Name: automation of bio-atomic force microscope measurements on hundreds of c. albicans cells
Uploaded: 2021-04-02T13:00:00
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우리는 CONACYT (멕시코), 프랑스 외무부및 유니버시테 파리 13의 FONCYCYT를 인정하고 싶습니다, 국제 협력 ECOS-NORD 프로젝트의 재정 지원하지만 진단나노-palpation, No. 263337 (멕시코) 및 MI5P02 (프랑스). AMR은 프로젝트 No. 20195489 통해 SIP-IPN의 재정 지원에 감사드립니다. SPC는 COtutelle 계약을 통해 CONACYT(no. 288029)와 IPN의 박사 학위 펠로우십에 의해 지원되며, 이중 박사 학위(IPN-UPS)를 획득합니다. ED와 CFD는 센터 내셔널 드 라 레체르체 시엔티피크 (CNRS)의 연구원입니다.

1. 미생물 세포 배양
<ol><li>글리세롤 육수에서 세포를 되살리십시오. 참고 : C. 알비칸은 구슬에 글리세롤 주식 -80 °C에 저장됩니다.<ol>
<li>-80°C 스톡에 대리석을 선택하고 효모 펩톤 덱스트로스(YPD) 한천에 문지릅니다. 액체 재배 전에 30 °C에서 2 일 동안 세포를 성장시면 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>액체 배양을 준비합니다.<ol>
<li>멸균 YPD 국물의 5mL배양튜브를 채우고 YPD 한천판에서 자란 <e...

<ol>
	<li>Cross, S. E., Jin, Y. S., Rao, J., Gimzewski, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomechanical+analysis+of+cells+from+cancer+patients.">Nanomechanical analysis of cells from cancer patients.</a> Nature Nanotechnology. 2 (12), 780-783 (2007).</li><li>Dague, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+and+electron+microscopic-based+study+of+sarcolemmal+surface+of+living+cardiomyocytes+unveils+unexpected+mitochondrial+shift+in+heart+failure.">Atomic force and electron microscopic-based study of sarcolemmal surface of living cardiomyocytes unveils unexpected mitochondrial shift in heart failure.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 162-172 (2014).</li><li>Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+probing+surfaces+of+living+cells+to+molecular+resolution.">Force probing surfaces of living cells to molecular resolution.</a> Nature Chemical Biology. 5 (6), 383-390 (2009).</li><li>Dague, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+to+Explore+Electroporation+Effects+on+Cells.">Atomic Force Microscopy to Explore Electroporation Effects on Cells.</a> Handbook of Electroporation. , 1-13 (2016).</li><li>Puntheeranurak, T., Neundlinger, I., Kinne, R. K. H., Hinterdorfer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+recognition+force+spectroscopy+of+transmembrane+transporters+on+living+cells.">Single-molecule recognition force spectroscopy of transmembrane transporters on living cells.</a> Nature Protocols. 6 (9), 1443-1452 (2011).</li><li>Formosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+analysis+of+the+effects+of+antibiotics+and+CX1+on+a+Pseudomonas+aeruginosa+multidrug-resistant+strain.">Nanoscale analysis of the effects of antibiotics and CX1 on a Pseudomonas aeruginosa multidrug-resistant strain.</a> Scientific Reports. 2, (2012).</li><li>Pillet, F., Chopinet, L., Formosa, C., Dague, &. #. 2. 0. 1. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+and+pharmacology:+From+microbiology+to+cancerology.">Atomic Force Microscopy and pharmacology: From microbiology to cancerology.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1840 (3), 1028-1050 (2014).</li><li>Wu, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+methods+to+assess+cell+mechanical+properties.">A comparison of methods to assess cell mechanical properties.</a> Nature Methods. 15 (7), 491-498 (2018).</li><li>Rigato, A., Rico, F., Eghiaian, F., Piel, M., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+Mechanical+Mapping+of+Micropatterned+Cells+Shows+Adhesion+Geometry-Dependent+Mechanical+Response+on+Local+and+Global+Scales.">Atomic Force Microscopy Mechanical Mapping of Micropatterned Cells Shows Adhesion Geometry-Dependent Mechanical Response on Local and Global Scales.</a> ACS Nano. 9 (6), 5846-5856 (2015).</li><li>Favre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+AFM+imaging+and+force+spectroscopy+using+two-dimensional+probe+arrays+for+applications+in+cell+biology.">Parallel AFM imaging and force spectroscopy using two-dimensional probe arrays for applications in cell biology.</a> Journal of Molecular Recognition. 24 (3), 446-452 (2011).</li><li>Dujardin, A., Wolf, P. D., Lafont, F., Dupres, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+multi-sample+acquisition+and+analysis+using+atomic+force+microscopy+for+biomedical+applications.">Automated multi-sample acquisition and analysis using atomic force microscopy for biomedical applications.</a> PLOS ONE. 14 (3), 0213853 (2019).</li><li>Formosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+living+cell+arrays+for+atomic+force+microscopy+studies.">Generation of living cell arrays for atomic force microscopy studies.</a> Nature Protocols. 10 (1), 199-204 (2015).</li><li>Proa-Coronado, S., S&#233;verac, C., Martinez-Rivas, A., Dague, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+the+paradigm+of+nanomechanical+measurements+on+cells+using+AFM:+an+automated+methodology+to+rapidly+analyse+thousands+of+cells.">Beyond the paradigm of nanomechanical measurements on cells using AFM: an automated methodology to rapidly analyse thousands of cells.</a> Nanoscale Horizons. , (2019).</li><li>Foncy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+polyurethane+and+epoxy+resist+master+mold+for+nanoscale+soft+lithography.">Comparison of polyurethane and epoxy resist master mold for nanoscale soft lithography.</a> Microelectronic Engineering. 110, 183-187 (2013).</li><li>Unsay, J. D., Cosentino, K., Garc&#237;a-S&#225;ez, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+Imaging+and+Force+Spectroscopy+of+Supported+Lipid+Bilayers.">Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers.</a> Journal of Visualized Experiments. (101), e52867 (2015).</li><li>Schiavone, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combined+chemical+and+enzymatic+method+to+determine+quantitatively+the+polysaccharide+components+in+the+cell+wall+of+yeasts.">A combined chemical and enzymatic method to determine quantitatively the polysaccharide components in the cell wall of yeasts.</a> FEMS Yeast Research. 14 (6), 933-947 (2014).</li><li>Formosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+Effects+of+Caspofungin+against+Two+Yeast+Species,+Saccharomyces+cerevisiae+and+Candida+albicans.">Nanoscale Effects of Caspofungin against Two Yeast Species, Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (8), 3498-3506 (2013).</li><li>El-Kirat-Chatel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+analysis+of+caspofungin-induced+cell+surface+remodelling+in+Candida+albicans.">Nanoscale analysis of caspofungin-induced cell surface remodelling in Candida albicans.</a> Nanoscale. 5 (3), 1105-1115 (2013).</li><li>Peric, O., Hannebelle, M., Adams, J. D., Fantner, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+bacterial+traps+for+simultaneous+fluorescence+and+atomic+force+microscopy.">Microfluidic bacterial traps for simultaneous fluorescence and atomic force microscopy.</a> Nano Research. 10 (11), 3896-3908 (2017).</li></ol>

