Kristen Brennand is a New York Stem Cell Foundation - Robertson Investigator. The Brennand Laboratory is supported by a Brain and Behavior Young Investigator Grant, National Institute of Health (NIH) grant R01 MH101454 and the New York Stem Cell Foundation.

1. hiPSC différenciation de cellules progénitrices neurales <ol><li> Grandir et se développer hiPSCs dans les cellules souches embryonnaires humaines (HES) médias (tableau 1) co-cultivées sur une fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) de couche d&#39;alimentation jusqu&#39;à ce que les grandes (mais subconfluentes) colonies sont prêts pour la différenciation neuronale via un corps embryoïdes (EB) intermédiaire (Figure 2). Conditions de culture de routine hiPSC sont bien décrits ailleurs 16,17; brièvement, grandir hiPSCs dans les médias HES sur une couche nourricière MEF jusqu&#39;à la confluence, puis le passage par voie enzymatique avec de la collagénase (1 mg / ml dans DMEM) et étendre environ 1: 3 tous les 7 jours. </li><li> Pour préparer des plaques revêtues de poly-L-ornithine / laminine, des plaques de revêtement de 10 g / ml de poly-L-ornithine dans de l&#39;eau stérile pour les surfaces en plastique (50 g / ml pour les surfaces de verre) et incuber à température ambiante pendant 3-24 heures. Laver au moins une fois avec de l&#39;eau stérile, puis enrober de 5g / ml laminine dans du PBS stérile à température ambiante pendant 3 à 24 h. NOTE: Si enveloppés dans du plastique, les plaques peuvent êtrestockée jusqu&#39;à six mois à -20 ºC. </li><li> Le Jour 1, soulevez enzymatique hiPSCs subconfluentes (généralement cultivées sur des MEF, ou hiPSCs cultivés dans des milieux définis tels que REET 18 sur Matrigel) de la plaque que les grandes colonies en utilisant 1 mg / ml collagénase IV dans du DMEM / F12. NOTE: Après 1-2 heures d&#39;incubation à 37 ° C, les colonies sera flottant dans le plat. </li><li> Lavez délicatement colonies hiPSC (par décantation, la centrifugation pas) 1-2x avec DMEM / F12, remettre en suspension dans 2 ml / puits de N2 / médias B27 (tableau 1) et le transfert aux plats non adhérent 6 puits (combiner trois puits dans une eh bien) 19. REMARQUE: Pendant la nuit, les colonies formeront flottants grappes sphériques appelé «corps embryoïdes&quot; (EbS). Attendez-vous à une mort cellulaire importante. </li><li> Le Jour 2, les plaques d&#39;inclinaison et de permettre de régler EB. Retirez délicatement les médias et laver une fois avec DMEM / F12 pour enlever les débris. Nourrissez-le avec N2 / B27 milieux supplémentés avec des inhibiteurs SMAD double (0,1 M LDN193189 et 10M SB431542) 12 </sup&gt;. </li><li> Sur Jours 3-7, neuralisation se produira dans le cadre de la double inhibition SMAD; vérifier que EB sont ronds mais pas kystique. EB nourrir tous les deux jours avec les médias N2 / B27 complété avec 0,1 M LDN193189 et 10M SB431542. </li><li> Sur Jours 7-14, à la suite du dépôt EBS pour Poly-L-ornithine / laminine plaques revêtues, consultez l&#39;aide d&#39;un microscope à fond clair que rosettes neurones commencent à apparaître dans quelques jours (caractérisé comme des grappes de cellules rondes neuroépithéliales avec apico-basale polarité; figure 1). Continuer à alimenter EB adhérentes chaque seconde de jour avec N2 / B27 médias complété avec 0,1 M de LDN193189, 10M SB431542 et 1 g / ml laminine. </li></ol> 2. Récolte de Neural rosettes NOTE: Nous recommandons que rosettes neuronaux être récoltées en utilisant enzymatique Réactif de Sélection Neural Rosette 20 ou réactif de sélection similaire. Bien rosettes de neurones peuvent être récoltés manuellement dans 6 puits Poly-L-ornithine / laminine plaque revêtue, this méthodologie prend une formation approfondie pour maître, et, en fonction de l&#39;utilisateur compétences, peuvent nécessiter un second tour de la cueillette à jour 20 pour enrichir encore plus pour les PNJ et épuiser types de cellules non-neuronales. <ol><li> Pour la sélection enzymatique de rosettes de neurones au jour 14, les médias aspirer de EB adhéré et ajouter 1 ml de neurones réactif de sélection de la rosette par puits pour une plaque à 6 puits. Incuber à 37 ° C pendant 1 heure. </li><li> Avec un Pipetman P1000, retirez délicatement enzyme de chaque puits. Ajouter 1 ml de DMEM / F12 par puits pour se laver. </li><li> Avec un P1000, recueillir les 1 ml de DMEM / F12 et rapidement expulser le DMEM / F12 dans le puits, détachant ainsi les rosettes de la plaque. Recueillir les rosettes dans un tube de faucon. </li><li> Pipet encore 1 ml de DMEM / F12 et rapidement expulser dans le même puits pour détacher rosettes restants. (Ne pas triturer. Essayez de ne pas casser les agrégats de la rosette). Recueillir les rosettes de neurones dans un même tube de faucon. </li><li> Répétez l&#39;étape 2.4 si nécessaire. Si rosettes ne se détachent pas facilement, ajouter more enzyme et répétez le processus (étapes 2.1 à 2.4) </li><li> Spin cellules à 300 g pendant 3 min. Aspirer le lavage, et remettre en suspension dans 2 ml rosettes des médias PNJ (tableau 1). cellules de transfert (1: 1) dans un poly-L-ornithine / laminine revêtus 6 plaque bien. </li><li> De 15 à 21 jours, les rosettes de neurones augmenteront; rosettes d&#39;alimentation à chaque seconde de jour avec le PNJ médias. </li><li> Évaluer la qualité des rosettes de neurones et de se assurer que les cellules de fibroblastes plats ne se développent pas dans la culture. NOTE: Si les non-rosettes persistent, la culture PNJ peut parfois être récupéré par cueillette manuelle, en sélectionnant seulement le meilleur des rosettes cueillies dans Accutase. Dissocier 15 min à 37 ° C. Pellet, laver et plaque dans PNJ support sur 24 puits Poly-L-ornithine / laminine plaque revêtue. </li></ol> 3. expansion des cellules progénitrices neurales Remarque: NPC hiPSC peut être cultivé sur navigateur Matrigel- ou poly-L-ornithine / laminine plaques revêtues. Nous utilisons généralement MatrigeL-plats, car ils peuvent être préparés plus rapidement et à moindre coût. <ol><li> Pour préparer des plaques enduites de Matrigel, décongeler rapidement et remettre en suspension une portion aliquote congelée de 1 mg dans 24 ml de Matrigel froid DMEM / F12 et distribuer immédiatement 2 ml à chaque puits de deux plaques à six puits. Incuber pendant au moins 1 heure à 37 ºC. NOTE: Matrigel a seulement besoin d&#39;être aspiré, pas lavé, immédiatement avant l&#39;utilisation. </li><li> Nourrir PNJ tous les deux jours et maintenir à très haute densité ou ils spontanément se différencier pour les neurones. REMARQUE: Bien que les PNJ plus établis sont généralement divisées 1: 4 chaque semaine, les PNJ de passage très faibles peuvent être répartis 1: 2 comme peu souvent qu&#39;une fois toutes les deux semaines. </li><li> Pour diviser, premier média aspirer et ajouter 1 ml chaude Accutase (1X) par puits de plaque de 6 puits. Incuber à 37 ° C pendant 10-15 min. </li><li> Transférer en douceur les cellules individuelles dans un tube de 15 ml contenant du DMEM / F12 avec aussi peu de contraintes mécaniques que possible. Ne pas titrer cellules tout en enzyme. Cellules granules par Spinning à 1000 g pendant 5 min. </li><li> Aspirer le lavage, et remettre en suspension les PNJ dans ~ 1 ml PNJ médias par puits original de 6 puits. REMARQUE: Attendez que le puits de confluence d&#39;un plat à 6 puits a 5-10000000 cellules; Ceci peut être confirmé par le comptage d&#39;un aliquote de 10 litres de cellules en utilisant un hémocytomètre avant de re-placage. </li><li> Après remise en suspension, PNJ re-plaque comme PNJ, ou neurones neurosphères. Pour maintenir PNJ, la plaque d&#39;environ 1-2 millions de cellules par puits d&#39;une plaque à 6 puits. L&#39;efficacité de la formation de neurosphères peut varier entre les expériences et les lignées cellulaires, mais se produit généralement préférable que entre 200.000 et 1.000.000 cellules sont ensemencées par puits d&#39;une plaque à 6 puits non adhérente; si l&#39;agglutination des neurosphères se produit, réduire le nombre de cellules ensemencées. Pour différencier les neurones, plaque environ 200 000 cellules par puits d&#39;une plaque à 6 puits, remplaçant médias NPC avec les médias neurone. </li><li> Immunohistochimique valider chaque ligne PNJ établie. Une fois que suffisamment de matériel cellulaire a été expanDED, des PNJ d&#39;étiquettes avec des anticorps pour la nestine et SOX2. Validé lignes PNJ devraient également être différenciées en neurones pendant 4-6 semaines, et marquées avec des anticorps pour III-tubuline et MAP2AB. <ol><li> Fixer les cellules dans 4% de paraformaldehyde dans du PBS à 4 ° C pendant 10 min. Perméabiliser PNJ à température ambiante pendant 15 min dans 1,0% de Triton dans du PBS, puis bloquer dans le sérum de l&#39;âne de 5% avec 0,1% de Triton à température ambiante pendant 30 min. </li><li> Incuber avec l&#39;anticorps primaire dans le sérum de l&#39;âne de 5% avec 0,1% de Triton, une nuit à 4 ° C. NOTE: Nous vous recommandons les anticorps suivants: chèvre anti-Sox2, 1: 200; de souris anti-nestine humaine, 1: 200; de lapin anti-BIII-tubuline, 1: 500; anti-BIII-tubuline de souris, 1: 500; anti-MAP2AB souris, 1: 200. (Figure 2). </li><li> Après un lavage avec du PBS, les cellules incuber des anticorps secondaires avec l&#39;anticorps secondaire approprié conjugué à de chèvre, de souris ou de lapin à 1: 300, en en 5% de sérum de âne avec 0,1% de Triton pendant 1-2 heures à température ambiante. Pour visualiser les noyaux, les cellules de coloration avec 0,5 ug / ml de DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-phénylindole) puis monter avec Vectashield. </li></ol></li></ol> 4. PNJ transduction <ol><li> Utilisation spinfection (centrifugation de plaques de culture de cellules en présence de virus à 1000 x g pendant 1 heure) pour augmenter le pourcentage de cellules transfectées 21. Aspirer le milieu et remplacer par la surexpression pertinentes (ou de contrôle) ou lentivirus (rétrovirus), titrés à la multiplicité désirée d&#39;infection (MOI) (typiquement 1-10), diluée dans les médias NPC. Utiliser 1,5 ml de volume par puits d&#39;une plaque à 6 puits (ou un volume à l&#39;échelle appropriée pour d&#39;autres types de plaques de culture de tissus). Spin à 1000 xg et 37 ºC pendant 1 heure dans une centrifugeuse de la plaque. REMARQUE: Idéalement, la transduction PNJ avec lentiviral ou vecteurs rétroviraux dans les 1-2 jours de fractionnement. Que l&#39;on utilise des virus commerciales ou préparés en laboratoire, il peut être utile pour titrer appropriée lots de virus à l&#39;avance par dilution en série. (Figure 3). </li><li> Pour réduire cellular mort, remplacer le support dans les 8 h de spinfection. REMARQUE: l&#39;intégration virale et l&#39;expression du transgène doit être détectable dans les 24 heures par fluorescence d&#39;un gène rapporteur. (Si le virus manque d&#39;un rapporteur fluorescent, ce est plus difficile à évaluer; transfection réussie peut être mieux validée par immunoblot, immunohistochimie ou qPCR pour les produits de surexpression.) Pleine expression peut prendre 3-7 jours; spinfections répétés avec le virus supplémentaires peuvent être nécessaires pour augmenter le pourcentage de cellules transfectées. Spinfections récurrentes peuvent se produisent quotidiennement, mais pas besoin d&#39;être si fréquent. Idéalement, si vous utilisez un rapporteur fluorescent,&gt; 80% des cellules doit être étiqueté. </li></ol> 5. Migration Neurosphère Assay REMARQUE: Neurosphères forme spontanément, suite à la dissociation enzymatique de PNJ (par une manière identique à celle utilisée dans l&#39;expansion PNJ - étapes 3/3 à 3/6), si les cellules sont cultivées en suspension dans PNJ médias. <ol><li> Brièvement, grandir dissocierPNJ dans les médias d NPC pour 48 h dans des plaques non adhérentes afin de générer neurosphères. (Figure 4). </li><li> Pour la migration de neurosphère, préparer des plaques Matrigel frais en utilisant les médias NPC froid, plutôt que DMEM, dans une plaque de 96 puits, 1-2 heures avant neurosphère cueillette. Ne pas aspirer les puits de Matrigel. </li><li> Tel que publié pour souches embryonnaires neurosphères dérivées de cellules 22, choisissez manuellement neurosphères NPC dérivés sous un microscope, après avoir lavé une fois dans les médias NPC pour éliminer les débris cellulaires. Transférer une neurosphère à chaque puits d&#39;une plaque de 96 puits Matrigel revêtu. </li><li> Ajouter un montant supplémentaire de 0,5 mg Matrigel, dilué dans les médias NPC froides, les neurosphères dans chaque plaque de 96 puits. </li><li> Centrer manuellement chaque neurosphère individuelle au milieu du puits en utilisant une pipette. NOTE: Il est important de choisir neurosphères de taille similaire, afin de réduire la variabilité dans les résultats. </li><li> Permettre la migration de se produire pendant 48 heures et ensuite fixer les cellules wième paraformaldéhyde 4% et les taches avec des marqueurs immunohistochimiques souhaités. </li><li> Si la migration radiale doit être déterminée, neurosphères de photographie dans leur entièrement en utilisant un objectif 4x microscope. Exclure des neurosphères en contact avec le bord du puits ou une seconde neurosphères à partir de l&#39;analyse. NOTE: Si la migration se produit pendant plus de 48 heures, la migration radiale résultante sera probablement trop grand pour l&#39;image en utilisant un objectif 4x. </li><li> Mesurer la migration moyenne de chaque neurosphère l&#39;aide du logiciel NIH ImageJ (figure 5). Ceci peut être réalisé en utilisant l&#39;une des méthodes d&#39;analyse décrites ci-dessous: <ol><li> La migration Radial: <ol><li> Tracer manuellement le bord des cellules les plus éloignées de la migration à l&#39;aide de l&#39;outil de sélection à main levée puis utilisez la fonction (Ctrl + M) Mesure pour calculer l&#39;aire de la forme obtenue. Avant de mesurer la zone assurez-vous que la région est cochée dans la fenêtre Définir les mesures trouve sous l&#39;onglet Analyser. Utilisez leLa valeur de la mesure de surface et l&#39;équation de la surface d&#39;un cercle (A = πr 2) pour déterminer le rayon (externe). </li><li> Tracer le bord de la neurosphère origine, mesurer la surface et de calculer le rayon (intérieure) de la même manière. Calculer la migration radiale totale comme étant la différence entre les rayons externe et interne. </li></ol></li><li> Greatest migration cellulaire: <ol><li> Mesurer la distance parcourue des cinq cellules les plus éloignées du bord de la neurosphère intérieure en utilisant l&#39;outil de sélection en ligne droite suivie par la fonction (Ctrl + M) Mesure. </li></ol></li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Nous avons décrit les méthodes permettant de différencier hiPSCs dans PNJ, un type de cellules neurales dans laquelle une fraction importante de la signature génétique des neurones hiPSC dérivés est conservée et que peuvent servir comme un proxy pour les voies de développement susceptibles de contribuer à la maladie pathogenèse 8, 11. En outre, comme nous l&#39;avons précisé, les PNJ sont une population de neurones robuste réplicative et facilement transduites, qui nous croyons peut être approp...

