée en 20 jours (Figure supplémentaire 1). Les protéines de marqueur cardiaque (p. ex., cTNT) peuvent être utilisées pour confirmer une différenciation réussie (figure 2).
En règle générale, les cellules du groupe ischémique présentent une viabilité plus faible dans les tests MTT (figure 3A) et la contractilité (figure 3E,F, Figure supplémentaire 2) que celles du groupe témoin normoxique. En outre, le rapport des cellules ipodides-positives propidium est plus élevé dans le groupe ischémique que dans le groupe témoin (figure 3B–D), ce qui indique des dommages cellulaires plus élevés.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61104/61104fig01.jpg"> Figure 1 : Structure de dossier pour l’analyse vectorielle de déplacement à l’aide d’imageJ. « joblist.txt » décrit le chemin d’accès aux fichiers de films de chaque ligne. S’il y a trois fichiers à analyser, il y aura trois dossiers (film1, movie2 et movie3), dans lesquels « analyze.avi » (le film d’intérêt) doit être placé. Une fois l’analyse effectuée par le code « vector_analysis.ijm », les fichiers seront générés (indiqués en bleu) dans chaque dossier de film. Les informations stockées dans chaque fichier sont expliquées en détail dans le texte principal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61104/61104fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61104/61104fig02.jpg"> Figure 2 : Image représentative de la coloration des marqueurs cardiaques. Expression de la troponine cardiaque de protéine de marqueur cardiaque T (cTnT). Bleu: 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI), rouge: actin, vert: cTnT. Inset : expression strié de cTnT, qui correspond à la structure sarcomère. Barre d’échelle, 50 μm. Ce chiffre a été modifié par Wei et coll.13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61104/61104fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61104/61104fig03.jpg"> Figure 3 : Images représentatives de l’analyse de viabilité cellulaire, de l’évaluation des dommages cellulaires et de la contractilité. (A) Comparaison de la viabilité cellulaire (essai MTT). Une absorption plus élevée indique une viabilité plus élevée. n = 5 pour chaque condition. (B, C et D) Analyse de cytométrie de flux des cellules tachées d’iodure de propidium (PI). Les cellules ischémiques présentent une intensité de dispersion vers l’avant réduite et une fluorescence accrue de PI, comparées au contrôle. (D) Pourcentage de cellules tachées d’IP dans l’analyse de cytométrie du flux. n = 3 pour chaque condition. (E) Analyse de la contractilité iPS-CMs à l’aide du logiciel ImageJ. Les vecteurs rouge et bleu indiquent les contractions les plus importantes et les plus petites, respectivement. Barre d’échelle, 100 μm. (F) Analyse quantitative de la contractilité iPS-CM à l’aide du code. n = 3 pour le contrôle et n = 8 pour l’état ischémique. Les barres d’erreur représentent l’erreur standard de la moyenne. Pour l’analyse statistique, le test t de l’étudiant à deux queues non apparié a été effectué. *: p < 0,05, **: p < 0,01. : p < 0,0001. Ce chiffre est cité par Wei et coll.13<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61104/61104fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
Vidéo 1 : Les cellules différenciées montrent une contraction spontanée au microscope. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61104/61104_before.wmv" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.</a>
Figure supplémentaire 1 : Analyse Kaplan-Meier du pourcentage d’échantillons sans contraction spontanée. 50% des échantillons d’iPS-CM ont montré la contraction le jour 20. Le jour 30, 64,4 % des échantillons présentaient une contraction. n = 83. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61104/61104supfig01.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce chiffre.</a>
Figure supplémentaire 2 : Évaluation de la contractilité cardiaque. La contractilité à l’échelle obtenue en divisant la contractilité C par le nombre de points d’analyse (x, y) a été tracée pour le contrôle et les groupes ischémiques avant et après l’exposition à l’hypoxie de 24 h. n = 3 pour le contrôle et n = 8 pour l’état ischémique. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61104/61104supfig02.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce chiffre.</a>
Figure supplémentaire 3 : Évaluation du contenu des cardiomyocytes. Immunostaining de la protéine de marqueur cardiaque sur une plaque de puits de 96. Vert: cTnT, Bleu: DAPI. Le taux des cellules différenciées a été calculé à 20,7 ± 9,6 % en divisant la superficie de la région tachée de ttn par celle de la région tachée par le DAPI. Barre d’échelle = 1 mm. n = 4 pour l’état de contrôle. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61104/61104supfig03.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce chiffre.</a>
Fichier de codage supplémentaire. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61104/Supplementary_Coding_File.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Model of Ischemic Heart Disease and Video-Based Comparison of Cardiomyocyte Contraction Using hiPSC-Derived Cardiomyocytes at JoVE.com

Model of Ischemic Heart Disease and Video-Based Comparison of Cardiomyocyte Contraction Using hiPSC-Derived Cardiomyocytes

Nous présentons un modèle de maladie cardiaque ischémique utilisant des cardiomyocytes dérivés des cellules souches pluripotentes induites par l’homme, avec une méthode pour l’évaluation quantitative des dommages tissulaires causés par l’ischémie. Ce modèle peut fournir une plate-forme utile pour le dépistage des médicaments et la recherche sur les maladies cardiaques ischémiques.