이 방법론에서 제공하는 주요 개선사항은 측정된 시간 단위로 측정된 세포의 수가 현저한 증가입니다. 대응은 셀당 측정된 점수의 감소입니다. 즉, 이 방법은 단일 셀에 대한 자세한 분석을 제공하도록 설계되지 않았습니다. 이 방법은 PDMS 스탬프의 우물에 들어갈 수 있는 셀에만 적용됩니다. 스탬프는 매우 다재다능하며, 1.5 x 1.5 μm2최대 6 x 6 μm 2의 우물을 포함하고있습니다. 여?...

이 작품은 원자력 현미경 (AFM)을 사용하여 살아있는 세포의 수백에 자동 힘 측정을 수행하는 방법론을 제공합니다. 또한 액체 환경에서 수행된 AFM 실험과 호환되는 PDMS 미세 구조화 스탬프에 미생물을 고정하는 방법을 제공한다.
Bio-AFM은 생물학 응용을 위해 잉태된 다음 살아있는 세포를 연구하는 데 사용되는 고도로 전문화된 기술입니다. 그것은 시간에 하나의 셀을 분석 할 수있는 숙련 된 엔지니어가 필요합니다. 이러한 조건에서, 분석될 수 있는 상이한 세포의 수는 4-5시간 안에 오히려 작고, 전형적인 5-10세포이다. 그러나 단일 셀에 기록된 힘 측정의 양은 일반적으로 매우 높으며 쉽게 1000에 도달 할 수 있습니다. 따라서, 살아있는 세포에 대한 AFM 힘 측정의 현재 패러다임은 수백 개의 힘 곡선(FC)을 기록하지만 제한된 수의 세포에 기록된다.
통계적으로, 이 접근은 의심스럽고, 견본의 대표성의 문제를 제기합니다. 실제로, 예를 들어, 수백 개의 측정이 이 몇몇 세포에 기록되더라도, 단지 몇몇 세포를 측정하여 세포 집단의 이질성을 평가하는 것은 어렵습니다. 그러나, 생물물리학, 미생물학 및 나노의학1,2,3에서중요한 진보가 이루어진 것은 이 패러다임에기초한다. 실제로, 단일 세포의 규모에 나노미터 분석은 세포 나노역학, 막 단백질의 조직, 또는 항균 또는 항암제의 작용기전4,5,6,7에대한 새로운 정보를 제공하고있다. 그러나 최근, 세포에 실시 된 몇 가지 높은 처리량 생체 역학 테스트 등장8,이 패러다임을 변경 하 고 세포 인구 이질성에 액세스에 과학 적인 사회의 관심을 보여주는. 이러한 테스트는 모두 미세 유체 시스템에 의존하여 세포를 변형시키고 스트레스하에서 변형을 광학적으로 측정하여 전체 표면 탄성의간접측정을 8을얻습니다. 그러나 이러한 방법의 중요한 문제는 단색 파라메트릭이라는 것입니다: 세포 탄력만 조사할 수 있습니다. 더욱이, 그(것)들은 예를 들면 비순환 포유류 세포 또는 생물막의 연구를 위해 제한될 수 있는 부착된 세포의 기계적인 파라미터의 측정을 허용하지 않습니다.
AFM과 관련된 접근 방식은 S. Scheuring9 및 M. Favre10팀에 의해 개발되었습니다. 슈어링 외. 섬유네틴 패턴 에 고정 된 세포9,패턴 의 모양을 취할 개별 세포를 강제로9. 그런 다음 이 팀은 14~18개의 셀을 대표하는 평균 데이터를 정의하기 위해 몇 셀의 기계적 특성을 매핑했습니다. AFM캔틸레버(10)를병렬화하여 측정을 멀티플렉싱하는 것을 목표로 Farve 등에서 수행한 개발. 우리의 지식에, 멀티 플렉스 방향으로이 작업은 살아있는 세포에 측정으로 이어지지 않았습니다.
Dujardin의 팀이 제안한 흥미로운 접근 방식은 세포를 식별하고 맞춤형 우물의 바닥에서 이미징할 수 있는 자동화된 AFM을 제공합니다. 이 방법은 세포의 큰 집단의 분석을 허용하지 않지만, 각 웰11에서다른 조건의 자동 테스트를 허용한다.
이 일에 있는 우리의 목표는 우리가 평균 세포가 아니라, 반대로, 세포 사이 이질성에 접근하기 위하여 적어도 1000세포를 측정하고 싶었기 때문에 더 야심차다. AFM을 사용하여 세포 인구 이질성에 접근하기 위해 여기에서 개발한 전략은 제한된 수의 힘 곡선이 기록되는 수백 개의 세포의 분석을 기반으로 합니다. 제한된 수의 셀에 많은 수의 힘 곡선을 기록하는 "고전적인" 접근법과 비교하여, 이 접근법은 동일한 정보를 제공하지 않기 때문에 상호 보완적인 것으로 간주되어야 합니다. 실제로, 일반적인 방법은 개별적인 세포 표면 이질성을 탐구하는 것을 허용하는 동안, 우리의 접근을 사용하여, 우리는 전체 세포 집단 이질성에 접근할 수 있습니다. 이러한 목적을 달성하기 위해, 우리는 직접 PDMS 미세 구조스탬프(12)의우물에 미생물 (여기에 효모 종 칸디다 알비칸)을고정하는 방법을 결합하고, 자동으로, 세포에서 세포(13)에 세포에서, 각 세포의 기계적 특성을 측정AFM 팁을 이동하기위한 원래 프로그램을 개발하고 있다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AFM cantilever</td>
			<td>Bruker AFM probes</td>
			<td>MLCT</td>
			<td>The cantilevers used were the labeled &#8220;C&#8221; with resonant frequency of 7 to 10 kHz and k: 0.01 N/m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM data analysis</td>
			<td>JPK-Bruker</td>
			<td>JPK Data processing version minimum 5.1.8</td>
			<td>Can be downloaded from a JPK-Bruker user acount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM Petri dishes</td>
