Name: isolation of histone from sorghum leaf tissue for top down mass spectrometry profiling of potential epigenetic markers
Uploaded: 2021-03-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Histone from Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profiling of Potential Epigenetic Markers at JoVE.com

We danken Ronald Moore en Thomas Fillmore voor het helpen met massaspectrometrie-experimenten, en Matthew Monroe voor gegevensdepositie. Dit onderzoek werd gefinancierd door subsidies van het Us Department of Energy (DOE) Biological and Environmental Research via het Epigenetic Control of Drought Response in Sorghum (EPICON) project onder awardnummer DE-SC0014081, van het Amerikaanse Ministerie van Landbouw (USDA; CRIS 2030-21430-008-00D), en via het Joint BioEnergy Institute (JBEI), een faciliteit gesponsord door DOE (Contract DE-AC02-05CH11231) tussen Lawrence Berkeley National Laboratory en DOE. Het onderzoek werd uitgevoerd met behulp van Environmental Molecular Sciences Laboratory (EMSL) (grid.436923.9), een DOE Office of Science User Facility gesponsord door het Office of Biological and Environmental Research.

1. Voorbereiden van sorghum bladmateriaal
OPMERKING: De sorghumplanten werden gekweekt in grond in het veld in Parlier, CA.
<ol><li>Verzamel sorghumbladeren van planten in centrifugebuizen van 50 ml en vries de buis onmiddellijk in vloeibare stikstof. Verzamel bladweefsel door het derde en vierde volledig opgedoken blad van de primaire helmstok af te scheuren. OPMERKING: Meer details over de toestand van het veld, de groei van de steekproef en de verzameling zijn te vinden in het gepublic...

