Name: isolation of histone from sorghum leaf tissue for top down mass spectrometry profiling of potential epigenetic markers
Uploaded: 2021-03-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Histone from Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profiling of Potential Epigenetic Markers at JoVE.com

우리는 대량 분광 실험에 도움을 준 로널드 무어와 토마스 필모어, 그리고 매튜 먼로에게 데이터 증착을 해준 것에 감사드립니다. 이 연구는 미국 농무부(USDA)의 수상 번호 DE-SC0014081에 따라 수쿰(EPICON) 프로젝트에서 가뭄 대응의 후성유전학 적 통제를 통해 미국 에너지부 (DOE) 생물 및 환경 연구의 보조금에 의해 지원되었다; CRIS 2030-21430-008-00D, 그리고 공동 바이오 에너지 연구소 (JBEI)를 통해, 로렌스 버클리 국립 연구소와 DOE 사이의 DOE (계약 DE-AC02-05CH11231)가 후원하는 시설. 이 연구는 생물환경연구실이 후원하는 과학사용자 시설 DOE 사무소인 환경 분자 과학 연구소(EMSL)(grid.436923.9)를 사용하여 수행되었습니다.

1. 사탕수수 잎 소재 준비
참고 : 사탕수수 식물은 칼리어, 캘리포니아에있는 필드에 토양에서 재배되었다.
<ol><li>식물에서 수중 잎을 50mL 원심분리기 튜브로 수집하고 즉시 액체 질소로 튜브를 얼릴 수 있습니다. 제 3 및 네 번째 완전히 출현 한 잎을 1 차 경작기에서 떼어 내며 잎 조직을 수집하십시오. 참고: 현장 상태, 샘플 증가 및 수집에 대한 자세한 내용은 게시된 보고...

<ol>
	<li>Farooq, M., Wahid, A., Kobayashi, N., Fujita, D., Basra, S. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+drought+stress:+Effects,+mechanisms+and+management.">Plant drought stress: Effects, mechanisms and management.</a> Agronomy for Sustainable Development. , 153-188 (2009).</li><li>Dai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drought+under+global+warming:+a+review.">Drought under global warming: a review.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Climate Change. 2 (1), 45-65 (2011).</li><li>Rooney, W. L., Blumenthal, J., Bean, B., Mullet, J. 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X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pTop+1.0:+A+high-accuracy+and+high-efficiency+search+engine+for+intact+protein+identification.">pTop 1.0: A high-accuracy and high-efficiency search engine for intact protein identification.</a> Analytical Chemistry. 88 (6), 3082-3090 (2016).</li><li>Xiao, K., Yu, F., Tian, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+protein+identification+using+isotopic+envelope+fingerprinting.">Top-down protein identification using isotopic envelope fingerprinting.</a> Journal of Proteomics. 152, 41-47 (2017).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MASH+Suite+Pro:+A+comprehensive+software+tool+for+top-down+proteomics.">MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics: MCP. 15 (2), 703-714 (2016).</li><li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+mass+spectrometry+of+histone+modifications+in+sorghum+reveals+potential+epigenetic+markers+for+drought+acclimation.">Top-down mass spectrometry of histone modifications in sorghum reveals potential epigenetic markers for drought acclimation.</a> Methods. , (2019).</li><li>Garcia, B. A., Pesavento, J. J., Mizzen, C. A., Kelleher, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pervasive+combinatorial+modification+of+histone+H3+in+human+cells.">Pervasive combinatorial modification of histone H3 in human cells.</a> Nature Methods. 4 (6), 487-489 (2007).</li><li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unabridged+analysis+of+human+histone+H3+by+differential+top-down+mass+spectrometry+reveals+hypermethylated+proteoforms+from+MMSET/NSD2+overexpression.">Unabridged analysis of human histone H3 by differential top-down mass spectrometry reveals hypermethylated proteoforms from MMSET/NSD2 overexpression.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics: MCP. 15 (3), 776-790 (2016).</li><li>Garcia, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+derivatization+of+histones+for+facilitated+analysis+by+mass+spectrometry.">Chemical derivatization of histones for facilitated analysis by mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 2 (4), 933-938 (2007).</li><li>Holt, M. V., Wang, T., Young, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-pot+quantitative+top-+and+middle-down+analysis+of+GluC-digested+histone+H4.">One-pot quantitative top- and middle-down analysis of GluC-digested histone H4.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (12), 2514-2525 (2019).</li><li>Tian, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+top-down+characterization+of+histone+post-translational+modifications.">Enhanced top-down characterization of histone post-translational modifications.</a> Genome Biology. 13 (10), (2012).</li><li>Wang, Z., Ma, H., Smith, K., Wu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+separation+using+high-pH+and+low-pH+reversed+phase+liquid+chromatography+for+top-down+proteomics.">Two-dimensional separation using high-pH and low-pH reversed phase liquid chromatography for top-down proteomics.</a> International Journal of Mass Spectrometry. 427, 43-51 (2018).</li><li>Gargano, A. F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+separation+capacity+of+intact+histone+proteoforms+chromatography+coupling+online+weak+cation+exchange-HILIC+to+reversed+phase+LC+UVPD-HRMS.">Increasing the separation capacity of intact histone proteoforms chromatography coupling online weak cation exchange-HILIC to reversed phase LC UVPD-HRMS.</a> Journal of Proteome Research. 17 (11), 3791-3800 (2018).</li></ol>