			<td>WPI</td>
			<td>FluoroDish FD35-100</td>
			<td>The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic force Microscope (AFM)</td>
			<td>JPK-Bruker</td>
			<td>Nanowizard II or III</td>
			<td>the AFM should be mounted on an inverted optical microscope with a motorized stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspofungin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0425-5MG</td>
			<td>Caspofungin was used with a concentration of 4 MIC (Minimum Inhibitor Concentration)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Code editor</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Visual Studio Code version 1.40.1</td>
			<td>https://code.visualstudio.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryobeads</td>
			<td>IFU</td>
			<td>CB12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dessicator/Degassing chamber</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>15594635</td>
			<td>The equipment is used to degassing the PDMS stamps for about 50 minutes any dessicator coupled with a vaccum pump will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish heater</td>
			<td>JPK-Bruker</td>
			<td>PetriDishHeater</td>
			<td>This is an add-on to the JPK/Bruker AFM. The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate buffer pH 5.2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7899</td>
			<td>The solution contains 18 mM sodium acetate, 1 mM CaCl2, and 1 mM MnCl2. Adjust the pH with glacial acetic acid. The solution can be stored at 4 &#176;C for 2 months</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical analysis language</td>
			<td>https://www.r-project.org</td>
			<td>R version 3.6.1</td>
			<td>R is a language and environment for statistical computing and graphics. It is a GNU project which is similar to the S language and environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical analysis software</td>
			<td>https://rstudio.com</td>
			<td>R studio version 1.1.463</td>
			<td>collaboration between the R Foundation, RStudio, Microsoft, TIBCO, Google, Oracle, HP and others. RStudio and Shiny are affiliated projects of the Foundation for Open Access Statistics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>761028</td>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent in one set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Peptone D Broth</td>
			<td>Difco</td>
			<td>242820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD Agar</td>
			<td>Difco</td>
			<td>DF0427-17-6</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automation of bio-atomic force microscope measurements on hundreds of c. albicans cells