<ol>
	<li>Farooq, M., Wahid, A., Kobayashi, N., Fujita, D., Basra, S. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+drought+stress:+Effects,+mechanisms+and+management.">Plant drought stress: Effects, mechanisms and management.</a> Agronomy for Sustainable Development. , 153-188 (2009).</li><li>Dai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drought+under+global+warming:+a+review.">Drought under global warming: a review.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Climate Change. 2 (1), 45-65 (2011).</li><li>Rooney, W. L., Blumenthal, J., Bean, B., Mullet, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+sorghum+as+a+dedicated+bioenergy+feedstock.">Designing sorghum as a dedicated bioenergy feedstock.</a> Biofuels, Bioproducts and Biorefining. 1 (2), 147-157 (2007).</li><li>Mullet, J. E., Klein, R. R., Klein, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorghum+bicolor+-+an+important+species+for+comparative+grass+genomics+and+a+source+of+beneficial+genes+for+agriculture.">Sorghum bicolor - an important species for comparative grass genomics and a source of beneficial genes for agriculture.</a> Current Opinion in Plant Biology. 5 (2), 118-121 (2002).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drought+delays+development+of+the+sorghum+root+microbiome+and+enriches+for+monoderm+bacteria.">Drought delays development of the sorghum root microbiome and enriches for monoderm bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (18), 4284-4293 (2018).</li><li>Gao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strong+succession+in+arbuscular+mycorrhizal+fungal+communities.">Strong succession in arbuscular mycorrhizal fungal communities.</a> ISME Journal. 13 (1), 214-226 (2019).</li><li>Gao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+community+assembly+in+drought-stressed+sorghum+shows+stochasticity,+selection,+and+universal+ecological+dynamics.">Fungal community assembly in drought-stressed sorghum shows stochasticity, selection, and universal ecological dynamics.</a> Nature Communications. 11 (1), (2020).</li><li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications.">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).</li><li>Yuan, L., Liu, X., Luo, M., Yang, S., Wu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+histone+modifications+in+plant+abiotic+stress+responses.">Involvement of histone modifications in plant abiotic stress responses.</a> Journal of Integrative Plant Biology. 55 (10), 892-901 (2013).</li><li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq:+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology.">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nature Reviews. Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).</li><li>Huang, H., Lin, S., Garcia, B. A., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomic+analysis+of+histone+modifications.">Quantitative proteomic analysis of histone modifications.</a> Chemical Reviews. 115 (6), 2376-2418 (2015).</li><li>Moradian, A., Kalli, A., Sweredoski, M. J., Hess, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+top-down,+middle-down,+and+bottom-up+mass+spectrometry+approaches+for+characterization+of+histone+variants+and+their+post-translational+modifications.">The top-down, middle-down, and bottom-up mass spectrometry approaches for characterization of histone variants and their post-translational modifications.</a> Proteomics. 14 (4-5), 489-497 (2014).</li><li>Sidoli, S., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+individual+histone+posttranslational+modifications+and+their+combinatorial+patterns+by+mass+spectrometry-based+proteomics+strategies.">Characterization of individual histone posttranslational modifications and their combinatorial patterns by mass spectrometry-based proteomics strategies.</a> Methods in Molecular Biology. 1528, 121-148 (2017).</li><li>Maile, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+quantification+of+histone+post-translational+modifications+by+a+hybrid+chemical+labeling+method.">Mass spectrometric quantification of histone post-translational modifications by a hybrid chemical labeling method.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 14 (4), 1148-1158 (2015).</li><li>Dang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+pilot+project+of+the+consortium+for+top-down+proteomics:+a+status+report.">The first pilot project of the consortium for top-down proteomics: a status report.</a> Proteomics. 14 (10), 1130-1140 (2014).</li><li>Schaffer, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantification+of+proteoforms+by+mass+spectrometry.">Identification and quantification of proteoforms by mass spectrometry.</a> Proteomics. 19 (10), 1800361 (2019).</li><li>Cupp-Sutton, K. A., Wu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+quantitative+top-down+proteomics.">High-throughput quantitative top-down proteomics.</a> Molecular Omics. , (2020).</li><li>Varoquaux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+field-droughted+sorghum+from+seedling+to+maturity+reveals+biotic+and+metabolic+responses.">Transcriptomic analysis of field-droughted sorghum from seedling to maturity reveals biotic and metabolic responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (52), 27124 (2019).</li><li>Gordon, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+vanadate+as+protein-phosphotyrosine+phosphatase+inhibitor.">Use of vanadate as protein-phosphotyrosine phosphatase inhibitor.