Het gnotobiotische kakkerlakgeneratieprotocol vergemakkelijkt het testen van de impact van verwijdering en vervanging van inheemse darmmicrobiële gemeenschap op de gezondheid van de gastheer en de assemblage van microbiomen. Deze techniek maakt gebruik van methoden uit meerdere bronnen om een samenhangende, gestroomlijnde workflow te vormen voor het genereren van gnotobiotische kakkerlakken zonder het gebruik van dure speciale laboratoriumapparatuur. Gezien de vele verschillende bewegende delen van dit gnotobiotische protocol, helpt visualisatie onderzoekers gemakkelijker hun eigen kleinschalige, goedkope gnotobiotische faciliteiten op de bank te vestigen.
Om het verzamelen van het juiste aantal vrouwtjes met oothecae voor de geplande experimenten te vergemakkelijken, gebruikt u een tang om de kartonnen buizen met gravid vrouwtjes in de voorraadtank te verplaatsen. Als een kartonnen buis naast het gravid vrouwtje meerdere insecten bevat, schud dan de inhoud van de buis in een extra plastic container met vaseline en moedig het doelinsect aan om alleen terug in de kartonnen buis te klimmen. Breng bij het ophalen elke gravidvrouw over naar de kraamafdeling.
Zodra de vrouwtjes hun oothecae hebben laten vallen, breng je de vrouwtjes terug naar de voorraadtank en gebruik je een tang om de oothecae uit het nest te halen. Om de oothecae te reinigen, plaatst u maximaal vijf eikoffers in een centrifugebuis van vijf milliliter met drie milliliter natriumdodecylsulfaat en vortex de oothecae gedurende 10 seconden. Gebruik na een tweede wasbeurt zoals zojuist aangetoond een delicate taakveeg om het oppervlak van elke ootheca voorzichtig te schrobben om vuil te verwijderen en de gereinigde ootheca in een weegboot te plaatsen.
Vul vóór sterilisatie twee centrifugebuizen van 1,5 milliliter per ootheca met één milliliter steriel water per buis. Voeg ook 10 microliter 32% perazijnzuurvoorraadoplossing toe aan 3,2 milliliter dubbel gedestilleerd water in een centrifugebuis van vijf milliliter in een zuurkast. Dop en keer meerdere keren om om te mengen en plaats tot vijf gereinigde oothecae in de vers bereide 0,1% perazijnzuuroplossing gedurende vijf minuten, waarbij de buis meerdere keren omkeert elke 60 seconden.
Perazijnzuur is een sterke oxidator, irriterend voor ogen, huid en luchtwegen, en is ontvlambaar en corrosief. Draag altijd de juiste PBM tijdens het hanteren en gooi uw afval op de juiste manier weg. Gebruik aan het einde van de incubatie steriele tang en een laminaire stroomkap om elke ootheca over te brengen naar zijn eigen centrifugebuis steriel spoelwater.
Keer meerdere keren om om te mengen voordat u de oothecae overbrengt naar de tweede set buisjes spoelwater. Gebruik na de tweede spoeling steriele tang om de oothecae over te brengen naar individuele BHI-schuine schuine stoten. Plaats de schuine schuine iënten in een gesteriliseerde secundaire container en verplaats de container gedurende vier tot vijf weken in een bevochtigde incubator van 30 graden Celsius totdat deze is uitgebroed.
Controleer de schuine punten regelmatig één tot twee keer per week op schimmel- of bacteriegroei tot de vierde week, waarna de schuine punten dagelijks moeten worden gecontroleerd. Wanneer de nimfen beginnen uit te komen, gebruik dan steriele tang en een laminaire stroomkap om een pellet gesteriliseerde rattenvoer aseptisch over te brengen naar een bereide BHI-kolf. Plaats de kolf als steriliteitscontrole gedurende 24 uur in de secundaire container in de incubator van 30 graden Celsius om een gebrek aan vervuilende groei te bevestigen.
Als de kolf steriel is gebleven, schudt u de nimfen uit de helling en laat u ze in de kolf in de laminaire stroomkap vallen. Geef de nimfen vervolgens eenmaal per week water met 300 microliter steriel water in de laminaire stroomkap. Wanneer nimfuitwerpselen de middelgrote vloer beginnen te bedekken, breng de nimfen dan over naar een nieuwe BHI-kolf met gesteriliseerde rattenvoer die 24 uur van tevoren is toegevoegd, zoals aangetoond.
Zwangere vrouwtjes kunnen worden geïdentificeerd aan de ootheca die aan hun achterste buik is bevestigd. De oothecae komt gemiddeld 34 dagen na sterilisatie uit. In gevallen van mislukte sterilisatie kan groei rond de oothecae verschijnen tijdens de incubatie, waardoor de gnotobiotische status van de jongen in gevaar komt.
Dan kan de nimfgroeisnelheid worden gevolgd door de lichaamslengte van het insect te meten. Beperking fragment lengte polymorfisme van de 16S ribosomale DNA van een gehomogeniseerde nimf kan worden gebruikt om gnotobiotische status te bevestigen. Gnotobiotische kakkerlakken kunnen worden ingeënt met synthetische of xenobiotische microbiële gemeenschappen.
Hoewel deze specifieke workflow nieuw is, hebben eerdere studies met gnotobiotische kakkerlakken inzicht gegenereerd in de assemblage van darmmicrobioom en microbiële rollen bij het vormgeven van sociaal gedrag, darmgezondheid en immuniteit van hun insectenhosts.