des études d&#39;expression génique de neurones différenciés in vitro à partir de cellules souches pluripotentes d&#39;origine humaine (les) hiPSCs par nous et d&#39;autres 1 2,3 indiquent que les neurones hiPSC ressemblent foetal plutôt que le tissu cérébral adulte. À l&#39;heure actuelle, les modèles fondés sur hiPSC peuvent être plus appropriées pour l&#39;étude de prédisposition à, plutôt que de caractéristiques tardive de la maladie neurologique. Nous avons précédemment rapporté que une fraction significative de la signature de gène de neurones hiPSC dérivé schizophrénie est conservée dans les cellules de la schizophrénie de hiPSC dérivé progénitrices neurales (CNP), indiquant que CPN peut être un type cellulaire utile pour étudier les mécanismes moléculaires qui contribue à la schizophrénie 1 . Nous et d&#39;autres avons signalé la migration aberrante, augmentation du stress oxydatif et les espèces réactives de l&#39;oxygène, la sensibilité à la sous-seuil stress environnementaux et la fonction mitochondriale altérée dans la schizophrénie hiPSC PNJ 1,4-6, ainsi qu&#39;une diminution de c neuronaleonnectivit é et la fonction synaptique dans les neurones de la schizophrénie hiPSC 5,7-10. Si les facteurs moléculaires contribuent à la migration aberrante et / ou le stress oxydatif dans la schizophrénie hiPSC PNJ sous-tendent également la connectivité neuronale réduite dans les neurones hiPSC dérivés schizophrénie, PNJ pourraient être une population de neurones robuste et très réplicative avec lequel pour étudier les mécanismes responsables de la maladie. En outre, parce que l&#39;on peut générer rapidement un grand nombre de cellules et ne doivent pas attendre des semaines ou des mois pour la maturation neuronale, tests basés sur PNJ sont adaptés pour l&#39;étude de cohortes de patients plus importants et sont plus disposés à criblage à haut débit. Nous croyons que hiPSC PNJ peut servir comme un proxy pour les voies de développement susceptibles de contribuer à la pathogenèse de la maladie, comme cela a déjà été démontré dans de troubles aussi divers que la schizophrénie 1 et la maladie de Huntington 11. Pour différencier les PNJ de se hiPSCs, neurale initialela production est réalisée par double inhibition SMAD (0,1 mM et 10 mM LDN193189 SB431542) 12. En se opposant BMP et TGF signalisation avec ces petites molécules, l&#39;endoderme et du mésoderme spécification est bloquée, ce qui accélère la différenciation neuronale et conduisant à la formation de rosettes de neurones visibles dans la semaine de placage. Neural motif se produit au début de ce processus, probablement au cours de la période de la formation de rosettes de neurones et immédiatement après. En l&#39;absence d&#39;autres indices, ces cellules nerveuses primitives supposent un cerveau antérieur comme le destin antérieure-13. Immédiatement après la formation de rosettes de neurones, et continue tout au long de l&#39;expansion de l&#39;APN, PNJ cerveau antérieur sont cultivées avec FGF2 8,14. Ils ont le potentiel de la lignée double et peuvent être différenciés aux populations de neurones de 70-80% neurones III-tubuline-positifs et de 20 à 30% protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) astrocytes -positifs (Figure 1). La majorité des neurones du cerveau antérieur hiPSC sont VGLUT1 positif, Et sont donc vraisemblablement glutamatergique, même si environ 30% des neurones sont GAD67 positif (GABAergique) 8. PNJ sont régulièrement soumises à des passages plus de dix fois in vitro, tout en maintenant des profils de différenciation cohérentes et sans accumuler des anomalies du caryotype. Groupes ont rapporté PNJ de passages plus de 40 fois 15, cependant, nous constatons que plus de dix passages, PNJ montrent propension accrue à la différenciation des astrocytes. PNJ bien tolérer plusieurs gel-dégel et peut être la transition de croître comme neurosphères simplement en culture dans des plaques non-adhérentes. PNJ sont efficacement transduites par des vecteurs viraux, permettant l&#39;évaluation rapide des conséquences moléculaires et cellulaires de la perturbation génétique et facilement extensible pour obtenir suffisamment de matériel pour les études biochimiques. En outre, en raison des vecteurs viraux permettent robuste sur-expression et / ou inactivation de gènes responsables de maladies concerné, soit le contrôle ou le patient dérivée neural cellules, on peut utiliser cette plateforme pour tester l&#39;effet de fond génétique sur ces manipulations. Bien que ne convient pas pour synaptique ou tests basés sur les activités nécessitant neurones matures, PNJ peut être une alternative pratique pour de nombreuses analyses moléculaires ou biochimiques simples de cellules neurales provenant de patients.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1174">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:171px;">Company</td>
			<td style="width:216px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:500px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:171px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:216px;">#11330</td>
			<td>for HES media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:171px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:216px;">#10565</td>
			<td style="width:500px;">for neural media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">KO-Serum Replacement</td>
			<td style="width:171px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:216px;">#10828</td>
			<td style="width:500px;">Needs to be lot tested</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Glutamax</td>
			<td style="width:171px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:216px;">#35050</td>
			<td style="width:500px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">NEAA</td>
			<td style="width:171px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:216px;">&#160;#11140</td>
			<td style="width:500px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">2&#8208;mercaptoethanol (55mM 1000x)</td>
			<td style="width:171px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:216px;">&#160;#21985-023</td>
			<td style="width:500px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">N2</td>
			<td style="width:171px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:216px;">&#160;#17502-048</td>
			<td style="width:500px;">Needs to be lot tested</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">B27-RA</td>
			<td style="width:171px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:216px;">&#160;#12587-010</td>
			<td style="width:500px;">Needs to be lot tested</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">FGF2</td>
			<td style="width:171px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:216px;">#13256-029</td>
			<td style="width:500px;">Resuspend in PBS + 1% BSA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">LDN193189</td>
			<td style="width:171px;">Stemgent</td>
			<td style="width:216px;">#04-0074</td>
			<td style="width:500px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">SB431542</td>
			<td style="width:171px;">Stemgent</td>
			<td style="width:216px;">#04-0010</td>
			<td style="width:500px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">BDNF</td>
			<td style="width:171px;">Peprotech</td>
			<td style="width:216px;">#450-02</td>
			<td style="width:500px;">Resuspend in PBS + 0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">GDNF&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Peprotech</td>
			<td style="width:216px;">&#160;#450-10</td>
			<td style="width:500px;">Resuspend in PBS + 0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Dibutyryl cyclic-AMP</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:216px;">&#160;#D0627</td>
			<td style="width:500px;">Resuspend in PBS + 0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">L-ascorbic acid</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:216px;">#A0278</td>
			<td style="width:500px;">Resuspend in H20</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">STEMdiff Neural Rosette Selection Reagent</td>
			<td style="width:171px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:216px;">&#160;#05832</td>
			<td style="width:500px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Accutase</td>
			<td style="width:171px;">Innovative Cell Technologies</td>
			<td style="width:216px;">AT-104</td>
			<td style="width:500px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Collagenase IV</td>
			<td style="width:171px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:216px;">#17104019</td>
			<td style="width:500px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">CF1 mEFs</td>
			<td style="width:171px;">Millipore</td>
			<td style="width:216px;">#PMEF-CF</td>
			<td style="width:500px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Poly-L-Ornithine</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:216px;">P3655</td>
			<td style="width:500px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Laminin, Natural Mouse 1mg</td>
			<td style="width:171px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:216px;">#23017-015</td>
			<td style="width:500px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">BD Matrigel</td>
			<td style="width:171px;">BD</td>
			<td style="width:216px;">#354230</td>
			<td style="width:500px;">Resuspend on ice in cold DMEM at 10mg/ml, use 1mg per two 6-well plate equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Tissue culture treated 6-well plates</td>
			<td style="width:171px;">Corning</td>
			<td style="width:216px;">3506</td>
			<td style="width:500px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Ultra low attachment 6-well plates</td>
			<td style="width:171px;">Corning</td>
			<td style="width:216px;">3471</td>
			<td style="width:500px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">goat anti-Sox2&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:216px;">sc&#173;17320</td>
			<td style="width:500px;">use at 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">mouse anti-human Nestin</td>
			<td style="width:171px;">Millipore</td>
			<td style="width:216px;">MAB5326</td>
			<td style="width:500px;">use at 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">rabbit anti-&#946;III-tubulin</td>
			<td style="width:171px;">Covance</td>
			<td style="width:216px;">PRB&#173;435P</td>
			<td style="width:500px;">use at 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">mouse anti-&#946;III-tubulin</td>
			<td style="width:171px;">Covance</td>
			<td style="width:216px;">MMS&#173;435P</td>
			<td style="width:500px;">use at 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">mouse anti-MAP2AB</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:216px;">M1406</td>
			<td style="width:500px;">use at 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Plate centrifuge</td>
			<td style="width:171px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:216px;">Beckman Coulter Allegra X-14 (with SX4750 plate carrier)</td>
			<td style="width:500px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a guide to generating and using hipsc derived npcs for the study of neurological diseases