Modèle de cardiopathie ischémique et comparaison vidéo de la contraction cardiomyocyte à l’aide de cardiomyocytes dérivés de hiPSC

Ischemic heart disease is a significant cause of death worldwide. It has therefore been the subject of a tremendous amount of research, often with ...

La recherche sur les maladies cardiaques est souvent effectuée chez les petits mammifères comme les rongeurs. Cependant, la physiologie du cœur humain diffère considérablement de celle du cœur des rongeurs. Notre protocole utilise des cardiomyocytes différenciés des cellules iPS humaines pour modéliser les cardiopathies ischémiques et quantifier les dommages et l’affaiblissement fonctionnel des cardiomyocytes ischémiques.Ce protocole peut fournir une méthode pratique pour le dépistage personnalisé des médicaments à l’aide de cellules iPS dérivées de patients individuels, la manipulation appropriée des cellules iPS, comme dans l’utilisation d’un milieu frais, et le changement du milieu lentement et ponctuellement est essentiel pour assurer une différenciation réussie en cardiomyocytes fonctionnels. Chen Wang, doctorant d’un laboratoire, démontrera la procédure avec Yun Liu, Yin Liang et Mengxue Wang. Pour induire la différenciation des cellules souches pluripotentes induites par l’homme en cellules cardiaques, enduire d’abord les puits d’une plaque de culture de puits de 96 avec 100 microlitres de 1.675 microgrammes par millilitre de laminine dans PBS.Après une incubation de 30 minutes à 37 degrés Celsius, voir trois fois 10 à la quatrième cellules souches dans 200 microlitres de milieu de maintenance IPS complété par 10 micromolaires Y27632 dans chaque puits, et retourner la plaque à l’incubateur de culture cellulaire. Après 24 heures, remplacer les super moyens par 200 microlitres de milieu de croissance IPS par puits, et retourner la plaque à l’incubateur de culture cellulaire pour deux à trois jours supplémentaires. Lorsque les cellules atteignent 70 à 80%confluency.Remplacez le milieu de chaque puits par 200 microlitres de milieu de différenciation préchauffé A et retournez la plaque à l’incubateur de culture cellulaire pendant encore 48 heures. À la fin de l’incubation a lentement remplacé le supernatant dans chaque puits avec 200 microlitres de préchauffé milieu de différenciation B et retourner la plaque à l’incubateur de culture cellulaire. Après deux jours, remplacer les supernatants par 200 microlitres de milieu d’entretien des cardiomyocytes préchauffés par puits et retourner la plaque à l’incubateur de culture cellulaire pour un temps jusqu’à 30 jours.Pour évaluer la contractilité des cardiomyocytes, installez l’image de velocimétrie d’image de particule j plugin et utilisez un microscope de contraste de phase et l’objectif de fourches pour enregistrer des images vidéo des cellules à environ 20 images par seconde pendant environ 10 secondes. Enregistrez ensuite le fichier vidéo tel qu’analysé notre API et créez une structure de dossier comme indiqué. Pour analyser les champs vectoriels bidimensionnels discrets du déplacement cellulaire, lancez VG et sélectionnez des plugins, des macros et modifiez pour ouvrir l’analyse vectorielle.ijm, puis cliquez sur exécuter l’analyse sera effectuée automatiquement. Pour le traitement ischémique, remplacer le supernatant dans chaque puits par 200 microlitres de dmem sans glucose et sérum, puis placer la plaque dans une chambre hypoxique puis infuser le gaz azoté dans la chambre, en maintenant la concentration interne d’oxygène à 2% et la concentration de dioxyde de carbone à 5% pendant 24 heures. Les cellules différenciées avec succès, démontre la contraction spontanée comme observé sous le microscope avec 50% des puits de culture présentant typiquement la contraction spontanée en moins de 20 jours.La protéine de marqueur cardiaque peut également être employée pour confirmer une différenciation réussie Cellules du groupe ischémique montrent typiquement une viabilité inférieure dans des analyses de MTT, et une contractilité inférieure que ceux du groupe témoin normoxique. Le rapport des cellules positives d’iodure de propidium est également plus élevé dans le groupe ischémique, que dans le groupe témoin, indiquant une incidence plus élevée des dommages cellulaires. Il est important que vous localisez avec précision les régions d’intérêt dans la plaque de capture pour permettre la comparaison de la contractilité des cardiomyocytes.Cette technique peut être utilisée pour le dépistage des médicaments, en utilisant des cellules iPS dérivées du patient. Il fournit également une plate-forme unique pour élucider davantage les mécanismes sous-jacents aux maladies cardiaques ischémiques

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Generation of Ventricular-Like HiPSC-Derived Cardiomyocytes and High-Quality Cell Preparations for Calcium Handling Characterization

Génération de cardiomyocytes dérivés de HiPSC ventriculaires et de préparations cellulaires de haute qualité pour la caractérisation de la manipulation du calcium

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs) provide a valuable human source for studying the basic science of calcium (Ca2+) ...

Electromechanical Assessment of Optogenetically Modulated Cardiomyocyte Activity

Évaluation électromécanique de l’activité cardiomyocyte modulée d’optogenetically

Over the past two decades, optogenetic tools have been established as potent means to modulate cell-type specific activity in excitable tissues, including ...