</a> Methods in Enzymology. 201, 477-482 (1991).</li><li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+changes+in+histone+post-translational+modifications+by+top-down+mass+spectrometry.">Profiling changes in histone post-translational modifications by top-down mass spectrometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1507, 153-168 (2017).</li><li>Chambers, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cross-platform+toolkit+for+mass+spectrometry+and+proteomics.">A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics.</a> Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).</li><li>Kou, Q., Xun, L., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopPIC:+a+software+tool+for+top-down+mass+spectrometry-based+proteoform+identification+and+characterization.">TopPIC: a software tool for top-down mass spectrometry-based proteoform identification and characterization.</a> Bioinformatics (Ocford, England). 32 (22), (2016).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Informed-Proteomics:+open-source+software+package+for+top-down+proteomics.">Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics.</a> Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).</li><li>LeDuc, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C-Score:+a+bayesian+framework+to+sharply+improve+proteoform+scoring+in+high-throughput+top+down+proteomics.">The C-Score: a bayesian framework to sharply improve proteoform scoring in high-throughput top down proteomics.</a> Journal of Proteome Research. 13 (7), 3231-3240 (2014).</li><li>Fornelli, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+top-down+analysis+of+the+human+proteome+using+a+benchtop+quadrupole-orbitrap+mass+spectrometer.">Advancing top-down analysis of the human proteome using a benchtop quadrupole-orbitrap mass spectrometer.</a> Journal of Proteome Research. 16 (2), 609-618 (2017).</li><li>Sun, R. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pTop+1.0:+A+high-accuracy+and+high-efficiency+search+engine+for+intact+protein+identification.">pTop 1.0: A high-accuracy and high-efficiency search engine for intact protein identification.</a> Analytical Chemistry. 88 (6), 3082-3090 (2016).</li><li>Xiao, K., Yu, F., Tian, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+protein+identification+using+isotopic+envelope+fingerprinting.">Top-down protein identification using isotopic envelope fingerprinting.</a> Journal of Proteomics. 152, 41-47 (2017).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MASH+Suite+Pro:+A+comprehensive+software+tool+for+top-down+proteomics.">MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics: MCP. 15 (2), 703-714 (2016).</li><li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+mass+spectrometry+of+histone+modifications+in+sorghum+reveals+potential+epigenetic+markers+for+drought+acclimation.">Top-down mass spectrometry of histone modifications in sorghum reveals potential epigenetic markers for drought acclimation.</a> Methods. , (2019).</li><li>Garcia, B. A., Pesavento, J. J., Mizzen, C. A., Kelleher, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pervasive+combinatorial+modification+of+histone+H3+in+human+cells.">Pervasive combinatorial modification of histone H3 in human cells.</a> Nature Methods. 4 (6), 487-489 (2007).</li><li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unabridged+analysis+of+human+histone+H3+by+differential+top-down+mass+spectrometry+reveals+hypermethylated+proteoforms+from+MMSET/NSD2+overexpression.">Unabridged analysis of human histone H3 by differential top-down mass spectrometry reveals hypermethylated proteoforms from MMSET/NSD2 overexpression.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics: MCP. 15 (3), 776-790 (2016).</li><li>Garcia, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+derivatization+of+histones+for+facilitated+analysis+by+mass+spectrometry.">Chemical derivatization of histones for facilitated analysis by mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 2 (4), 933-938 (2007).</li><li>Holt, M. V., Wang, T., Young, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-pot+quantitative+top-+and+middle-down+analysis+of+GluC-digested+histone+H4.">One-pot quantitative top- and middle-down analysis of GluC-digested histone H4.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (12), 2514-2525 (2019).</li><li>Tian, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+top-down+characterization+of+histone+post-translational+modifications.">Enhanced top-down characterization of histone post-translational modifications.</a> Genome Biology. 13 (10), (2012).</li><li>Wang, Z., Ma, H., Smith, K., Wu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+separation+using+high-pH+and+low-pH+reversed+phase+liquid+chromatography+for+top-down+proteomics.">Two-dimensional separation using high-pH and low-pH reversed phase liquid chromatography for top-down proteomics.</a> International Journal of Mass Spectrometry. 427, 43-51 (2018).</li><li>Gargano, A. F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+separation+capacity+of+intact+histone+proteoforms+chromatography+coupling+online+weak+cation+exchange-HILIC+to+reversed+phase+LC+UVPD-HRMS.">Increasing the separation capacity of intact histone proteoforms chromatography coupling online weak cation exchange-HILIC to reversed phase LC UVPD-HRMS.</a> Journal of Proteome Research. 17 (11), 3791-3800 (2018).</li></ol>

