Name: isolation of histone from sorghum leaf tissue for top down mass spectrometry profiling of potential epigenetic markers
Uploaded: 2021-03-04T13:00:00
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Wir danken Ronald Moore und Thomas Fillmore für die Unterstützung bei Massenspektrometrieexperimenten und Matthew Monroe für die Datenabscheidung. Diese Forschung wurde durch Stipendien des US Department of Energy (DOE) Biological and Environmental Research im Rahmen des Epigenetic Control of Drought Response in Sorghum (EPICON) Projekts unter der Nummer DE-SC0014081, vom US Department of Agriculture (USDA; CRIS 2030-21430-008-00D) und über das Joint BioEnergy Institute (JBEI), eine vom DOE gesponserte Einrichtung (Vertrag DE-AC02-05CH11231) zwischen Lawrence Berkeley National Laboratory und DOE. Die Forschung wurde mit dem Environmental Molecular Sciences Laboratory (EMSL) (Grid.436923.9) durchgeführt, einer vom Office of Biological and Environmental Research gesponserten DOE Office of Science User Facility.

1. Herstellung von Sorghumblattmaterial
HINWEIS: Die Sorghumpflanzen wurden im Boden auf dem Feld in Parlier, CA angebaut.
<ol><li>Sorghumblätter von Pflanzen in 50 ml Zentrifugenrohre sammeln und das Rohr sofort in flüssigem Stickstoff einfrieren. Sammeln Sie Blattgewebe, indem Sie das dritte und vierte vollständig herausgetretene Blatt aus dem Primärfräser abreißen. HINWEIS: Weitere Einzelheiten zu Feldzustand, Stichprobenwachstum und Sammlung finden Sie im veröffentlichten Beric...

<ol>
	<li>Farooq, M., Wahid, A., Kobayashi, N., Fujita, D., Basra, S. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+drought+stress:+Effects,+mechanisms+and+management.">Plant drought stress: Effects, mechanisms and management.</a> Agronomy for Sustainable Development. , 153-188 (2009).</li><li>Dai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drought+under+global+warming:+a+review.">Drought under global warming: a review.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Climate Change. 2 (1), 45-65 (2011).</li><li>Rooney, W. L., Blumenthal, J., Bean, B., Mullet, J. 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A., Pesavento, J. J., Mizzen, C. A., Kelleher, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pervasive+combinatorial+modification+of+histone+H3+in+human+cells.">Pervasive combinatorial modification of histone H3 in human cells.</a> Nature Methods. 4 (6), 487-489 (2007).</li><li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unabridged+analysis+of+human+histone+H3+by+differential+top-down+mass+spectrometry+reveals+hypermethylated+proteoforms+from+MMSET/NSD2+overexpression.">Unabridged analysis of human histone H3 by differential top-down mass spectrometry reveals hypermethylated proteoforms from MMSET/NSD2 overexpression.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics: MCP. 15 (3), 776-790 (2016).</li><li>Garcia, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+derivatization+of+histones+for+facilitated+analysis+by+mass+spectrometry.">Chemical derivatization of histones for facilitated analysis by mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 2 (4), 933-938 (2007).</li><li>Holt, M. V., Wang, T., Young, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-pot+quantitative+top-+and+middle-down+analysis+of+GluC-digested+histone+H4.">One-pot quantitative top- and middle-down analysis of GluC-digested histone H4.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (12), 2514-2525 (2019).</li><li>Tian, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+top-down+characterization+of+histone+post-translational+modifications.">Enhanced top-down characterization of histone post-translational modifications.</a> Genome Biology. 13 (10), (2012).</li><li>Wang, Z., Ma, H., Smith, K., Wu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+separation+using+high-pH+and+low-pH+reversed+phase+liquid+chromatography+for+top-down+proteomics.">Two-dimensional separation using high-pH and low-pH reversed phase liquid chromatography for top-down proteomics.</a> International Journal of Mass Spectrometry. 427, 43-51 (2018).</li><li>Gargano, A. F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+separation+capacity+of+intact+histone+proteoforms+chromatography+coupling+online+weak+cation+exchange-HILIC+to+reversed+phase+LC+UVPD-HRMS.">Increasing the separation capacity of intact histone proteoforms chromatography coupling online weak cation exchange-HILIC to reversed phase LC UVPD-HRMS.</a> Journal of Proteome Research. 17 (11), 3791-3800 (2018).</li></ol>

