Name: isolation of histone from sorghum leaf tissue for top down mass spectrometry profiling of potential epigenetic markers
Uploaded: 2021-03-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Histone from Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profiling of Potential Epigenetic Markers at JoVE.com

Vi takker Ronald Moore og Thomas Fillmore for å ha hjulpet til med massespektrometrieksperimenter, og Matthew Monroe for datadeponering. Denne forskningen ble finansiert av tilskudd fra US Department of Energy (DOE) Biological and Environmental Research gjennom Epigenetic Control of Drought Response i Sorghum (EPICON) prosjektet under prisnummer DE-SC0014081, fra det amerikanske landbruksdepartementet (USDA; CRIS 2030-21430-008-00D), og gjennom Joint BioEnergy Institute (JBEI), et anlegg sponset av DOE (Contract DE-AC02-05CH11231) mellom Lawrence Berkeley National Laboratory og DOE. Forskningen ble utført ved hjelp av Environmental Molecular Sciences Laboratory (EMSL) (grid.436923.9), en DOE Office of Science User Facility sponset av Office of Biological and Environmental Research.

1. Klargjøring av sorghum bladmateriale
MERK: Sorghum plantene ble dyrket i jord i feltet i Parlier, CA.
<ol><li>Samle sorghum blader fra planter i 50 ml sentrifuge rør og umiddelbart fryse røret i flytende nitrogen. Samle bladvev ved å rive av den tredje og fjerde fullt dukket blad fra den primære tiller. Merk: Du finner flere detaljer om felttilstand, utvalgsvekst og samling i den publiserte rapporten18.</li>
	<li>Grind blader med flytende nitrogen og umidde...

<ol>
	<li>Farooq, M., Wahid, A., Kobayashi, N., Fujita, D., Basra, S. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+drought+stress:+Effects,+mechanisms+and+management.">Plant drought stress: Effects, mechanisms and management.</a> Agronomy for Sustainable Development. , 153-188 (2009).</li><li>Dai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drought+under+global+warming:+a+review.">Drought under global warming: a review.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Climate Change. 2 (1), 45-65 (2011).</li><li>Rooney, W. L., Blumenthal, J., Bean, B., Mullet, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+sorghum+as+a+dedicated+bioenergy+feedstock.">Designing sorghum as a dedicated bioenergy feedstock.</a> Biofuels, Bioproducts and Biorefining. 1 (2), 147-157 (2007).</li><li>Mullet, J. E., Klein, R. R., Klein, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorghum+bicolor+-+an+important+species+for+comparative+grass+genomics+and+a+source+of+beneficial+genes+for+agriculture.">Sorghum bicolor - an important species for comparative grass genomics and a source of beneficial genes for agriculture.</a> Current Opinion in Plant Biology. 5 (2), 118-121 (2002).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drought+delays+development+of+the+sorghum+root+microbiome+and+enriches+for+monoderm+bacteria.">Drought delays development of the sorghum root microbiome and enriches for monoderm bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (18), 4284-4293 (2018).</li><li>Gao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strong+succession+in+arbuscular+mycorrhizal+fungal+communities.">Strong succession in arbuscular mycorrhizal fungal communities.</a> ISME Journal. 13 (1), 214-226 (2019).</li><li>Gao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+community+assembly+in+drought-stressed+sorghum+shows+stochasticity,+selection,+and+universal+ecological+dynamics.">Fungal community assembly in drought-stressed sorghum shows stochasticity, selection, and universal ecological dynamics.</a> Nature Communications. 11 (1), (2020).</li><li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications.">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).</li><li>Yuan, L., Liu, X., Luo, M., Yang, S., Wu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+histone+modifications+in+plant+abiotic+stress+responses.">Involvement of histone modifications in plant abiotic stress responses.</a> Journal of Integrative Plant Biology. 55 (10), 892-901 (2013).</li><li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq:+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology.">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nature Reviews. Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).</li><li>Huang, H., Lin, S., Garcia, B. A., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomic+analysis+of+histone+modifications.">Quantitative proteomic analysis of histone modifications.</a> Chemical Reviews. 115 (6), 2376-2418 (2015).</li><li>Moradian, A., Kalli, A., Sweredoski, M. J., Hess, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+top-down,+middle-down,+and+bottom-up+mass+spectrometry+approaches+for+characterization+of+histone+variants+and+their+post-translational+modifications.">The top-down, middle-down, and bottom-up mass spectrometry approaches for characterization of histone variants and their post-translational modifications.</a> Proteomics. 14 (4-5), 489-497 (2014).