Het gepresenteerde protocol beschrijft hoe histonen uit sorghumbladmonsters (of meer in het algemeen plantenblad) kunnen worden geëxtraheerd. De gemiddelde histonopbrengst zal naar verwachting 2-20 μg per 4-5 g sorghumbladmateriaal zijn. De materialen zijn voldoende zuiver voor de downstream histonanalyse door LC-MS (meestal histonen met ~20% ribosomale eiwitbesmetting). Een lager rendement kan worden verkregen als gevolg van monstervariaties of mogelijke verkeerde behandeling/fouten in het hele protocol. Het handhaven...

De toenemende ernst en frequentie van de droogte zal naar verwachting van invloed zijn op de productiviteit van graangewassen1,2. Sorghum is een graanvoedsel - en energiegewas dat bekend staat om zijn uitzonderlijke vermogen om waterbeperkende omstandigheden te weerstaan3,4. We streven naar mechanistisch begrip van het samenspel tussen droogtestress, plantenontwikkeling en epigenetica van sorghum [Sorghum bicolor (L.) Moench] planten. Ons vorige werk heeft sterke verbindingen aangetoond tussen het microbioom van planten en rhizosfeer bij droogte acclimatisatie en reacties op moleculair niveau5,6,7. Dit onderzoek zal de weg vrijmaken voor het gebruik van epigenetische engineering bij het aanpassen van gewassen aan toekomstige klimaatscenario's. Als onderdeel van de inspanningen om epigenetica te begrijpen, streven we ernaar eiwitmarkers te bestuderen die de genexpressie in het plantenorganisme beïnvloeden.
Histonen behoren tot een sterk geconserveerde familie van eiwitten in eukaryoten die DNA in nucleosomen verpakken als fundamentele eenheden van chromatine. Post-translationele modificaties (PTM's) van histonen zijn dynamisch gereguleerd om de chromatinestructuur te beheersen en de genexpressie te beïnvloeden. Net als andere epigenetische factoren, waaronder DNA-methylatie, spelen histon-PTM's een belangrijke rol in veel biologische processen8,9. Op antilichamen gebaseerde tests zoals westerse vlekken zijn veel gebruikt om histon-PTM's te identificeren en te kwantificeren. Bovendien kan de interactie van histon-PTM's en DNA effectief worden onderzocht door Chromatine-immunoprecipitatie – sequencing (ChIP-seq)10. In ChIP-seq wordt chromatine met specifieke gerichte histon PTM verrijkt met antilichamen tegen die specifieke PTM. Vervolgens kunnen de DNA-fragmenten uit het verrijkte chromatine worden vrijgegeven en worden gesequentieerd. Regio's van genen die interageren met de beoogde histon PTM worden onthuld. Al deze experimenten zijn echter sterk afhankelijk van antilichamen van hoge kwaliteit. Voor sommige histonvarianten/homologen of combinaties van PTM's kan de ontwikkeling van robuuste antilichamen zeer uitdagend zijn (vooral voor meerdere PTM's). Bovendien kunnen antilichamen alleen worden ontwikkeld als de beoogde histon PTM bekend is. 11 Daarom zijn alternatieve methoden nodig voor ongetargette, globale profilering van histon-PTM's.
Massaspectrometrie (MS) is een aanvullende methode om histon-PTM 's te karakteriseren, met inbegrip van onbekende PTM 's waarvoor geen antilichamen beschikbaar zijn11,12. De gevestigde "bottom-up" MS-workflow maakt gebruik van proteasen om eiwitten te verteren tot kleine peptiden voorafgaand aan vloeistofchromatografie (LC) scheiding en MS-detectie. Omdat histonen grote aantallen basisresten (lysine en arginine) hebben, snijdt de trypsinevertering (protease specifiek voor lysine en arginine) in de standaard bottom-up workflow de eiwitten in zeer korte peptiden. De korte peptiden zijn technisch moeilijk te analyseren door standaard LC-MS, en behouden niet de informatie over de connectiviteit en stoichiometrie van meerdere PTMs. Het gebruik van andere enzymen of chemische etikettering om lysines te blokkeren genereert langere peptiden die meer geschikt zijn voor karakterisering van histone PTMs13,14.
Als alternatief kan de spijsverteringsstap volledig worden weggelaten. In deze "top-down" benadering worden intacte eiwitionen in de MS geïntroduceerd door elektrospray ionisatie (ESI) na online LC-scheiding, wat ionen oplevert van de intacte histon proteoformen. Bovendien kunnen ionen (d.w.z. proteoformen) van belang worden geïsoleerd en gefragmenteerd in de massaspectrometer om de sequentie-ionen voor identificatie en PTM-lokalisatie op te leveren. Daarom heeft top-down MS het voordeel dat de informatie op proteoform-niveau behouden blijft en de connectiviteit van meerdere PTM 's en terminale afknijpingen op hetzelfde proteoform15,16vastlegt . Top-down experimenten kunnen ook kwantitatieve informatie bieden en inzichten bieden van biomarkers op het intacte eiwitniveau17. Hierin beschrijven we een protocol om histon uit sorghumblad te extraheren en de intacte histonen te analyseren door LC-MS van bovenaf.
De voorbeeldgegevens in figuur 1 en figuur 2 zijn afkomstig van sorghumblad dat in week 2 na het planten is verzameld. Hoewel variatie van de opbrengst wordt verwacht, is dit protocol over het algemeen agnostisch voor specifieke steekproefomstandigheden. Hetzelfde protocol is met succes gebruikt voor sorghum plantenbladweefsel verzameld vanaf 2, 3, 5, 8, 9 en 10 weken na het planten.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A955-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, 500mM Solution, pH 8.0</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>324504-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine Hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G3272-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate, dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3786-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail, cOmplete tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5892791001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium butyrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>303410-5G</td>
			<td>Used for histone deacetylase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7020-100G</td>
			<td>Used for phosphatase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Orthovanadate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>450243-10G</td>
			<td>Used for phosphatase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7903-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP153-500 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weak cation exchange resin, mesh 100-200 analytical (BioRex70)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>142-5842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatography column (Bio-Spin)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>732-6008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh 100 filter cloth</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>NY1H09000</td>
			<td>This is part of the Sigma kit (catalog # CELLYTPN1) for plant nuclei extraction. Similar filters with the same mesh size can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips (P20, P200, P1000)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube, 50mL/15mL, Centrifuge, Conical</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>28-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube, Microcentrifuge, 1.5/2 mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-912-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers (50mL &#8211; 2L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge with cooling</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-690-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinging-bucket centrifuge with cooling</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-728-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath Sonicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-336-120</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of histone from sorghum leaf tissue for top down mass spectrometry profiling of potential epigenetic markers