Das vorgestellte Protokoll beschreibt, wie Histonen aus Sorghumblattproben (oder allgemeiner Pflanzenblatt) proben extrahiert werden. Die durchschnittliche Histonausbeute wird voraussichtlich 2–20 g pro 4–5 g Sorghumblattmaterial betragen. Die Materialien sind ausreichend rein für die nachgeschaltete Histonanalyse durch LC-MS (meist Histone mit einer ribosomalen Proteinkontamination von 20 %). Aufgrund von Stichprobenvariationen oder möglichen Fehlbehandlungen/Fehlern im gesamten Protokoll kann ein geringerer Ertra...

Die zunehmende Schwere und Häufigkeit der Dürre dürfte sich auf die Produktivität der Getreidepflanzenauswirken 1,2. Sorghum ist eine Getreidenahrungs- und Energiepflanze, die für ihre außergewöhnliche Fähigkeit bekannt ist, wasserbegrenzenden Bedingungen standzuhalten3,4. Wir verfolgen ein mechanistisches Verständnis des Zusammenspiels von Dürrestress, Pflanzenentwicklung und Epigenetik von Sorghum [Sorghum bicolor (L.) Moench] Pflanzen. Unsere bisherige Arbeit hat starke Verbindungen zwischen Pflanzen- und Rhizosphärenmikrobiom bei der Dürreakklimatisierung und Reaktionen auf molekularer Ebene5,6,7gezeigt. Diese Forschung wird den Weg für die Nutzung epigenetischer Technik bei der Anpassung von Pflanzen an zukünftige Klimaszenarien ebnen. Als Teil der Bemühungen um das Verständnis der Epigenetik wollen wir Proteinmarker untersuchen, die die Genexpression innerhalb des Pflanzenorganismus beeinflussen.
Histone gehören zu einer hochkonservierten Familie von Proteinen in Eukaryoten, die DNA als grundlegende Chromatineinheiten in Nukleosomen verpacken. Posttranslationale Modifikationen (PTMs) von Histonen werden dynamisch reguliert, um die Chromatinstruktur zu steuern und die Genexpression zu beeinflussen. Wie andere epigenetische Faktoren, einschließlich DNA-Methylierung, spielen Histon-PTMs eine wichtige Rolle in vielen biologischen Prozessen8,9. Antikörperbasierte Assays wie Western Blots wurden häufig verwendet, um Histon-PTMs zu identifizieren und zu quantifizieren. Darüber hinaus kann die Wechselwirkung von Histon-PTMs und DNA durch Chromatin-Immunpräzipitation – Sequenzierung (ChIP-seq)10effektiv untersucht werden. In ChIP-seq wird Chromatin mit spezifischem gezielten Histon PTM durch Antikörper gegen diese spezifische PTM angereichert. Dann können die DNA-Fragmente aus dem angereicherten Chromatin freigesetzt und sequenziert werden. Regionen von Genen, die mit dem gezielten Histon PTM interagieren, werden aufgedeckt. Alle diese Experimente sind jedoch stark auf hochwertige Antikörper angewiesen. Bei einigen Histonvarianten/Homologen oder Kombinationen von PTMs kann die Entwicklung robuster Antikörper (besonders bei mehreren PTMs) äußerst anspruchsvoll sein. Darüber hinaus können Antikörper nur entwickelt werden, wenn der gezielte Histon PTM bekannt ist. 11 Daher sind alternative Methoden für eine ungezielte, globale Profilierung von Histon-PTMs erforderlich.
Massenspektrometrie (MS) ist eine ergänzende Methode zur Charakterisierung von Histon-PTMs, einschließlich unbekannter PTMs, für die Antikörper nicht verfügbar sind11,12. Der etablierte "Bottom-up"-MS-Workflow verwendet Proteasen, um Proteine vor der Flüssigkeitschromatographie (LC) Trennung und MS-Erkennung in kleine Peptide zu verdauen. Da Histone eine große Anzahl von Grundrückständen (Lysin und Arginin) aufweisen, schneidet die Trypsinverdauung (proteasespezifisch für Lysin und Arginin) im Standard-Bottom-up-Workflow die Proteine in sehr kurze Peptide. Die kurzen Peptide sind technisch schwierig zu analysieren von Standard-LC-MS, und bewahren nicht die Informationen über die Konnektivität und Stoichiometrie von mehreren PTMs. Die Verwendung anderer Enzyme oder chemische Etikettierung zur Blockierung von Lysinen erzeugt längere Peptide, die besser für die Charakterisierung von Histon-PTMs13,14geeignet sind.