</li><li>Sidoli, S., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+individual+histone+posttranslational+modifications+and+their+combinatorial+patterns+by+mass+spectrometry-based+proteomics+strategies.">Characterization of individual histone posttranslational modifications and their combinatorial patterns by mass spectrometry-based proteomics strategies.</a> Methods in Molecular Biology. 1528, 121-148 (2017).</li><li>Maile, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+quantification+of+histone+post-translational+modifications+by+a+hybrid+chemical+labeling+method.">Mass spectrometric quantification of histone post-translational modifications by a hybrid chemical labeling method.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 14 (4), 1148-1158 (2015).</li><li>Dang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+pilot+project+of+the+consortium+for+top-down+proteomics:+a+status+report.">The first pilot project of the consortium for top-down proteomics: a status report.</a> Proteomics. 14 (10), 1130-1140 (2014).</li><li>Schaffer, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantification+of+proteoforms+by+mass+spectrometry.">Identification and quantification of proteoforms by mass spectrometry.</a> Proteomics. 19 (10), 1800361 (2019).</li><li>Cupp-Sutton, K. A., Wu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+quantitative+top-down+proteomics.">High-throughput quantitative top-down proteomics.</a> Molecular Omics. , (2020).</li><li>Varoquaux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+field-droughted+sorghum+from+seedling+to+maturity+reveals+biotic+and+metabolic+responses.">Transcriptomic analysis of field-droughted sorghum from seedling to maturity reveals biotic and metabolic responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (52), 27124 (2019).</li><li>Gordon, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+vanadate+as+protein-phosphotyrosine+phosphatase+inhibitor.">Use of vanadate as protein-phosphotyrosine phosphatase inhibitor.</a> Methods in Enzymology. 201, 477-482 (1991).</li><li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+changes+in+histone+post-translational+modifications+by+top-down+mass+spectrometry.">Profiling changes in histone post-translational modifications by top-down mass spectrometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1507, 153-168 (2017).</li><li>Chambers, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cross-platform+toolkit+for+mass+spectrometry+and+proteomics.">A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics.</a> Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).</li><li>Kou, Q., Xun, L., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopPIC:+a+software+tool+for+top-down+mass+spectrometry-based+proteoform+identification+and+characterization.">TopPIC: a software tool for top-down mass spectrometry-based proteoform identification and characterization.</a> Bioinformatics (Ocford, England). 32 (22), (2016).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Informed-Proteomics:+open-source+software+package+for+top-down+proteomics.">Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics.</a> Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).</li><li>LeDuc, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C-Score:+a+bayesian+framework+to+sharply+improve+proteoform+scoring+in+high-throughput+top+down+proteomics.">The C-Score: a bayesian framework to sharply improve proteoform scoring in high-throughput top down proteomics.</a> Journal of Proteome Research. 13 (7), 3231-3240 (2014).</li><li>Fornelli, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+top-down+analysis+of+the+human+proteome+using+a+benchtop+quadrupole-orbitrap+mass+spectrometer.">Advancing top-down analysis of the human proteome using a benchtop quadrupole-orbitrap mass spectrometer.</a> Journal of Proteome Research. 16 (2), 609-618 (2017).</li><li>Sun, R. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pTop+1.0:+A+high-accuracy+and+high-efficiency+search+engine+for+intact+protein+identification.">pTop 1.0: A high-accuracy and high-efficiency search engine for intact protein identification.</a> Analytical Chemistry. 88 (6), 3082-3090 (2016).</li><li>Xiao, K., Yu, F., Tian, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+protein+identification+using+isotopic+envelope+fingerprinting.">Top-down protein identification using isotopic envelope fingerprinting.</a> Journal of Proteomics. 152, 41-47 (2017).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MASH+Suite+Pro:+A+comprehensive+software+tool+for+top-down+proteomics.">MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics: MCP. 15 (2), 703-714 (2016).</li><li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+mass+spectrometry+of+histone+modifications+in+sorghum+reveals+potential+epigenetic+markers+for+drought+acclimation.">Top-down mass spectrometry of histone modifications in sorghum reveals potential epigenetic markers for drought acclimation.</a> Methods. , (2019).