Histonen behoren tot een familie van sterk geconserveerde eiwitten in eukaryoten. Ze verpakken DNA in nucleosomen als functionele eenheden van chromatine. Post-translationele modificaties (PTM's) van histonen, die zeer dynamisch zijn en door enzymen kunnen worden toegevoegd of verwijderd, spelen een cruciale rol bij het reguleren van genexpressie. In planten zijn epigenetische factoren, waaronder histon-PTM's, gerelateerd aan hun adaptieve reacties op het milieu. Inzicht in de moleculaire mechanismen van epigenetische controle kan ongekende mogelijkheden bieden voor innovatieve bio-engineeringoplossingen. Hierin beschrijven we een protocol om de kernen te isoleren en histonen te zuiveren uit sorghumbladweefsel. De geëxtraheerde histonen kunnen in hun intacte vormen worden geanalyseerd door top-down massaspectrometrie (MS) in combinatie met online reversed-phase (RP) vloeibare chromatografie (LC). Combinaties en stoichiometrie van meerdere PTM's op dezelfde histon proteoform kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd. Bovendien kan histone tail clipping worden gedetecteerd met behulp van de top-down LC-MS workflow, wat het wereldwijde PTM-profiel van kerntonen oplevert (H4, H2A, H2B, H3). We hebben dit protocol eerder toegepast om histon-PTM's te profileren uit sorghumbladweefsel verzameld uit een grootschalig veldonderzoek, gericht op het identificeren van epigenetische markers van droogtebestendigheid. Het protocol kan mogelijk worden aangepast en geoptimaliseerd voor chromatine immunoprecipatie-sequencing (ChIP-seq), of voor het bestuderen van histon PTM's in vergelijkbare planten.

Volgens het protocol kunnen de histonen worden geëxtraheerd en geïdentificeerd met behulp van de LC-MS-analyse. De ruwe gegevens en verwerkte resultaten zijn beschikbaar bij MassIVE (https://massive.ucsd.edu/) via toetreding: MSV000085770. Op basis van de TopPIC-resultaten van de representatieve steekproef (ook verkrijgbaar bij MassIVE) identificeerden we 303 histon proteoformen (106 H2A, 72 H2B, 103 H3 en 22 H4 proteoforms). Co-gezuiverde ribosomale proteoformen zijn ook gedetecteerd, meestal eluting vroeg in de LC. Z...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Histone from Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profiling of Potential Epigenetic Markers at JoVE.com

Isolation of Histone from Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profiling of Potential Epigenetic Markers

Het protocol is ontwikkeld om intacte histonen effectief te extraheren uit sorghumbladmaterialen voor profilering van histon post-translationele modificaties die kunnen dienen als potentiële epigenetische markers om droogtebestendige gewassen te helpen.