Alternativ kann der Verdauungsschritt komplett weggelassen werden. Bei diesem "Top-down"-Ansatz werden intakte Proteinionen durch Elektrospray-Ionisation (ESI) nach Online-LC-Trennung in die MS eingeführt, wodurch Ionen der intakten Histonproteoformen entstehen. Darüber hinaus können Ionen (d.h. Proteoformen) von Interesse isoliert und im Massenspektrometer fragmentiert werden, um die Sequenzionen zur Identifizierung und PTM-Lokalisierung zu erhalten. Daher hat MS von oben nach unten den Vorteil, die Informationen auf Proteoform-Ebene beizubehalten und die Konnektivität mehrerer PTMs und Terminalkürzungen auf derselben Proteoform15,16zu erfassen. Top-down-Experimente können auch quantitative Informationen liefern und Einblicke in Biomarker auf dem intakten Proteinlevel17bieten. Hierin beschreiben wir ein Protokoll, um Histon aus Sorghumblatt zu extrahieren und die intakten Histone von oben nach unten LC-MS zu analysieren.
Die in Abbildung 1 und Abbildung 2 dargestellten Beispieldaten stammen aus Sorghumblättern, die in Woche 2 nach der Pflanzung gesammelt wurden. Obwohl eine Variation des Ertrags erwartet wird, ist dieses Protokoll im Allgemeinen agnostisch für bestimmte Probenbedingungen. Das gleiche Protokoll wurde erfolgreich für Sorghum Pflanzenblattgewebe von 2, 3, 5, 8, 9 und 10 Wochen nach der Pflanzung gesammelt verwendet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A955-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, 500mM Solution, pH 8.0</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>324504-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine Hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G3272-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate, dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3786-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail, cOmplete tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5892791001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium butyrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>303410-5G</td>
			<td>Used for histone deacetylase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7020-100G</td>
			<td>Used for phosphatase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Orthovanadate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>450243-10G</td>
			<td>Used for phosphatase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7903-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP153-500 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weak cation exchange resin, mesh 100-200 analytical (BioRex70)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>142-5842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatography column (Bio-Spin)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>732-6008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh 100 filter cloth</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>NY1H09000</td>
			<td>This is part of the Sigma kit (catalog # CELLYTPN1) for plant nuclei extraction. Similar filters with the same mesh size can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips (P20, P200, P1000)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube, 50mL/15mL, Centrifuge, Conical</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>28-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube, Microcentrifuge, 1.5/2 mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-912-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers (50mL &#8211; 2L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge with cooling</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-690-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinging-bucket centrifuge with cooling</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-728-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath Sonicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-336-120</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of histone from sorghum leaf tissue for top down mass spectrometry profiling of potential epigenetic markers