Post-mortem studies of neurological diseases are not ideal for identifying the underlying causes of disease initiation, as many diseases include a long period of disease progression prior to the onset of symptoms. Because fibroblasts from patients and healthy controls can be efficiently reprogrammed into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs), and subsequently differentiated into neural progenitor cells (NPCs) and neurons for the study of these diseases, it is now possible to recapitulate the developmental events that occurred prior to symptom onset in patients. We present a method by which to efficiently differentiate hiPSCs into NPCs, which in addition to being capable of further differentiation into functional neurons, can also be robustly passaged, freeze-thawed or transitioned to grow as neurospheres, enabling rapid genetic screening to identify the molecular factors that impact cellular phenotypes including replication, migration, oxidative stress and/or apoptosis. Patient derived hiPSC NPCs are a unique platform, ideally suited for the empirical testing of the cellular or molecular consequences of manipulating gene expression.

Rosettes de neurones peuvent être identifiées morphologiquement en utilisant un microscope à fond clair, par leur aspect caractéristique en tant que clusters de cellules neuro-épithéliales rondes avec polarité apico-basale (Figure 1). Bien que les PNJ sont généralement cultivées à très haute densité cellulaire, immédiatement après repiquage, légèrement soma forme pyramidale et la structure bipolaire neurites est visible (figure 1D). PNJ validées expriment la nestine et...