Isolatie van histone van Sorghum Leaf Tissue voor Top Down Mass Spectrometry Profiling van potentiële epigenetische markers

Histones belong to a family of highly conserved proteins in eukaryotes. They pack DNA into nucleosomes as functional units of chromatin. ...

Ons protocol onthult epigenetische markers voor de ontwikkeling van sorghumplanten en droogtebestendigheid. Een dergelijk moleculair begrip zal helpen betere oplossingen te ontwikkelen om gewassen in de toekomst aan te passen aan extreme klimaten. Dit protocol genereert hoge zuiverheid histonen uit sorghum bladweefsel geschikt voor niet-gerichte profilering van post-translationele modificaties door massaspectrometrie.Shadan Abdali en Tanya Winkler, post-bachelor onderzoeksmedewerkers van EMSL, demonstreren de procedure. Om te beginnen maal je een paar sorghumblaadjes met vloeibare stikstof en bewaar je ze in een centrifugebuis van 50 milliliter bij min 80 graden Celsius. Gebruik ongeveer vier gram bladpoeder voor de histonanalyse van elk monster.Bereid extractiebuffers 1, 2A en 2B voor zoals beschreven in het teksthandschrift en voeg een proteaseremmertablet toe aan extractiebuffer 1 om een uiteindelijke concentratie van 0,2X te maken. Voeg vervolgens 20 milliliter van de bereide extractiebuffer één toe aan het gemalen bladpoeder en meng of vortex voorzichtig gedurende 10 minuten. Spoel het gefilterde materiaal met mesh 100 telkens twee keer af met twee milliliter extractiebuffer.Centrifugeer vervolgens het filtraat op 3.000 keer G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius in een slingerende emmerrotor om het celafval en grote subcellulaire organellen te pelleten. Bereid tegelijkertijd extractiebuffer 2A voor door proteaseremmer toe te voegen aan een uiteindelijke concentratie van 0,4X. Gooi de supernatant weg zonder de pellet te storen.Resuspender vervolgens de pellet in vijf milliliter van de voorbereide extractiebuffer 2A. Incubeer het gedurende 10 minuten op ijs met zacht mengen. Centrifugeer de oplossing op 2, 100 keer G gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius in een slingerende emmerrotor om het puin en de kernen te pelleten.Decanteer het supernatant voorzichtig zonder de pellet te storen. Bereid extractiebuffer 2B voor door de proteaseremmers toe te voegen aan een uiteindelijke concentratie van 1X. Voeg vijf milliliter van deze voorbereide buffer toe aan de pellet die na de centrifugatie is verkregen.Centrifugeer op 2, 100 keer G gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius in de slingerende emmerrotor tot pelletresten en kernen. Bereid tegelijkertijd kernlysebuffer voor door een proteaseremmertablet toe te voegen. Decanteer het supernatant voorzichtig zonder de pellet te storen en resuspendeer de pellet in 250 microliters van de lysisbuffer.Vortex de oplossing gedurende 15 seconden op maximale snelheid om het te homogeniseren en het materiaal opnieuw te gebruiken. Soniceer het vervolgens vijf minuten op vier graden Celsius en bewaar het op min 80 graden Celsius. Ontdooi het bevroren kernmonster en voeg 750 microliters van 5% guanidinebuffer toe.Soniceer het vervolgens gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius. Breng het monster over in een buis van twee milliliter en draai het gedurende 10 minuten op 10.000 keer G bij vier graden Celsius. Bereid tegelijkertijd een ionenuitwisselingschromatografiekolom voor door deze te spoelen met twee milliliter acetonitril en vier milliliter water om verontreiniging op het oppervlak te minimaliseren.Laad ongeveer 200 tot 300 microliter zwakke kationenuitwisselingshars op de chromatografiekolom en laat de hars bezinken. Was de hars vier keer met guanidinebuffer en plaats de buis en kolom op ijs. Plaats de kolom op een verzamelbuis van twee milliliter en laad het supernatant van het voorbereide monster langzaam op het harsbed zonder de hars te verstoren.Terwijl de oplossing doorstroomt, laadt u de eluent zes tot acht keer terug naar de bovenkant van de kolom om een maximale binding