</li><li>Garcia, B. A., Pesavento, J. J., Mizzen, C. A., Kelleher, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pervasive+combinatorial+modification+of+histone+H3+in+human+cells.">Pervasive combinatorial modification of histone H3 in human cells.</a> Nature Methods. 4 (6), 487-489 (2007).</li><li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unabridged+analysis+of+human+histone+H3+by+differential+top-down+mass+spectrometry+reveals+hypermethylated+proteoforms+from+MMSET/NSD2+overexpression.">Unabridged analysis of human histone H3 by differential top-down mass spectrometry reveals hypermethylated proteoforms from MMSET/NSD2 overexpression.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics: MCP. 15 (3), 776-790 (2016).</li><li>Garcia, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+derivatization+of+histones+for+facilitated+analysis+by+mass+spectrometry.">Chemical derivatization of histones for facilitated analysis by mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 2 (4), 933-938 (2007).</li><li>Holt, M. V., Wang, T., Young, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-pot+quantitative+top-+and+middle-down+analysis+of+GluC-digested+histone+H4.">One-pot quantitative top- and middle-down analysis of GluC-digested histone H4.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (12), 2514-2525 (2019).</li><li>Tian, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+top-down+characterization+of+histone+post-translational+modifications.">Enhanced top-down characterization of histone post-translational modifications.</a> Genome Biology. 13 (10), (2012).</li><li>Wang, Z., Ma, H., Smith, K., Wu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+separation+using+high-pH+and+low-pH+reversed+phase+liquid+chromatography+for+top-down+proteomics.">Two-dimensional separation using high-pH and low-pH reversed phase liquid chromatography for top-down proteomics.</a> International Journal of Mass Spectrometry. 427, 43-51 (2018).</li><li>Gargano, A. F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+separation+capacity+of+intact+histone+proteoforms+chromatography+coupling+online+weak+cation+exchange-HILIC+to+reversed+phase+LC+UVPD-HRMS.">Increasing the separation capacity of intact histone proteoforms chromatography coupling online weak cation exchange-HILIC to reversed phase LC UVPD-HRMS.</a> Journal of Proteome Research. 17 (11), 3791-3800 (2018).</li></ol>

Den presenterte protokollen beskriver hvordan man trekker ut histoner fra sorghumbladprøver (eller mer generelt planteblad). Gjennomsnittlig histoneutbytte forventes å være 2–20 μg per 4–5 g sorghum bladmateriale. Materialene er tilstrekkelig rene for nedstrøms histoneanalyse av LC-MS (for det meste histoner med ~ 20% ribosomal proteinforurensning). Lavere avkastning kan oppnås på grunn av prøvevariasjoner, eller potensielle feilhåndtering/feil i hele protokollen. Opprettholde integriteten til kjernene før ...

Den økende alvorlighetsgraden og hyppigheten av tørke forventes å påvirke produktiviteten avkornavlinger 1,2. Sorghum er en kornmat og energiavling kjent for sin eksepsjonelle evne til å tåle vannbegrensendeforhold 3,4. Vi forfølger mekanistisk forståelse av samspillet mellom tørkestress, planteutvikling og epigenetikk av sorghum [Sorghum bicolor (L.) Moench] planter. Vårt tidligere arbeid har vist sterke forbindelser mellom plante- og jordsonosfæremikrobiom i tørkeakklimatisering og respons påmolekylært nivå 5,6,7. Denne forskningen vil bane vei for å utnytte epigenetisk teknikk i å tilpasse avlinger til fremtidige klimascenarier. Som en del av arbeidet med å forstå epigenetikk, tar vi sikte på å studere proteinmarkører som påvirker genuttrykket i planteorganismen.
Histoner tilhører en svært bevart familie av proteiner i eukaryoter som pakker DNA i nukleosomer som grunnleggende enheter av kromatin. Post-translational modifikasjoner (PTMs) av histoner er dynamisk regulert for å kontrollere kromatin struktur og påvirke genuttrykk. Som andre epigenetiske faktorer, inkludert DNA-metylering, spiller histone-PTMer viktige roller i mange biologiskeprosesser 8,9. Antistoffbaserte analyser som vestlige flekker har blitt mye brukt til å identifisere og kvantifisere histone PTMer. I tillegg kan samspillet mellom histone-PTMer og DNA effektivt undersøkes av Kromatinimmunoprecipitation – sekvensering (ChIP-seq)10. I ChIP-seq er kromatin med spesifikk målrettet histone PTM beriket av antistoffer mot den spesifikke PTM. Deretter kan DNA-fragmentene frigjøres fra beriket kromatin og sekvensert. Regioner av gener som samhandler med målrettet histone PTM avsløres. Men alle disse eksperimentene er sterkt avhengige av antistoffer av høy kvalitet. For noen histonevarianter/homologer eller kombinasjoner av PTMer kan utvikling av robuste antistoffer være ekstremt utfordrende (spesielt for flere PTMer). I tillegg kan antistoffer bare utvikles hvis den målrettede histone PTM er kjent. 11 Derfor er det nødvendig med alternative metoder for ikke-målrettede, globale profilering av histone-PTMer.