이 논문에 제시된 방법은 Bio-AFM 실험과 힘 곡선 의 기록을 자동화하는 것을 목표로 합니다. 이 방법을 사용하면 4시간 만에 1000셀의 힘 곡선을 자동으로 기록할 수 있습니다. 4시간 분석 시간을 유지하려면 셀당 힘 곡선 수가 9 또는 16으로 줄어듭니다. 이 방법은 Jython 기반 프로그램과 정의된 패턴에 셀을 조립하는 전략을 결합합니다. 상용 Bio-AFM에 구현된 이 프로그램은 어레이의 첫 번째 셀에 있는 팁을 중앙에 누친 다음 각 셀의 힘 곡선을 기록하는 동안 셀에서 셀로 자동으로 이동할 수 있습니다. 이 방법론을 이용하여, 그들의 강성, 그들의 접착 특성 등과 같은 세포의 생물물리학적 파라미터에 접근할 수 있다. 자동화 와 많은 수의 세포가 분석되면 세포 집단의 동작에 접근할 수 있습니다. 이것은 데이터가 있는 Bio-AFM 필드에 있는 돌파구입니다, 지금까지, 단지 수십개의 세포에 기록되었습니다.

우리는 야영형 인간 병원체 C. 알비칸의 생물학적 특성에 대한 카포핑인의 효과를 분석하기 위해 설명된 프로토콜을 사용했다. Caspofungin는 다른 약물 때문에 항진균 세포를 향해 개발 하는 저항 메커니즘의 효과가 있을 때 사용 되는 마지막 기회 항진균 분자. 그것의 작용 기전은 ß 글루칸 합성을 담당하는 복잡한 fks1/Fks2의 서브유닛 Fks2의 억제에 기초한다. ß 글루칸은 곰팡이?...

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Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

이 프로토콜은 수백 개의 미생물 세포에 대한 AFM 측정을 자동화하는 것을 목표로합니다. 첫째, 미생물은 PDMS 스탬프 미세 구조로 고정된 다음 수백 개의 고정된 세포에서 분광법 측정이 자동으로 수행됩니다.

수백 개의 알비칸스 세포에 대한 생체 원자력 현미경 측정 자동화

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...