제시된 프로토콜은 사탕수수 잎(또는 일반적으로 식물 잎) 샘플에서 히스톤을 추출하는 방법을 설명합니다. 평균 히스톤 수율은 4-5g 의 사탕수수 잎 재료당 2-20 μg가 될 것으로 예상됩니다. 재료는 LC-MS에 의한 하류 히스톤 분석에 대해 충분히 순수합니다 (대부분 - 20 % 리보솜 단백질 오염이있는 히스톤). 샘플 변형 또는 프로토콜 전체의 잠재적 인 오류 처리 / 오류로 인해 낮은 수율을 얻을 수 있?...

가뭄의 심각도와 빈도가 증가하면 시리얼 작물1,2의생산성에 영향을 미칠 것으로 예상됩니다. 수쿰은3,4의수중제한조건을 견딜 수 있는 뛰어난 능력으로 유명한 시리얼 식품 및 에너지 작물입니다. 우리는 가뭄 스트레스, 식물 개발 및 사탕수수의 후성 유전학 사이의 상호 작용에 대한 기계적 이해를 추구하고 있습니다 [수줌 바이 컬러 (L.) Moench] 식물. 우리의 이전 작품은 가뭄 적응과 분자수준5,6,7에서반응에 식물과 뿌리 부피 미생물군유전체 사이의 강한 연결을 입증했다. 이 연구는 미래의 기후 시나리오에 작물을 적응에 후성 유전학 공학을 활용하기위한 길을 열 것입니다. 후성유전학을 이해하는 노력의 일환으로, 우리는 식물 유기체 내의 유전자 발현에 영향을 미치는 단백질 마커를 연구하는 것을 목표로 합니다.
히스톤은 크로마틴의 기본 단위로 뉴클레오소로 DNA를 포장하는 진핵생물에 있는 단백질의 높게 보존된 가족에 속합니다. 히스톤의 번역 후 변형(PTM)은 크로마틴 구조를 제어하고 유전자 발현에 영향을 미치기 위해 동적으로 조절됩니다. DNA 메틸화를 포함한 다른 후성 유전학 적 요인과 마찬가지로, 그의 톤 PTM은 많은 생물학적 과정에서 중요한 역할을합니다8,9. 서양 얼룩과 같은 항체 기반 의 소는 널리 그의 톤 PTM을 식별하고 정량화하는 데 사용되어 왔다. 또한, 히스톤 PTM 및 DNA의 상호작용은 크로마틴 면역 침전- 시퀀싱(ChIP-seq)10에의해 효과적으로 조사될 수 있다. ChIP-seq에서, 특정 표적 히스톤 PTM을 가진 크로마틴은 특정 PTM에 대하여 항체에 의해 풍부하게 된다. 이어서, DNA 단편은 농축 된 크로마틴에서 방출되고 시퀀스될 수 있다. 표적 히스톤 PTM과 상호 작용하는 유전자의 영역이 드러난다. 그러나 이러한 모든 실험은 고품질 항체에 크게 의존합니다. 일부 히스톤 변이체/동형학 또는 PTM의 조합의 경우 강력한 항체의 개발은 매우 어려울 수 있습니다(특히 여러 PTM의 경우). 또한, 항체는 표적 히스톤 PTM이 공지되는 경우에만 개발될 수 있다. 11 따라서, 그의 톤 PTM의 표적, 글로벌 프로파일링을위한 대체 방법이 필요합니다.
질량 분광법(MS)은 항체를 사용할 수 없는 알 수 없는 PTM을 포함하여 히스톤 PTM을 특성화하는 보완적인방법이다. 잘 확립된 "상향식" MS 워크플로우는 프로테아제스를 사용하여 액체 크로마토그래피(LC) 분리 및 MS 검출 전에 단백질을 작은 펩타이드로 소화합니다. 히스톤에는 많은 수의 기본 잔류물(리신 과 아르기닌)이 있기 때문에 표준 상향식 워크플로우에서 트립신 소화(리신 및 아르기닌에 특화된 프로테아제)는 단백질을 매우 짧은 펩타이드로 절단합니다. 짧은 펩타이드는 기술적으로 표준 LC-MS에 의해 분석하기 어렵고, 다중 PTM의 연결성 및 스토이치오메트리에 대한 정보를 보존하지 않는다. 다른 효소 또는 리신을 차단하기 위한 화학 라벨링을 사용하면 히스톤 PTMs13,14의특성화에 더 적합한 더 긴 펩티드를 생성한다.
또는 소화 단계를 완전히 생략할 수 있습니다. 이러한 "하향식" 접근법에서, 온전한 단백질 이온은 온라인 LC 분리 후 전기분무분화(ESI)에 의해 MS에 도입되어, 그대로 히스톤 프로테오폼의 이온을 산출한다. 또한, 관심의 이온(즉, 프로테오폼)은 질량 분광계에서 분리및 단편화되어 식별 및 PTM 국소화를 위한 서열 이온을 산출할 수 있다. 따라서 하향식 MS는 프로테오폼 수준의 정보를 보존하고 동일한프로테오폼(15,16)에서다중 PTM 및 단말 절단의 연결을 캡처할 수 있는 장점이 있다. 하향식 실험은 또한 정량적 정보를 제공하고 그대로 단백질 수준17에서바이오마커에 대한 통찰력을 제공할 수 있다. 본 명세서에서는 사탕수수 잎에서 히스톤을 추출하고 하향식 LC-MS로 손상되지 않은 히스톤을 분석하는 프로토콜을 설명합니다.
