Name: isolation of histone from sorghum leaf tissue for top down mass spectrometry profiling of potential epigenetic markers
Uploaded: 2021-03-04T13:00:00
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大量分析実験を支援してくれたロナルド・ムーアとトーマス・フィルモア、データ沈着に対するマシュー・モンローに感謝します。この研究は、米国農務省(USDA;)から、ソルガム(EPICON)プロジェクトにおける干ばつ反応のエピジェネティックな制御を通じた米国エネルギー省(DOE)生物環境研究からの助成金によって資金提供されました。CRIS 2030-21430-008-00D)、およびローレンス・バークレー国立研究所とDOEの間でDOE(契約DE-AC02-05CH11231)が主催する共同バイオエネルギー研究所(JBEI)を通じて。研究は、生物環境研究室が主催するDOE科学利用者施設事務所である環境分子科学研究所(EMSL)(grid.436923.9)を使用して行われました。

1. ソルガム葉材の準備
注:ソルガム植物は、パリエ、CAのフィールドの土壌で栽培されました。
<ol><li>植物から50 mL遠心分離チューブにソルガムの葉を収集し、すぐに液体窒素でチューブを凍結します。第一耕耕使用機から3番目と4番目の完全に浮かんだ葉を引き裂くことによって葉組織を収集する。 注: フィールド条件、サンプルの増加、および収集の詳細について?...

<ol>
	<li>Farooq, M., Wahid, A., Kobayashi, N., Fujita, D., Basra, S. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+drought+stress:+Effects,+mechanisms+and+management.">Plant drought stress: Effects, mechanisms and management.</a> Agronomy for Sustainable Development. , 153-188 (2009).</li><li>Dai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drought+under+global+warming:+a+review.">Drought under global warming: a review.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Climate Change. 2 (1), 45-65 (2011).</li><li>Rooney, W. L., Blumenthal, J., Bean, B., Mullet, J. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+quantification+of+histone+post-translational+modifications+by+a+hybrid+chemical+labeling+method.">Mass spectrometric quantification of histone post-translational modifications by a hybrid chemical labeling method.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 14 (4), 1148-1158 (2015).</li><li>Dang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+pilot+project+of+the+consortium+for+top-down+proteomics:+a+status+report.">The first pilot project of the consortium for top-down proteomics: a status report.</a> Proteomics. 14 (10), 1130-1140 (2014).</li><li>Schaffer, L. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C-Score:+a+bayesian+framework+to+sharply+improve+proteoform+scoring+in+high-throughput+top+down+proteomics.">The C-Score: a bayesian framework to sharply improve proteoform scoring in high-throughput top down proteomics.</a> Journal of Proteome Research. 13 (7), 3231-3240 (2014).</li><li>Fornelli, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+top-down+analysis+of+the+human+proteome+using+a+benchtop+quadrupole-orbitrap+mass+spectrometer.">Advancing top-down analysis of the human proteome using a benchtop quadrupole-orbitrap mass spectrometer.</a> Journal of Proteome Research. 16 (2), 609-618 (2017).</li><li>Sun, R. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pTop+1.0:+A+high-accuracy+and+high-efficiency+search+engine+for+intact+protein+identification.">pTop 1.0: A high-accuracy and high-efficiency search engine for intact protein identification.</a> Analytical Chemistry. 88 (6), 3082-3090 (2016).</li><li>Xiao, K., Yu, F., Tian, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+protein+identification+using+isotopic+envelope+fingerprinting.">Top-down protein identification using isotopic envelope fingerprinting.</a> Journal of Proteomics. 152, 41-47 (2017).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MASH+Suite+Pro:+A+comprehensive+software+tool+for+top-down+proteomics.">MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics: MCP. 15 (2), 703-714 (2016).</li><li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+mass+spectrometry+of+histone+modifications+in+sorghum+reveals+potential+epigenetic+markers+for+drought+acclimation.">Top-down mass spectrometry of histone modifications in sorghum reveals potential epigenetic markers for drought acclimation.</a> Methods. , (2019).</li><li>Garcia, B. A., Pesavento, J. J., Mizzen, C. A., Kelleher, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pervasive+combinatorial+modification+of+histone+H3+in+human+cells.">Pervasive combinatorial modification of histone H3 in human cells.</a> Nature Methods. 4 (6), 487-489 (2007).</li><li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unabridged+analysis+of+human+histone+H3+by+differential+top-down+mass+spectrometry+reveals+hypermethylated+proteoforms+from+MMSET/NSD2+overexpression.">Unabridged analysis of human histone H3 by differential top-down mass spectrometry reveals hypermethylated proteoforms from MMSET/NSD2 overexpression.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics: MCP. 15 (3), 776-790 (2016).</li><li>Garcia, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+derivatization+of+histones+for+facilitated+analysis+by+mass+spectrometry.">Chemical derivatization of histones for facilitated analysis by mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 2 (4), 933-938 (2007).</li><li>Holt, M. V., Wang, T., Young, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-pot+quantitative+top-+and+middle-down+analysis+of+GluC-digested+histone+H4.">One-pot quantitative top- and middle-down analysis of GluC-digested histone H4.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (12), 2514-2525 (2019).</li><li>Tian, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+top-down+characterization+of+histone+post-translational+modifications.">Enhanced top-down characterization of histone post-translational modifications.</a> Genome Biology. 13 (10), (2012).</li><li>Wang, Z., Ma, H., Smith, K., Wu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+separation+using+high-pH+and+low-pH+reversed+phase+liquid+chromatography+for+top-down+proteomics.">Two-dimensional separation using high-pH and low-pH reversed phase liquid chromatography for top-down proteomics.</a> International Journal of Mass Spectrometry. 427, 43-51 (2018).</li><li>Gargano, A. F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+separation+capacity+of+intact+histone+proteoforms+chromatography+coupling+online+weak+cation+exchange-HILIC+to+reversed+phase+LC+UVPD-HRMS.">Increasing the separation capacity of intact histone proteoforms chromatography coupling online weak cation exchange-HILIC to reversed phase LC UVPD-HRMS.</a> Journal of Proteome Research. 17 (11), 3791-3800 (2018).</li></ol>