원자력 현미경 자동화는 생체 의학 응용 분야로 기술의 진화에 핵심 혁신이다. 그것은 또한 세포 집단의 생체 역학적 특성의 조사에 대한 액세스를 엽니 다. 우리의 방법은 10 세포를 측정하는 데 4 시간이 걸리는 일반적인 방법에 비해 4 시간 동안 1, 000 셀에 대한 AFM 측정값을 기록 할 수 있게해주며, 이것은 실제로 상당한 시간 이득입니다.자동화가 이 기술을 병원 실험실로 가져오는 전제 조건인 경우, 이 개념 증명 프로토콜은 특정 의료 진단 전략 개발에 사용할 수 있는 잠재력을 시사합니다. 이 프로토콜은 다양한 미생물로 채워질 수 있는 다목적 PDMS 스템을 사용하여 다양한 시스템을 탐구할 수 있습니다. PDMS 스탬프를 준비하려면 55그램의 PDMS 프리폴리머 용액을 PDM, 올리고머 및 경화제에서 10 대 1 질량 비율로 혼합하고 5~10분 동안 음수 2개의 막대에 10번 또는 10번 으로 진공 상태에서 생성된 용액을 분해한다.모든 트랩 버블이 제거되면 20그램의 탈가스 용액을 실리콘 마스터 몰드에 2~3mm 두께로 붓고 다시 데가스를 제거합니다. 모든 기포가 제거되면 PDMS를 섭씨 80도에서 1시간 동안 reticulate화하고 메스를 사용하여 PDMS 마이크로 구조스탬프를 보이는 미세 구조 의 어레이와 평행하게 자른다. 그런 다음 실리콘 마스터 몰드에서 스탬프를 벗기고 슬라이드 측면과 정렬된 마이크로 구조와 함께 스탬프 마이크로 구조 부위를 유리 슬라이드에 올려 놓습니다.장치에 대한 세포를 준비하기 위해, 관심의 세포 현탁액의 원심 분리기 600 마이크로 리터와 스탬프에 상피의 200 마이크로 리터를 추가합니다. 약 40 분 동안 진공 상태에서 상체를 탈가스. 모든 기포가 제거되면 PDMS 표면에서 상체를 실온에서 15분 동안 재중단 된 셀 용액의 200 마이크로 리터로 교체하십시오.스탬프의 마이크로 구조에 셀을 로드하려면 30~50도 각도로 유지되는 유리 슬라이드를 사용하여 필요에 따라 여러 번 스탬프에 셀을 분산시합니다. 미세 구조의 높은 충전 속도가 달성된 경우, 파이펫을 사용하여 세포 현탁액을 제거하고 세척당 아세테이트 버퍼 1밀리리터로 세 번 세척하여 묶지 않은 세포를 제거합니다. 마지막 세척 후 질소 흐름을 사용하여 샘플 의 뒷면을 건조시키고 스탬프를 페트리 접시에 놓습니다.그런 다음 신선한 아세테이트 버퍼 2 밀리리터를 접시에 넣습니다. 세포의 원자력 현미경 검사의 경우, 접시를 원자력 현미경 단계에 놓고 무대를 0에서 0으로 중심으로 합니다. 스테이지가 중심이 되면 접시를 현미경 페트리 접시 홀더로 옮기고 스탬프 가장자리를 정렬하여 페트리 접시 홀더의 y축에 수직이 되도록 합니다.그런 다음 원자 현미경 힘 헤드를 무대에 배치하여 스텝퍼 모터가 스탬프에 충돌하는 팁을 피하기 위해 충분히 확장되는 것을 주의하십시오. 이미징의 경우 현미경 노브를 사용하여 4.5 x 4.5 제곱 마이크로 미터 우물의 왼쪽 모서리에 원자력 현미경 팁을 중앙에 두고 현미경 소프트웨어에서 힘 매핑 모드를 선택합니다. 100 x 100 마이크로미터 면적에 걸쳐 64 x 64 힘 맵을 설정하려면 상대 설정 점을 3~5나노 뉴턴으로 설정하고, Z 길이를 4마이크로미터로 설정하고, Z 이동은 일정한 지속 시간, 연장 시간 내지 0.01초로 연장시간, 연장 지연을 0으로, 지연 지연 모드를 0으로, 지연 모드를 일정한 힘으로 설정합니다. , 2048 헤르츠에 샘플 속도.Z 닫힌 루프의 선택을 취소하고 정사각형 이미지를 확인합니다. 100 마이크로미터에 빠른 액세스를 설정, 100 마이크로 미터에 느린 축, 제로 마이크로 미터에 X 오프셋, 제로 마이크로 미터에 Y 오프셋, 0 마이크로 미터에 그리드 각도, 픽셀 64 x 64, 그리고 픽셀 비율을 1 대 1. 그런 다음 자동화 소프트웨어를 엽니다.팝업 창에서 스크립트 파일을 향한 경로를 선택합니다. P2 가변 선(241)의 자이폰 스크립트의 입력 상자 섹션의 P1 가변 선(239)과 W2 좌표값의 W1 좌표를 입력합니다. 피치 값을 스크립트의 피치 가변 선(245)에 특성화하고 웰 치수를 입력하여 웰 패턴의 설계에서 W-S 가변 선(248)으로 결정합니다.원하는 위치에 데이터를 저장하고 총 면적 변수 라인(254)을 100 마이크로미터의 여러 끝에 대한 욕망으로 설정하려면 251줄에 저장 디렉토리로 경로를 작성합니다. 그런 다음 숫자 스캔 변수 라인(257)에 잘 기록된 힘 곡선 행렬 행과 열을 설정하고 실행을 클릭하여 프로그램을 시작합니다. 