도 1 과 도 2에 표시된 예제 데이터는 심기 후 2 주차에 수집 된 사탕잎에서 수집됩니다. 수율의 변화가 예상되지만 이 프로토콜은 일반적으로 특정 샘플 조건에 불가지론적입니다. 동일한 프로토콜은 심기 후 2, 3, 5, 8, 9 및 10 주에서 수집 된 사탕 수 식물 잎 조직에 성공적으로 사용되었습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A955-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, 500mM Solution, pH 8.0</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>324504-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine Hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G3272-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate, dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3786-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail, cOmplete tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5892791001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium butyrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>303410-5G</td>
			<td>Used for histone deacetylase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7020-100G</td>
			<td>Used for phosphatase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Orthovanadate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>450243-10G</td>
			<td>Used for phosphatase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7903-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP153-500 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weak cation exchange resin, mesh 100-200 analytical (BioRex70)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>142-5842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatography column (Bio-Spin)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>732-6008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh 100 filter cloth</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>NY1H09000</td>
			<td>This is part of the Sigma kit (catalog # CELLYTPN1) for plant nuclei extraction. Similar filters with the same mesh size can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips (P20, P200, P1000)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube, 50mL/15mL, Centrifuge, Conical</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>28-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube, Microcentrifuge, 1.5/2 mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-912-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers (50mL &#8211; 2L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge with cooling</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-690-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinging-bucket centrifuge with cooling</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-728-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath Sonicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-336-120</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of histone from sorghum leaf tissue for top down mass spectrometry profiling of potential epigenetic markers