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A Guide to Generating and Using hiPSC Derived NPCs for the Study of Neurological Diseases

This protocol describes how neural progenitor cells can be differentiated from human induced pluripotent stem cells, in order to yield a robust and replicative neural cell population, which may be used to identify the developmental pathways contributing to disease pathogenesis in many neurological disorders.

Un guide pour générer et utiliser hiPSC PNJ dérivés pour l&#39;étude des maladies neurologiques

Post-mortem studies of neurological diseases are not ideal for identifying the underlying causes of disease initiation, as many diseases include a long ...

a-guide-to-generating-using-hipsc-derived-npcs-for-study-neurological

Research

JoVE Journal

Medicine

18.1K vues.  Icahn School of Medicine at Mount Sinai. This protocol describes how neural progenitor cells can be differentiated from human induced pluripotent stem cells, in order to yield a robust and replicative neural cell population, which may be used to identify the developmental pathways contributing to disease pathogenesis in many neurological disorders.

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Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined by current drug efficacy tests and the efficacy on patients. Thus, novel and reliable methods for evaluating drug efficacy are warranted in pre-clinical phase. In vitro culture of tumor tissues, including cell lines, has substantial phenotypic, genetic, and epigenetic alterations of cancer cells caused by artificial environment of cell culture, which may not reflect the biology of original tumors in situ. Xenograft models with the immunodeficient mice also have limitations, i.e., the lack of immune system and interspecies genetic and epigenetic discrepancies in microenvironment. Here, we demonstrate a novel method using the surgical specimens of malignant glioma as undissociated tumor blocks to evaluate treatment effects. To validate this method, data with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide (TMZ), are described.


We used the freshly-removed surgical specimen of malignant glioma for our experiments. We performed intratumoral injection of TMZ or other drug candidates, followed by incubation and analysis on surgical specimens. Here, we sought to establish a tumor tissue explant method as a platform to determine the efficacy of novel anti-cancer therapies so that we may be able to overcome, at least, some of the current limitations and fill the existing gap between the current experimental data and the efficacy on an actual patient's tumor. This method may have the potential to accelerate identifying novel chemotherapeutic agents for solid cancer treatment.

Here, we established a method for drug efficacy testing with surgical specimens of brain tumors, termed &#x201C;tumor explant method&#x201D;. With this method, we can evaluate drug efficacy without breaking the microenvironment of solid tumors. To validate reliability of this method, we describe representative data with our glioma specimen treated with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide.

Méthode pour le développement de nouveaux médicaments anti-cancer en utilisant des explants des tumeurs des spécimens chirurgicaux


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

Recherche

Médecine

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for objective diagnosis but also for the evaluation of therapeutic efficacy and resilience to trauma. Ongoing research is directed at identifying molecular biomarkers for PTSD, including traumatic stress induced proteins, transcriptomes, genomic variances and genetic modulators, using biologic samples from subjects' blood, saliva, urine, and postmortem brain tissues. However, the correlation of these biomarker molecules in peripheral or postmortem samples to altered brain functions associated with psychiatric symptoms in PTSD remains unresolved. Here, we present an animal model of PTSD in which both peripheral blood and central brain biomarkers, as well as behavioral phenotype, can be collected and measured, thus providing the needed correlation of the central biomarkers of PTSD, which are mechanistic and pathognomonic but cannot be collected from people, with the peripheral biomarkers and behavioral phenotypes, which can.
Our animal model of PTSD employs restraint and tail shocks repeated for three continuous days - the inescapable tail-shock model (ITS) in rats. This ITS model mimics the pathophysiology of PTSD 17, 7, 4, 10. We and others have verified that the ITS model induces behavioral and neurobiological alterations similar to those found in PTSD subjects 17, 7, 10, 9. Specifically, these stressed rats exhibit (1) a delayed and exaggerated startle response appearing several days after stressor cessation, which given the compressed time scale of the rat's life compared to a humans, corresponds to the one to three months delay of symptoms in PTSD patients (DSM-IV-TR PTSD Criterian D/E 13), (2) enhanced plasma corticosterone (CORT) for several days, indicating compromise of the hypothalamopituitary axis (HPA), and (3) retarded body weight gain after stressor cessation, indicating dysfunction of metabolic regulation.
The experimental paradigms employed for this model are: (1) a learned helplessness paradigm in the rat assayed by measurement of acoustic startle response (ASR) and a charting of body mass; (2) microdissection of the rat brain into regions and nuclei; (3) enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for blood levels of CORT; (4) a gene expression microarray plus related bioinformatics tools 18. This microarray, dubbed rMNChip, focuses on mitochondrial and mitochondria-related nuclear genes in the rat so as to specifically address the neuronal bioenergetics hypothesized to be involved in PTSD.

We describe a rat model of post traumatic stress disorder (PTSD) that reveals the persistent alterations in neuroendocrine function and the delayed long-term, exaggerated fear response, characteristic of PTSD patients. The animal model and methods described here are useful for correlating biomarkers in brain nuclei, which are mechanistic but cannot be measured in patients, with biomarkers in peripheral white blood cells, which can.