Histone gehören zu einer Familie von hochkonservierten Proteinen in Eukaryoten. Sie packen DNA als funktionelle Chromatineinheiten in Nukleosomen ein. Posttranslationale Modifikationen (PTMs) von Histonen, die hochdynamisch sind und durch Enzyme hinzugefügt oder entfernt werden können, spielen eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Genexpression. In Pflanzen stehen epigenetische Faktoren, einschließlich Histon-PTMs, im Zusammenhang mit ihren adaptiven Reaktionen auf die Umwelt. Das Verständnis der molekularen Mechanismen der epigenetischen Kontrolle kann beispiellose Chancen für innovative Bioengineering-Lösungen mit sich bringen. Hierin beschreiben wir ein Protokoll, um die Kerne zu isolieren und Histone aus Sorghumblattgewebe zu reinigen. Die extrahierten Histone können in ihren intakten Formen durch Top-Down-Massenspektrometrie (MS) gekoppelt mit der Online-Rektokphase (RP) Flüssigchromatographie (LC) analysiert werden. Kombinationen und Stoichiometrie mehrerer PTMs auf demselben Histonproteoform können leicht identifiziert werden. Darüber hinaus kann Histonschwanzclipping mit dem Top-Down-LC-MS-Workflow erkannt werden, wodurch das globale PTM-Profil von Kernhistonen (H4, H2A, H2B, H3) entsteht. Wir haben dieses Protokoll zuvor angewendet, um Histon-PTMs aus Sorghumblattgewebe zu profilieren, das aus einer groß angelegten Feldstudie gesammelt wurde, um epigenetische Marker der Dürreresistenz zu identifizieren. Das Protokoll könnte möglicherweise für die Chromatin-Immunpräzipationssequenzierung (ChIP-seq) oder für die Untersuchung von Histon-PTMs in ähnlichen Pflanzen angepasst und optimiert werden.

Nach dem Protokoll können die Histonen mit der LC-MS-Analyse extrahiert und identifiziert werden. Die Rohdaten und verarbeiteten Ergebnisse sind bei MassIVE (https://massive.ucsd.edu/) über den Beitritt verfügbar: MSV000085770. Basierend auf den TopPIC-Ergebnissen aus der repräsentativen Stichprobe (auch bei MassIVE erhältlich) identifizierten wir 303 Histonproteoformen (106 H2A, 72 H2B, 103 H3 und 22 H4 Proteoformen). Auch ko-gereinigte ribosomale Proteoformen wurden nachgewiesen, die typischerweise früh im LC elu...

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Isolation of Histone from Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profiling of Potential Epigenetic Markers

Das Protokoll wurde entwickelt, um intakte Histone effektiv aus Sorghumblattmaterialien für die Profilierung von histonenposttranslationalen Modifikationen zu extrahieren, die als potenzielle epigenetische Marker dienen können, um die Konstruktion von dürreresistenten Kulturen zu unterstützen.

Isolierung von Histon von Sorghum Blattgewebe für Top Down Mass Spektrometrie Profilierung von potenziellen epigenetischen Markern

Histones belong to a family of highly conserved proteins in eukaryotes. They pack DNA into nucleosomes as functional units of chromatin. ...