히스톤은 진핵생물에 있는 고도로 보존된 단백질의 가족에 속합니다. 그(것)들은 크로마틴의 기능적인 단위로 뉴클레오소좀으로 DNA를 포장합니다. 매우 역동적이고 효소에 의해 추가되거나 제거될 수 있는 히스톤의 번역 후 변형(PTM)은 유전자 발현 조절에 중요한 역할을 합니다. 식물에서, 후성 유전학 요인, histone PTM을 포함 하 여, 환경에 그들의 적응 응답과 관련. 후성 유전학 적 제어의 분자 메커니즘을 이해하면 혁신적인 생명 공학 솔루션에 전례없는 기회를 가져올 수 있습니다. 본명, 우리는 핵을 분리하고 사탕수수 잎 조직에서 히스톤을 정화하는 프로토콜을 설명합니다. 추출된 히스톤은 온라인 반전 단계(RP) 액체 크로마토그래피(LC)와 결합된 하향식 질량 분석법(MS)에 의해 온전한 형태로 분석될 수 있다. 동일한 히스톤 프로테오폼에 여러 PTM의 조합 과 스토이치오메트리를 쉽게 식별할 수 있다. 또한, 히스톤 테일 클리핑은 하향식 LC-MS 워크플로우를 이용하여 검출될 수 있으므로 코어 히스톤(H4, H2A, H2B, H3)의 글로벌 PTM 프로파일을 산출할 수 있다. 우리는 가뭄 저항의 후성 유전학 마커를 확인하기 위한 대규모 필드 연구 결과에서 집합된 사탕잎 조직에서 히스톤 PTM을 프로파일링하기 위하여 이전에 이 프로토콜을 적용했습니다. 이 프로토콜은 잠재적으로 크롬마틴 면역 침전 시퀀싱(ChIP-seq)에 맞게 조정되고 최적화될 수 있으며, 유사한 식물에서 그의 음색 PTM을 연구할 수 있습니다.

프로토콜에 따라, 히스톤은 LC-MS 분석을 사용하여 추출 및 식별될 수 있다. 원시 데이터 및 처리된 결과는 액세스를 통해 MassIVE(https://massive.ucsd.edu/)에서 사용할 수 있습니다: MSV0000085770. 대표 샘플(MassIVE에서도 사용 가능)의 TopPIC 결과를 바탕으로 303개의 히스톤 프로테오폼(106 H2A, 72 H2B, 103 H3 및 22 H4 프로테오폼)을 확인했습니다. 공동 정제 리보소말 프로테오폼도 검출되었으며, 일반적으로 LC초기에...

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Isolation of Histone from Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profiling of Potential Epigenetic Markers

이 프로토콜은 엔지니어링 가뭄 내성 작물을 돕기 위해 잠재적 후성 유전학 마커역할을 할 수 있는 번역 후 변형 후 프로파일링을 위해 사탕수잎 재료로부터 손상되지 않은 히스톤을 효과적으로 추출하기 위해 개발되었습니다.

잠재적 인 후성 유전학 마커의 하향 식 질량 분광프로파일링을위한 수줌 잎 조직에서 히스톤의 격리

Histones belong to a family of highly conserved proteins in eukaryotes. They pack DNA into nucleosomes as functional units of chromatin. ...