提示されたプロトコルは、ソルガムの葉(またはより一般的には植物葉)サンプルからヒストンを抽出する方法を説明します。ヒストンの平均収量は、4~5gのソルガム葉材料あたり2〜20μgと予想されます。材料はLC-MSによる下流ヒストン分析のために十分に純粋である(ほとんどが約20%リボソームタンパク質汚染を有するヒストン)。低い収率は、サンプルの変動、またはプロトコル全体での誤った...

干ばつの深刻度と頻度の増加は、穀物作物1、2の生産性に影響を与えると予想される。ソルガムは、水を制限する条件3、4に耐えるその例外的な能力のために知られている穀物の食糧とエネルギー作物です。我々は、干ばつストレス、植物の発達、およびソルガム[ソルガム二色(L.)Moench]植物のエピジェネティクス間の相互作用の機械学的理解を追求している。我々の前の研究は、植物と根球微生物叢との間の強い関係を、干ばつ順応と分子レベル5、6、7での応答で実証した。この研究は、将来の気候シナリオに作物を適応させる上でエピジェネティック工学を利用する道を開く。エピジェネティクスの理解の一環として、植物生物の遺伝子発現に影響を与えるタンパク質マーカーの研究を目指しています。
ヒストンは、真核生物中のタンパク質の高度に保存されたファミリーに属し、DNAをクロマチンの基本単位としてヌクレオソームに詰め込みます。ヒストンの翻訳後修飾(PTM)は、クロマチン構造を制御し、遺伝子発現に影響を与えるために動的に調節される。DNAメチル化を含む他のエピジェネティック因子と同様に、ヒストンPTMは多くの生物学的プロセス8,9において重要な役割を果たす。ウエスタンブロットなどの抗体ベースのアッセイは、ヒストンPTMを同定し定量するために広く使用されてきました。さらに、ヒストンPTMsとDNAの相互作用は、クロマチン免疫沈降法(ChIP-seq)10によって効果的にプローブすることができる。ChIP-seqでは、特定の標的ヒストンPTMを有するクロマチンは、その特定のPTMに対する抗体によって濃縮される。次いで、DNA断片を濃縮クロマチンから放出し、配列することができる。標的ヒストンPTMと相互作用する遺伝子の領域が明らかになる。しかし、これらの実験はすべて、高品質の抗体に大きく依存しています。いくつかのヒストン変異体/ホモログまたはPTMの組み合わせでは、堅牢な抗体の開発は非常に困難な場合があります(特に複数のPTMの場合)。さらに、抗体は、標的ヒストンPTMが既知である場合にのみ開発することができる。11したがって、ヒストンPTMの対象を絞り込みずグローバルプロファイリングを行うための代替方法が必要です。
質量分析(MS)は、ヒストンPTMを特徴付ける相補的な方法であり、抗体が利用できない未知のPTMを含む11,12。よく確立された「ボトムアップ」MSワークフローは、液体クロマトグラフィー(LC)分離およびMS検出前にタンパク質を小さなペプチドに消化するためにプロテアーゼを使用します。ヒストンは、塩基性残基(リジンとアルギニン)が多いため、標準的なボトムアップワークフローにおけるトリプシン消化(リジンおよびアルギニンに特異的なプロテアーゼ)は、タンパク質を非常に短いペプチドに切り込みます。短いペプチドは、標準的なLC-MSによる分析が技術的に困難であり、複数のPTMの接続性および量論に関する情報を保持しません。他の酵素または化学標識を使用してリジンをブロックすると、ヒストンPTMs13,14の特性評価に適した長いペプチドが生成される。
あるいは、消化ステップを完全に省略することができる。この「トップダウン」アプローチでは、インタクトプロテインイオンは、オンラインLC分離後にエレクトロスプレーイオン化(ESI)によりMSに導入され、インタクトヒストンプロテオフォームのイオンを生み出します。さらに、目的のイオン(すなわち、プロテオフォーム)を、質量分析計で単離および断片化して、同定およびPTM局在化のために配列イオンを得ることができる。したがって、トップダウンMSは、プロテオフォームレベルの情報を保持し、同じプロテオフォーム15、16上の複数のPTMおよび端末切り捨ての接続性を捕捉する利点を有する。トップダウン実験は、定量的な情報を提供し、インタクトプロテインレベル17でバイオマーカーの洞察を提供することもできます。本明細書では、ソルガム葉からヒストンを抽出し、トップダウンLC-MSによって無傷のヒストンを分析するプロトコルについて述べている。
図1と図2に示すサンプルデータは、植え付け後の第2週に収集されたソルガム葉から取得したものです。収量の変動が予想されるが、このプロトコルは一般に特定のサンプル条件に対して無依存である。同じプロトコルは、植え付け後2、3、5、8、9、および10週間から採取されたソルガム植物葉組織に対して正常に使用されています。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A955-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, 500mM Solution, pH 8.0</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>324504-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine Hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G3272-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate, dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3786-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail, cOmplete tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5892791001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium butyrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>303410-5G</td>
			<td>Used for histone deacetylase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7020-100G</td>
			<td>Used for phosphatase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Orthovanadate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>450243-10G</td>
			<td>Used for phosphatase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7903-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP153-500 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weak cation exchange resin, mesh 100-200 analytical (BioRex70)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>142-5842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatography column (Bio-Spin)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>732-6008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh 100 filter cloth</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>NY1H09000</td>
			<td>This is part of the Sigma kit (catalog # CELLYTPN1) for plant nuclei extraction. Similar filters with the same mesh size can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips (P20, P200, P1000)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube, 50mL/15mL, Centrifuge, Conical</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>28-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube, Microcentrifuge, 1.5/2 mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-912-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers (50mL &#8211; 2L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge with cooling</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-690-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinging-bucket centrifuge with cooling</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-728-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath Sonicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-336-120</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of histone from sorghum leaf tissue for top down mass spectrometry profiling of potential epigenetic markers