Unser Protokoll deckt epigenetische Marker für die Entwicklung von Sorghumpflanzen und Dietrockenheit auf. Ein solches molekulares Verständnis wird dazu beitragen, bessere Lösungen zu entwickeln, um Pflanzen in Zukunft an extreme Klimazonen anzupassen. Dieses Protokoll erzeugt hochreine Histone aus Sorghumblattgewebe, das für eine ungezielte Profilierung posttranslationaler Modifikationen durch Massenspektrometrie geeignet ist.Demonstriert werden Shadan Abdali und Tanya Winkler, Post-Bachelor-Forschungsmitarbeiter von EMSL. Zunächst ein paar Sorghumblätter mit flüssigem Stickstoff mahlen und in einem 50 Milliliter Zentrifugenrohr bei minus 80 Grad Celsius lagern. Verwenden Sie etwa vier Gramm des Blattpulvers für die Histonanalyse jeder Probe.Bereiten Sie die Extraktionspuffer 1, 2A und 2B wie im Textmanuskript beschrieben vor und fügen Sie eine Protease-Hemmer-Tablette zu Extraktionspuffer eins hinzu, um eine endgültige Konzentration von 0,2X zu erreichen. Dann 20 Milliliter des vorbereiteten Extraktionspuffers zum gemahlenen Blattpulver geben und 10 Minuten lang sanft mischen oder wirbeln. Spülen Sie das gefilterte Material mit Mesh 100 zweimal mit zwei Millilitern Extraktionspuffer eins jedes Mal.Als nächstes zentrifugieren Sie das Filtrat bei 3.000 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius in einem schwingenden Schaufelrotor, um den Zellabfall und große subzelluläre Organellen zu pellet. Gleichzeitig bereiten Sie extraktionspuffer 2A vor, indem Sie Protease-Inhibitor zu einer Endkonzentration von 0,4X hinzufügen. Entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören.Dann das Pellet in fünf Millilitern des vorbereiteten Extraktionspuffers 2A wieder aufhängen. 10 Minuten lang mit sanftem Mischen auf Eis bebrüten. Zentrifugieren Sie die Lösung bei 2, 100 mal G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius in einem schwingenden Schaufelrotor, um die Trümmer und Kerne zu pellet.Dekantieren Sie den Überstand sorgfältig, ohne das Pellet zu stören. Bereiten Sie Extraktionspuffer 2B vor, indem Sie die Protease-Inhibitoren zu einer Endkonzentration von 1X hinzufügen. Fügen Sie dem nach der Zentrifugation erhaltenen Pellet fünf Milliliter dieses vorbereiteten Puffers hinzu.Zentrifuge bei 2, 100 mal G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius im schwingenden Schaufelrotor zu Pelletschutt und Kernen. Gleichzeitig einen Kernlysepuffer vorbereiten, indem Sie eine Protease-Hemmer-Tablette hinzufügen. Den Überstand vorsichtig dekantieren, ohne das Pellet zu stören, und das Pellet in 250 Mikroliter des Lysepuffers wieder aufhängen.Wirbel die Lösung für 15 Sekunden bei maximaler Geschwindigkeit, um es zu homogenisieren und das Material wieder aufzuhängen. Dann beschallen Sie es für fünf Minuten bei vier Grad Celsius und lagern Sie es bei minus 80 Grad Celsius. Die gefrorene Kernprobe auftauen und 750 Mikroliter 5%Guanidinpuffer hinzufügen.Dann beschallen Sie es für 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie die Probe auf ein Zwei-Milliliter-Rohr und drehen Sie sie bei 10.000 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Gleichzeitig bereiten Sie eine Ionenaustauschchromatographie-Säule vor, indem Sie sie mit zwei Milliliteracetonitril und vier Milliliter Wasser spülen, um die Kontamination an der Oberfläche zu minimieren.Etwa 200 bis 300 Mikroliter schwachen Kationenaustauschharzes auf die Chromatographiesäule laden und das Harz absetzen lassen. Waschen Sie das Harz viermal mit Guanidinpuffer und legen Sie die Röhre und Säule auf Eis. Legen Sie die Säule auf ein Zwei-Milliliter-Sammelrohr und laden Sie den Überstand aus der vorbereiteten Probe langsam auf das Harzbett, ohne das Harz zu stören.Wenn die Lösung durchfließt, laden Sie das Eluent sechs- bis achtmal wieder an die Spitze der Säule, um eine maximale Bindung an das Harz zu ermöglichen. Dann zwei Milliliter 5%Guanidinpuffer laden, um die nicht-histonen