우리의 프로토콜은 사탕 수 수 식물 개발 및 가뭄 저항에 대한 후성 유전학 마커를 발견합니다. 이러한 분자 이해는 미래의 극단적 인 기후에 대한 작물을 적응하는 더 나은 솔루션을 개발하는 데 도움이 될 것입니다. 이 프로토콜은 질량 분석법에 의한 번역 후 수정의 미표적 프로파일링에 적합한 사탕잎 조직에서 고순도 히스톤을 생성한다.절차를 시연하는 것은 샤단 압달리와 타냐 윙클러, EMSL에서 학사 후 연구 동료가 될 것입니다. 우선, 액체 질소로 사탕수수 잎 몇 잎을 갈아서 섭씨 영하 80도에서 50 밀리리터 원심분리기 튜브에 보관하십시오. 각 샘플의 히스톤 분석을 위해 약 4 그램의 잎 분말을 사용하십시오.텍스트 원고에 설명된 대로 추출 버퍼 1, 2A 및 2B를 준비하고 추출 버퍼 에 프로테아제 억제제 정제를 추가하여 최종 농도를 0.2배 로 만듭니다. 그런 다음 준비된 추출 버퍼 20밀리리터를 분쇄 잎 분말에 넣고 10분 동안 부드럽게 혼합하거나 소용돌이를 만듭니다. 메쉬 100을 사용하여 여과된 재료를 매번 하나씩 추출 버퍼 2밀리리터로 두 번 헹구습니다.다음으로, 분과류는 3, 000배 G에서 10분 동안 스윙 버킷 로터에서 세포 파편과 큰 세포 세포 세포를 펠렛으로 처리합니다. 동시에 최종 농도0.4X에 프로테아제 억제제를 추가하여 추출 버퍼 2A를 준비한다. 펠릿을 방해하지 않고 상체를 버리십시오.그런 다음 준비된 추출 버퍼 2A의 5밀리리터에서 펠릿을 다시 중단한다. 부드러운 혼합으로 10 분 동안 얼음에 배양하십시오. 원심분리기는 2, 100회 G에서 15분간 4도에서 4도의 G로, 스윙 버킷 로터에서 이물질과 핵을 펠렛합니다.펠릿을 방해하지 않고 상체를 조심스럽게 장식합니다. 프로테아제 억제제를 1X의 최종 농도에 추가하여 추출 버퍼 2B를 준비한다. 원심 분리 후 얻은 펠릿에 이 준비된 버퍼 5밀리리터를 추가합니다.원심분리기는 2, 100회 G에서 15분간 스윙 버킷 로터에서 4°C에서 펠릿 파편과 핵을 배출합니다. 동시에 프로테아제 억제제 정제를 추가하여 핵 용해 완충제를 준비한다. 펠릿을 방해하지 않고 상체를 신중하게 데칭하고 리시스 버퍼의 250 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단하십시오.최대 속도로 15초 동안 용액을 소용돌이어 균질화하고 재보습합니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 5 분간 초음파 처리하여 섭씨 영하 80도에 보관하십시오. 냉동 핵 샘플을 해동하고 5%의 구아니딘 완충제의 750 마이크로리터를 추가합니다.그런 다음 섭씨 4도에서 15 분 동안 초음파 처리하십시오. 샘플을 2 밀리리터 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 10분 동안 10, 000회 G로 회전합니다. 동시에, 표면의 오염을 최소화하기 위해 아세토닐레 2밀리리터와 4밀리리터의 물로 헹구어 이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 준비한다.약 200 내지 300 마이크로리터의 약한 양이온 교환 수지를 크로마토그래피 컬럼에 적재하고 수지정착을 한다. 관니딘 버퍼로 수지네 번 씻고 튜브와 컬럼을 얼음 위에 놓습니다. 2 밀리리터 수집 튜브에 컬럼을 넣고 준비된 샘플에서 상체를 수지 침대에 천천히 적재하여 수지침을 방해하지 않습니다.용액이 흐르면서 용액을 열 의 맨 위로 6~8번 로드하여 수지에 최대 바인딩을 허용합니다. 그런 다음 5%의 구아니딘 버퍼 2밀리리터를 적재하여 비히스톤 단백질을 컬럼에서 씻어낸다. 5%의 구아니딘 버퍼1밀리리터로 히스톤 단백질을 엘테우트와 용액을 수집합니다.3킬로달톤 컷오프 스핀 필터를 500마이크로리터의 세척 용매로 청소한 다음, 미리 세척된 스핀 필터를 사용하여 나머지 용액을 탈염합니다. 주요 히스톤 단백질은 LC-MS 기능 맵의 특정 영역에서 관찰되어 실험의 성공을 나타낸다. 