ヒストンは真核生物中の高度に保存されたタンパク質のファミリーに属しています。彼らはクロマチンの機能的単位としてDNAをヌクレオソームに詰め込む。ヒストンのトランスレーショナル後修飾(PTM)は、非常に動的で、酵素によって追加または除去され、遺伝子発現を調節する上で重要な役割を果たします。植物では、ヒストンPTMを含むエピジェネティック要因は、環境に対する適応応答に関連しています。エピジェネティックコントロールの分子メカニズムを理解することは、革新的なバイオエンジニアリングソリューションの前例のない機会をもたらすことができます。ここで、我々は、核を分離し、ソルガム葉組織からヒストンを浄化するプロトコルを記述する。抽出されたヒストンは、トップダウン質量分析(MS)とオンライン逆相(RP)液体クロマトグラフィー(LC)を組み合わせることで、無傷の形態で分析することができます。同じヒストンプロテオーフォーム上の複数のPTMの組み合わせおよび量合体測定は容易に同定することができる。さらに、ヒストンテールクリッピングは、トップダウンLC-MSワークフローを使用して検出することができ、したがって、コアヒストン(H4、H2A、H2B、H3)のグローバルPTMプロファイルを生成します。我々は、以前にこのプロトコルを適用して、干ばつ抵抗性のエピジェネティックマーカーを同定することを目的とした大規模なフィールドスタディから採取したソルガム葉組織からのヒストンPTMをプロファイリングした。このプロトコルは、クロマチン免疫沈降シーケンシング(ChIP-seq)、または同様の植物でヒストンPTMを研究するために適応され、最適化される可能性があります。

プロトコルに従って、ヒストンを抽出し、LC-MS 分析を使用して識別できます。生データと処理結果は、アクセスを介して MassIVE (https://massive.ucsd.edu/) で入手できます: MSV000085770。代表的なサンプル(MassIVEからも入手可能)のTopPIC結果に基づいて、303ヒストンプロテオフォーム(106 H2A、72 H2B、103 H3、および22 H4プロテオフォーム)を同定しました。共精製リボソームプロテオフォームも検出されてお?...

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Isolation of Histone from Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profiling of Potential Epigenetic Markers

このプロトコルは、エンジニアリングの干ばつ耐性作物を支援するための潜在的なエピジェネティックマーカーとして機能するヒストン翻訳後修飾のプロファイリングのために、ソルガム葉材料から無傷のヒストンを効果的に抽出するために開発されました。

潜在的エピジェネティックマーカーのトップダウン質量分析プロファイリングのためのソルガム葉組織からのヒストンの分離

Histones belong to a family of highly conserved proteins in eukaryotes. They pack DNA into nucleosomes as functional units of chromatin. ...