Proteine von der Säule zu waschen. Elute die Histonproteine mit einem Milliliter 5%GuanidinPuffer und sammeln Sie das Eluent.Reinigen Sie einen drei Kilodalton Cutoff Spin Filter mit 500 Mikroliter Waschlösungsmittel, dann entsalzen Sie das restliche Eluent mit dem vorgereinigten Spinfilter. Wichtige Histonproteine wurden in bestimmten Regionen der LC-MS-Featurekarte beobachtet, die auf den Erfolg des Experiments hinweisen. Diese repräsentative Karte zeigt intakte Histones in voller Länge in gestrichelten Boxen.Die LC-MS-Featurekarte von H2B und 16 Kilodalton H2A Proteoformen zeigt, dass beide mehrere Homologe mit ähnlichen Sequenzen haben, wie die eindeutigen Produktsitzungsnummern zeigen. Eine andere Gruppe von H2A-Histonen ohne die verlängerten Schwänze ist zu sehen. Die N-terminale Acetylierung, zusätzliche Lysin-Acetylierungen und Methionin-Oxidationen in H4-Histonproteinen können beobachtet werden, indem die Massenunterschiede in der hier gezeigten LC-MS-Featurekarte untersucht werden.Für H3-Histonproteine, H3.3 und H3.2, wurden zwei Proteinsequenzen identifiziert. Die Fragmentierung der Elektronentransferdissoziation wurde verwendet, um das Fragmentierungsspektrum des identifizierten H3.2-Proteoform zu erzeugen. Die Vorläuferionen und die vorherigen und nächsten Ms1-Spektren werden hier mit ihren abgestimmten Isotopenspitzen in Violett dargestellt.Post-translationale Änderungen können mithilfe der Sequenzabdeckungskarte lokalisiert werden. Durch den Vergleich der relativen Häufigkeit der Proteoformen wurden Veränderungen der abgeschnittenen Histonproteoformen entdeckt, die spezifisch für Probenbedingungen sind. C-Terminal-Abschneidung von H4 wurde nur in den Wochen drei und neun für einige der Proben beobachtet.Für H3.2 waren N-Terminal abgeschnittene Proteoformen in der Regel häufiger in Woche 10. Im Gegensatz dazu wurden C-Terminal abgeschnitten H3.2 wurden in früheren Zeitpunkten gesehen. Die H4 C-Terminal abgeschnittenen Proteoformen waren bei BTx642 deutlich häufiger als bei RTx430.Achten Sie beim Versuch dieses Protokolls auf die Farben des Überstandes und des Pellets. Der Farbwechsel hilft, mögliche Probleme beim Schleifen oder Lyse des Chloroplasten zu identifizieren. Wir hoffen, dass dieses robuste Protokoll zur Histonisolation von Sorghumblättern epigenetische Forschung für andere ähnliche Pflanzen ermöglichen wird.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie zur metabolischen Profils von biologischen Proben

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Forschung

Biochemie

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Struktur Protein Studium und Dynamik

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Auflösen von Affinity Purified Protein-Komplexen von Blue native PAGE und Protein Correlation Profilieren

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Lipid Droplet Isolierung für die quantitative Massenspektrometrie-Analyse

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Probenvorbereitung für Masse Spektrometrie-basierte Identifikation der RNA-bindende Regionen

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Tiefen Proteom Profilierung durch isobare Kennzeichnung, umfangreiche Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie und softwaregestützte Quantifizierung

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Blatt-Spray-Massenspektrometrie: Eine schnelle Ambient Ionisation Technik direkt Metaboliten von Pflanzengewebe bewerten

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptid Profilierung und Identifikation illustriert von Angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Probenvorbereitung für Probe Elektrospray-Ionen-Massenspektrometrie

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Etikettenfreier Immunpräzipitations-Massenspektrometrie-Workflow für großangelegtes Nuklear-Interactome-Profiling

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...