이 대표적인 맵은 파선 된 상자에 그대로 전체 길이 히스톤을 보여줍니다.H2B 및 16킬로달튼 H2A 프로테오폼의 LC-MS 기능 맵은 둘 다 고유한 제품 세션 번호에 의해 언급된 것과 유사한 시퀀스를 가진 여러 개의 동형 모로그를 가지고 있음을 보여줍니다. 확장 된 꼬리가없는 H2A 히스톤의 또 다른 그룹을 볼 수 있습니다. H4 히스톤 단백질의 N-말단 아세틸화, 추가 리신 아세틸레이션 및 메티오닌 산화는 여기에 표시된 LC-MS 기능 맵의 질량 차이를 검사하여 관찰될 수 있다.H3 히스톤 단백질, H3.3 및 H3.2에 대해 확인된 두 가지 단백질 서열이 있었습니다. 전자 전달 해리 단편화는 확인된 H3.2 프로테오폼의 단편화 스펙트럼을 생성하는 데 사용되었다. 전구체 이온과 이전 및 다음 Ms1 스펙트럼은 보라색으로 강조 표시된 일치하는 동위원소 봉우리와 함께 여기에 표시됩니다.번역 후 수정은 시퀀스 커버리지 맵을 사용하여 지역화할 수 있습니다. 프로테오폼의 상대적 풍부를 비교함으로써, 샘플 조건에 특정한 잘린 히스톤 프로테오폼의 변화가 발견되었다. H4의 C-말단 잘림은 샘플 중 일부에 대해 3주와 9주에서만 관찰되었다.H3.2의 경우, N단자 잘린 프로테오폼은 일반적으로 10주에 더 풍부했다. 반면 C-단말이 H3.2를 잘린 것을 앞세이 시점에서 볼 수 있었다. H4 C-단말 잘린 프로테오폼은 RTx430보다 BTx642에서 훨씬 더 풍부했습니다.이 프로토콜을 시도할 때, 상수와 펠릿의 색상에 주의를 기울이십시오. 색상 변경은 엽록소의 연삭 또는 리시스에서 잠재적인 문제를 식별하는 데 도움이 됩니다. 우리는 사탕 수잎에서 그의 음색 격리에 대한이 강력한 프로토콜이 다른 유사한 식물에 대한 후생 유전학 연구를 가능하게 할 수 있기를 바랍니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

생물 시료의 대사 프로파일 링에 대한 쉬스 모세관 전기 영동 - 질량 분석

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

연구

생화학

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

시간 해결 전기 분무 이온화 수소 - 중수소 교환 질량 분석 단백질 구조와 역학 연구를위한

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

블루 기본 페이지와 단백질 상관 관계 프로파일 링에 의한 선호도 정제 단백질 복합체 해결

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

양적 질량 분광법 분석을위한 지질 물방울 절연

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

질량 분석 기반 식별 RNA 바인딩 영역에 대 한 샘플 준비

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

깊은 프로테옴 Isobaric 라벨, 광범위 한 액체 크로마토그래피, 질량 분석 및 소프트웨어 기반 정량화 하 여 프로 파일링

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

잎 스프레이 질량 분석: 식물 조직에서 대사를 직접 평가 하는 급속 한 대기 이온화 기술

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

안지오텐신 II에 의해 설명 니트로 펩티드 프로파일링 및 식별

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

프로브 전기 분무 이온화 질량 분광법을 위한 샘플 준비

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

대규모 핵 상호 작용 프로파일링을 위한 라벨 없는 면역 침전 질량 분광 워크플로우

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...