私たちのプロトコルは、ソルガム植物の開発と干ばつ耐性のためのエピジェネティックマーカーを発見します。このような分子理解は、将来の極端な気候に合わせて作物を適応させるより良い解決策を開発するのに役立ちます。このプロトコルは、質量分析による翻訳後修飾の非標的プロファイリングに適したソルガム葉組織から高純度ヒストンを生成する。この手順のデモンストレーションは、EMSLの独身後の研究員であるシャダン・アブダリとターニャ・ウィンクラーです。まず、液体窒素でいくつかのソルガムの葉を粉砕し、マイナス80度の50ミリリットル遠心管に保存します。各サンプルのヒストン分析には約4グラムの葉粉末を使用してください。テキスト原稿に記載されているように抽出バッファー1、2A、および2Bを調製し、抽出バッファー1にプロテアーゼ阻害剤錠剤を添加して、0.2Xの最終濃度を作る。その後、調製した抽出バッファーの 1 つを 1 本ずつ地葉粉末に加え、10 分間静かに混合または渦を混ぜます。メッシュ100を用いて、濾過した材料を2ミリリットルの抽出バッファーを1回ずつ2回リンスする。次に、振るバケツローターで摂氏4度で10分間Gの3,000倍の濾液を遠心分離し、細胞デブリおよび大きな細胞内小器官をペレットする。同時に、0.4Xの最終濃度にプロテアーゼ阻害剤を添加して抽出緩衝液2Aを調製する。ペレットを邪魔することなく上清を捨てます。次に、調製した抽出バッファー2Aの5ミリリットルにペレットを再懸濁する。氷の上で10分間、穏やかな混合でインキュベートします。2,100回Gで溶液を振るバケツローターで摂氏4度で15分間遠心分離し、破片および核をペレット化する。ペレットを邪魔することなく上清を慎重にデカントします。抽出緩衝液2Bを、1Xの最終濃度にプロテアーゼ阻害剤を添加して調製する。この調製したバッファーの 5 ミリリットルを遠心分離後に得られたペレットに加えます。2で遠心分離機2、100回Gを4°Cで15分間ペレットデブリおよび核に振る。同時に、プロテアーゼ阻害剤を錠剤に添加して核ライシス緩衝液を調製する。慎重にペレットを乱すことなく上清をデカントし、リシスバッファーの250マイクロリットルでペレットを再懸濁します。溶液を最高速度で15秒間ボルテックスして均質化し、材料を再懸濁させる。その後、摂氏4度で5分間超音波処理し、マイナス80度で保存します。凍結した核試料を解凍し、5%グアニジンバッファーの750マイクロリットルを加える。その後、摂氏4度で15分間超音波処理します。サンプルを2ミリリットルチューブに移し、摂氏4度で10分間Gの10,000倍に回転させます。同時に、イオン交換クロマトグラフィーカラムを2ミリリットルのアセトニトリルと4ミリリットルの水でリンスして、表面の汚染を最小限に抑えます。弱カチオン交換樹脂を約200~300マイクロリットルのクロマトグラフィーカラムに積み込み、樹脂を落ち着かせる。ゲルをグアニジンバッファーで樹脂を 4 回洗浄し、チューブとカラムを氷の上に置きます。2ミリリットルの回収チューブにカラムを置き、樹脂を破壊することなく、準備したサンプルから上澄みをゆっくりと樹脂ベッドに積み込みます。溶液が流れ込む中、溶出液をカラムの上部に6~8回戻し、樹脂への最大結合を可能にします。その後、5%グアニジンバッファーの2ミリリットルをロードし、非ヒストンタンパク質をカラムから洗い流します。ヒストンタンパク質を5%グアニジンバッファーの1ミリリットルで溶出し、溶出液を収集します。洗浄溶媒500マイクロリットルで3キロダルトンカットオフスピンフィルターを洗浄し、その後、事前に洗浄されたスピンフィルターを使用して残りの溶出物を脱塩します。