Biomarqueurs dans un modèle animal pour Révéler Corrélats neuronaux, hématologiques et du comportement de stress post-traumatique

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

Utilizing Transcranial Magnetic Stimulation to Study the Human Neuromuscular System

Transcranial magnetic stimulation (TMS) has been in use for more than 20 years 1, and has grown exponentially in popularity over the past decade. While the use of TMS has expanded to the study of many systems and processes during this time, the original application and perhaps one of the most common uses of TMS involves studying the physiology, plasticity and function of the human neuromuscular system. Single pulse TMS applied to the motor cortex excites pyramidal neurons transsynaptically 2 (Figure 1) and results in a measurable electromyographic response that can be used to study and evaluate the integrity and excitability of the corticospinal tract in humans 3. Additionally, recent advances in magnetic stimulation now allows for partitioning of cortical versus spinal excitability 4,5. For example, paired-pulse TMS can be used to assess intracortical facilitatory and inhibitory properties by combining a conditioning stimulus and a test stimulus at different interstimulus intervals 3,4,6-8. In this video article we will demonstrate the methodological and technical aspects of these techniques. Specifically, we will demonstrate single-pulse and paired-pulse TMS techniques as applied to the flexor carpi radialis (FCR) muscle as well as the erector spinae (ES) musculature. Our laboratory studies the FCR muscle as it is of interest to our research on the effects of wrist-hand cast immobilization on reduced muscle performance6,9, and we study the ES muscles due to these muscles clinical relevance as it relates to low back pain8. With this stated, we should note that TMS has been used to study many muscles of the hand, arm and legs, and should iterate that our demonstrations in the FCR and ES muscle groups are only selected examples of TMS being used to study the human neuromuscular system.

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive tool to gain insight on the physiology and function of the human nervous system. Here, we present our TMS techniques to study cortical excitability of the upper limb and lumbar musculature.

Utilisant la stimulation magnétique transcrânienne à l&#39;étude du système neuromusculaire de l&#39;homme

Transcranial magnetic stimulation (TMS) has been in use for more than 20 years 1, and has grown exponentially in popularity over the past decade.  While ...

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

L&#39;homme neuroendocriniennes lignées cellulaires tumorales comme un modèle tridimensionnel pour l&#39;étude de la thérapie des tumeurs neuro-endocrines humaines

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient&#8217;s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

Isolement et immortalisation de lignées cellulaires de patients dérivé de la biopsie musculaire pour la modélisation des maladies

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

Using Saccadometry with Deep Brain Stimulation to Study Normal and Pathological Brain Function

The oculomotor system involves a large number of brain areas including parts of the basal ganglia, and various neurodegenerative diseases including Parkinson's and Huntington's can disrupt it. People with Parkinson's disease, for example, tend to have increased saccadic latencies. Consequently, the quantitative measurement of saccadic eye movements has received considerable attention as a potential biomarker for neurodegenerative conditions. A lot more can be learned about the brain in both health and disease by observing what happens to eye movements when the function of specific brain areas is perturbed. Deep brain stimulation is a surgical intervention used for the management of a range of neurological conditions including Parkinson's disease, in which stimulating electrodes are placed in specific brain areas including several sites in the basal ganglia. Eye movement measurements can then be made with the stimulator systems both off and on and the results compared. With suitable experimental design, this approach can be used to study the pathophysiology of the disease being treated, the mechanism by which DBS exerts it beneficial effects, and even aspects of normal neurophysiology.

This paper describes the use of quantitative measurement of eye movements in conjunction with stimulation of focal areas of the deep brain in order to study physiology, pathophysiology, and the mechanisms of deep brain stimulation.

Utilisation de Saccadometry avec la stimulation cérébrale profonde pour l&#39;étude normale et pathologique fonction cérébrale

The oculomotor system involves a large number of brain areas including parts of the basal ganglia, and various neurodegenerative diseases including ...

A Phenotyping Regimen for Genetically Modified Mice Used to Study Genes Implicated in Human Diseases of Aging

Age-related diseases are becoming increasingly prevalent and the burden continues to grow as our population ages. Effective treatments are necessary to lessen the impact of debilitating conditions but remain elusive in many cases. Only by understanding the causes and pathology of diseases associated with aging, can scientists begin to identify potential therapeutic targets and develop strategies for intervention. The most common age-related conditions are neurodegenerative disorders such as Parkinson's disease and blindness. Age-related macular degeneration (AMD) is the leading cause of blindness in the elderly. Genome wide association studies have previously identified loci that are associated with increased susceptibility to this disease and identified two regions of interest: complement factor H (CFH) and the 10q26 locus, where the age-related maculopathy susceptibility 2 (ARMS2) and high-temperature requirement factor A1 (HtrA1) genes are located. CFH acts as a negative regulator of the alternative pathway (AP) of the complement system while HtrA1 is an extracellular serine protease. ARMS2 is located upstream of HtrA1 in the primate genome, although the gene is absent in mice. To study the effects of these genes, humanized knock-in mouse lines of Cfh and ARMS2, knockouts of Cfh, HtrA1, HtrA2, HtrA3 and HtrA4 as well as a conditional neural deletion of HtrA2 were generated. Of all the genetically engineered mice produced only mice lacking HtrA2, either systemically or in neural tissues, displayed clear phenotypes. In order to examine these mice thoroughly and systematically, an initial phenotyping schedule was established, consisting of a series of tests related to two main diseases of interest: AMD and Parkinson's. Genetically modified mice can be subjected to appropriate experiments to identify phenotypes that may be related to the associated diseases in humans. A phenotyping regimen with a mitochondrial focus is presented here alongside representative results from the tests of interest.