aan de hars mogelijk te maken. Laad vervolgens twee milliliter van 5% guanidinebuffer om de niet-histoneiwitten van de kolom te wassen. Eluteer de histoneiwitten met één milliliter van 5% guanidinebuffer en verzamel het eluent.Reinig een drie kilodalton cutoff spinfilter met 500 microliter wasmiddel en ontsalt vervolgens de resterende eluent met behulp van het voorgeschoonde spinfilter. Belangrijke histoneiwitten werden waargenomen in specifieke regio's van de LC-MS-functiekaart die het succes van het experiment aangeeft. Deze representatieve kaart toont intacte full-length histonen in gestreepte dozen.De LC-MS feature map van H2B en 16 kilodalton H2A proteoforms laat zien dat beide meerdere homologen hebben met vergelijkbare sequenties zoals opgemerkt door de unieke productsessienummers. Een andere groep H2A-histonen zonder de verlengde staarten is te zien. De N-terminale acetylatie, extra lysine acetylations en methionine oxidaties in H4 histone eiwitten kunnen worden waargenomen door de massaverschillen in de hier getoonde LC-MS feature map te onderzoeken.Er werden twee eiwitsequenties geïdentificeerd voor H3-histoneiwitten, H3.3 en H3.2. Elektronenoverdracht dissociatie fragmentatie werd gebruikt om het fragmentatiespectrum van de geïdentificeerde H3.2 proteoform te genereren. De precursorionen en de vorige en volgende Ms1 spectra worden hier getoond met hun overeenkomende isotooppieken gemarkeerd in paars.Post-translationele wijzigingen kunnen worden gelokaliseerd met behulp van de dekkingskaart van de reeks. Door de relatieve overvloed van de proteoformen te vergelijken, werden veranderingen van afgeknotte histon proteoformen ontdekt die specifiek zijn voor de steekproefomstandigheden. C-terminale afkapping van H4 werd slechts in week drie en negen waargenomen voor sommige monsters.Voor H3.2 waren N-terminal afgeknotte proteoformen over het algemeen overvloediger in week 10. C-terminal afgeknotte H3.2 werden daarentegen in eerdere tijdspunten gezien. De H4 C-terminal afgeknotte proteoformen waren significant overvloediger in BTx642 dan in RTx430.Let bij het proberen van dit protocol goed op de kleuren van de supernatant en de pellet. De kleurverandering helpt bij het identificeren van mogelijke problemen bij het slijpen of lyse van de chloroplast. We hopen dat dit robuuste protocol voor histonisolatie van sorghumbladeren epigeenonderzoek voor andere vergelijkbare planten mogelijk zal maken.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless capillaire elektroforese-massaspectrometrie voor metabole of Biological Samples

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tijdsgeresolveerde elektrosprayionisatie waterstof-deuterium Exchange Massaspectrometrie voor het bestuderen van Protein Structure en Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Het oplossen van Affiniteit gezuiverde eiwit complexen door Blue inheemse PAGE en Protein Correlatie Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Lipide Druppeltje Isolatie kwantitatieve massaspectrometrie Analyse

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Bereiding van de monsters voor de massa spectrometrie gebaseerde identificatie van RNA-bindende regio 's

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Diepe Proteoom profilering door isobaar Labeling, uitgebreide vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en Software-bijgewoonde kwantificering

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Blad Spray massaspectrometrie: Een snelle Ambient ionisatie techniek om te beoordelen direct metabolieten van plantaardige weefsels

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptide profilering en identificatie geïllustreerd door angiotensine II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Monster voorbereiding voor Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Label-vrije Immunoprecipitation massaspectrometrie workflow voor grootschalige nucleaire interactome profilering

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...