主要ヒストンタンパク質は、実験の成功を示すLC-MS特徴マップの特定の領域で観察された。この代表的なマップは、破線のボックスに完全な長さのヒストンをそのまま表示します。H2Bと16キロダルトンH2AプロテオフォームのLC-MS特徴マップは、両方ともユニークな製品セッション番号で示されているように、類似した配列を持つ複数のホモログを有することを示しています。延長された尾を持たないH2Aヒストンの別のグループが見られる。N末端アセチル化、追加のリジンアセチル化、およびH4ヒストンタンパク質におけるメチオニン酸化は、ここに示すLC-MS特徴マップの質量差を調べることによって観察することができる。H3ヒストンタンパク質に対して同定された2つのタンパク質配列、H3.3およびH3.2があった。電子伝達解離断片化は、同定されたH3.2プロテオフォームの断片化スペクトルを生成するために使用した。前駆体イオンと前および次のMs1スペクトルは、一致した同位体のピークが紫色で強調表示された状態でここに示されています。翻訳後の変更は、シーケンス カバレッジ マップを使用してローカライズできます。プロテオフォームの相対的な存在量を比較することにより、サンプル条件に特異的な切り捨てられたヒストンプロテオフォームの変化が発見された。H4のC末端切り捨ては、いくつかのサンプルについて3週と9週間でしか観察されなかった。H3.2の場合、N末端切り捨てプロテオフォームは一般的に第10週でより豊富であった。これに対し、C端子切り捨てH3.2は以前の時点で見られました。H4 C末端切り捨てプロテオフォームは、RTx430よりもBTx642に有意に豊富であった。このプロトコルを試みるとき、上清とペレットの色に細心の注意を払ってください。色の変化は、葉葉芽細胞の粉砕またはリシスの潜在的な問題を特定するのに役立ちます。私たちは、ソルガム葉からのヒストン分離のためのこの堅牢なプロトコルが、他の同様の植物のエピジェネティック研究を可能にすることを願っています。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

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Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

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Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

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定圧ラベリング、豊富な液体クロマトグラフィー、質量分析法、およびソフトウェアによる定量化して深いプロテオームをプロファイリング

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Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

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Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

大規模核インターロームプロファイリングのためのラベルフリー免疫沈降質量分析ワークフロー

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...