데이터를 분석하려면 비디오 스튜디오 코드 소프트웨어를 사용하여 Python 스크립트를 열고 파이썬 스크립트 복사 파일을 실행하여 힘 곡선 파일을 하나의 폴더로 구성합니다.데이터가 저장될 일반 폴더에 경로를 입력합니다. 힘 곡선을 분석하려면 원자력 현미경 제조업체의 데이터 처리 소프트웨어를 엽니다. 파일 메뉴에서 분광학 곡선 배치를 선택합니다.다음으로 파일 및 로드 프로세스를 선택하고 강성 프로세스를 선택합니다. 프로세스의 마지막 단계를 선택하고 모든 힘 곡선이 동일한 처리를 받을 수 있도록 유지를 클릭하고 모든 사람에게 적용합니다. R 스크립트를 열려면 데이터 처리 소프트웨어로 추출된 정보가 포함된 파일을 R 스튜디오 소프트웨어에 로드합니다.환경 창에서 데이터 집합 가져오기와 팝업 창의 텍스트 판독기에서 가져오기를 클릭하고 찾아보기를 클릭하여 도트 TSV 파일을 찾습니다. 파일이 로드되면 코드 실행 영역을 선택하고 모든 코드를 실행합니다. 여기서, 입증된 바와 같이 프로토콜을 사용하여 얻은 전형적인 히스토그램이 도시된다.본 분석에서, 강성 재분할은 957개의 네이티브 셀에 기록되었지만, 이 분석에서는 574캐스포풍처리세포의 강성을 측정하였다. 수백 개의 셀을 사용하면 값의 이중 모달 분포를 관찰할 수 있습니다. 더 작은 샘플에서 단일 분포는 전형적으로 관찰되며 인구 이질성에 대한 관찰의 부족을 초래할 수 있습니다.두 조건의 비교는 세포 강성을 감소에 Caspofungin의 효과 강조. 네이티브 및 처리 된 세포의 ANOVA 비교에 의해 밝혀, 두 조건은 높게 전시, 상당히 상이한 강성. 이 값은 많은 수의 분석된 세포로 인해 도달하여 얻어진 결과에 대한 더 큰 확신을 제공했습니다.스탬프가 가득 차면 세포를 우물로 반복적으로 플러시하기 전에 PDMS 스탬프에 상체를 추가하는 것은 분석의 성공에 매우 중요합니다. 개념의 이 증명에서, 칸디다 알비칸스 세포는 분석되었지만 프로토콜은 패턴 세포, 분자 또는 물질의 임의의 그룹에 적용될 수 있다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

마그네틱 족집게를 사용하여 다중 단일 분자 강제 Proteolysis 측정

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

연구

생체공학

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

높은 처리량 Antifungal 약물 검사를위한 칸디다 albicans Biofilm 칩 (CA BChip)

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

글라이딩 Assays를 사용 Biopolymers의 굽힘 강성 측정

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

항생제 내성 황색 포도상 구균 박테리아의 검출을위한 바이오 센서

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

원자 힘 현미경을 사용하여 살아있는 세포의 기계적 특성을 측정

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

포토 리소그래피 정의 파릴 렌-C에 대한 세포 패터닝 : 그런가<sub&gt; 2</sub&gt; 기판

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

상용 현미경에서 라이브 세포막에 분자 확산 법률에 빠른 형광 이미징

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

원자 힘 현미경 이미징 및 지원 지질 이중층의 힘 분광학

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

모듈형 DNA 장치 조립 로봇 액체 처리 자동화

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Power Input Measurements in Stirred Bioreactors at Laboratory Scale

The power input in stirred bioreactors is an important scaling-up parameter and can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during ...