A reverse-genetics approach to understanding gene families associated with human disease is presented, using mouse as a model system, and the subsequent mouse phenotyping schedule is described. Because mice defective in a gene of interest, HtrA2, manifested Parkinsonian symptoms, the phenotyping regimen is focused on identifying neurological defects.

A phénotypage Regimen pour des souris génétiquement modifiées utilisées pour étudier les gènes impliqués dans les maladies humaines du vieillissement

Age-related diseases are becoming increasingly prevalent and the burden continues to grow as our population ages. Effective treatments are necessary to ...

Setting Up a Stroke Team Algorithm and Conducting Simulation-based Training in the Emergency Department - A Practical Guide

Time is of the essence when caring for an acute stroke patient. The ultimate goal is to restore blood flow to the ischemic brain. This can be&#160;achieved by either&#160;thrombolysis with recombinant tissue-plasminogen activator (rt-PA), the standard therapy for stroke patients who present within the first hours of symptom onset without contraindications, or by an endovascular approach, if a proximal brain vessel occlusion is detected. As the efficacy of both therapies declines over time, every minute saved along the way will improve the patient&#39;s outcome.
This critical situation requires thorough work and precise communication with the patient, the family and colleagues from different professions to acquire all relevant information and reach the right decision while carefully monitoring the patient. This is a high fidelity situation. In nonmedical high-fidelity environments such as aviation, Crew Resource Management (CRM) is used to enhance safety and team efficiency.
This guide shows how a Stroke Team algorithm, which is transferable to other hospital settings, was established and how regular simulation-based trainings were performed. It requires determination and endurance to maintain these time-consuming simulation trainings on a regular basis over the course of time. However, the resulting improvement of team spirit and excellent door-to-needle times will benefit both the patients and the work environment in any hospital.
A dedicated Stroke Team of 7 persons who are notified 24/7 by a collective call via speed dial and run a binding algorithm that takes approximately 20 min, was established. To train everybody involved in this algorithm, a simulation-based team training for all new Stroke Team members was conceived and conducted at monthly intervals. This led to a relevant and sustained reduction of the mean door-to-needle time to 25 min, and enhanced the feeling of stroke readiness especially in junior doctors and nurses.

Every min counts in acute stroke care. This guide shows how to establish a Stroke Team algorithm and enhance its performance with regular simulation training. The principles of Crew Resource Management (CRM) facilitate a straight workflow, reduce door-to-needle times and increase staff satisfaction.

Configuration d&#39;un AVC équipe Algorithme et la conduite de formation fondée sur la simulation au service d&#39;urgence - Guide pratique

Time is of the essence when caring for an acute stroke patient. The ultimate goal is to restore blood flow to the ischemic brain. This can ...

Automated Radiochemical Synthesis of [18F]3F4AP: A Novel PET Tracer for Imaging Demyelinating Diseases

3-[18F]fluoro-4-aminopyridine, [18F]3F4AP, is a radiofluorinated analog of the FDA-approved drug for multiple sclerosis 4-aminopyridine (4AP). This compound is currently under investigation as a PET tracer for demyelination. We recently described a novel chemical reaction to produce metafluorinated pyridines consisting of direct fluorination of a pyridine N-oxide and the utilization of this reaction for the radiochemical synthesis of [18F]3F4AP. In this article, we demonstrate how to produce this tracer using an automated synthesizer and an in-house made flow hydrogenation reactor. We also show the standard quality control procedures performed before releasing the radiotracer for preclinical animal imaging studies. This semi-automated procedure may serve as the basis for future production of [18F]3F4AP for clinical studies.

Automated Radiochemical Synthesis of [18F]3F4AP: A Novel PET Tracer for Imaging Demyelinating Diseases

We demonstrate the semi-automated radiochemical synthesis of [18F]3F4AP and quality control procedures.

Synthèse radiochimique automatisée de [<sup&gt; 18</sup&gt; F] 3F4AP: Un nouveau traceur PET pour les maladies démyélinisantes

3-[18F]fluoro-4-aminopyridine, [18F]3F4AP, is a radiofluorinated analog of the FDA-approved drug for multiple sclerosis 4-aminopyridine (4AP). This ...

Using Retinal Imaging to Study Dementia

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central nervous system (CNS) and shares prominent similarities with the brain in terms of embryological origin, anatomical features and physiological properties.&#160; The vascular and neuronal structure in the retina can now be visualized easily and non-invasively using retinal imaging techniques, including fundus photography and optical coherence tomography (OCT), and quantified semi-automatically using computer-assisted analysis programs. Studying the associations between vascular and neuronal changes in the retina and dementia could improve our understanding of dementia and, potentially, aid in diagnosis and risk assessment.&#160; This protocol aims to describe a method of quantifying and analyzing retinal vasculature and neuronal structure, which are potentially associated with dementia. This protocol also provides examples of retinal changes in subjects with dementia, and discusses technical issues and current limitations of retinal imaging.

The retina shares prominent similarities with the brain and thus represents a unique window to study vasculature and neuronal structure in the brain non-invasively. This protocol describes a method to study dementia using retinal imaging techniques. This method can potentially aid in diagnosis and risk assessment of dementia.

À l’aide de l’imagerie rétinienne pour étudier la démence

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central ...