Massespektrometri (MS) er en komplementær metode for å karakterisere histone-PTMer, inkludert ukjente PTMer som antistoffer ikke er tilgjengeligefor 11,12. Den veletablerte "bottom-up" MS arbeidsflyten bruker proteaser til å fordøye proteiner i små peptider før flytende kromatografi (LC) separasjon og MS-deteksjon. Fordi histoner har et stort antall grunnleggende rester (lysin og arginin), trypsin fordøyelsen (protease spesifikk for lysin og arginin) i standard nedenfra og opp arbeidsflyt kutter proteinene i svært korte peptider. De korte peptidene er teknisk vanskelige å analysere av standard LC-MS, og bevarer ikke informasjonen om tilkobling og stoichiometry av flere PTMer. Bruk av andre enzymer eller kjemisk merking for å blokkere lysiner genererer lengre peptider som er mer egnet for karakterisering av histone PTMs13,14.
Alternativt kan fordøyelsestrinnet utelates helt. I denne "top-down" tilnærming, intakt protein ioner er introdusert i MS ved elektrospray ionisering (ESI) etter online LC separasjon, noe som gir ioner av intakt histone proteoformer. I tillegg kan ioner (det vil si proteoformer) av interesse isoleres og fragmenteres i massespektrometeret for å gi sekvensionene for identifikasjon og PTM-lokalisering. Derfor har top-down MS fordelen til å bevare proteoform-nivå informasjon og fange tilkobling av flere PTMer og terminal avkortinger på samme proteoform15,16. Top-down eksperimenter kan også gi kvantitativ informasjon og gi innsikt av biomarkører på intakt protein nivå17. Her beskriver vi en protokoll for å trekke ut histone fra sorghumblad og analysere de intakte histonene ved å topp-ned LC-MS.
Eksempeldataene som vises i figur 1 og figur 2 er fra sorghumblad samlet inn i uke 2 etter planting. Selv om variasjon av utbytte forventes, er denne protokollen generelt agnostisk til bestemte utvalgsforhold. Den samme protokollen har blitt brukt til sorghum plantebladvev samlet fra 2, 3, 5, 8, 9 og 10 uker etter planting.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A955-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, 500mM Solution, pH 8.0</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>324504-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine Hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G3272-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate, dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3786-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail, cOmplete tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5892791001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium butyrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>303410-5G</td>
			<td>Used for histone deacetylase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7020-100G</td>
			<td>Used for phosphatase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Orthovanadate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>450243-10G</td>
			<td>Used for phosphatase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7903-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP153-500 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weak cation exchange resin, mesh 100-200 analytical (BioRex70)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>142-5842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatography column (Bio-Spin)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>732-6008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh 100 filter cloth</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>NY1H09000</td>
			<td>This is part of the Sigma kit (catalog # CELLYTPN1) for plant nuclei extraction. Similar filters with the same mesh size can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips (P20, P200, P1000)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube, 50mL/15mL, Centrifuge, Conical</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>28-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube, Microcentrifuge, 1.5/2 mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-912-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers (50mL &#8211; 2L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge with cooling</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-690-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinging-bucket centrifuge with cooling</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-728-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath Sonicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-336-120</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of histone from sorghum leaf tissue for top down mass spectrometry profiling of potential epigenetic markers

Histoner tilhører en familie av høyt bevarte proteiner i eukaryoter. De pakker DNA i nukleosomer som funksjonelle enheter av kromatin. Post-translational modifikasjoner (PTMs) av histoner, som er svært dynamiske og kan legges til eller fjernes av enzymer, spille kritiske roller i å regulere genuttrykk. I planter er epigenetiske faktorer, inkludert histone-PTMer, relatert til deres adaptive respons på miljøet. Å forstå molekylære mekanismer for epigenetisk kontroll kan gi enestående muligheter for innovative bioingeniørløsninger. Her beskriver vi en protokoll for å isolere kjernene og rense histoner fra sorghum bladvev. De ekstraherte histonene kan analyseres i sine intakte former ved topp-ned massespektrometri (MS) kombinert med online omvendt fase (RP) flytende kromatografi (LC). Kombinasjoner og stoichiometry av flere PTMer på samme histone proteoform kan lett identifiseres. I tillegg kan histone hale klipping oppdages ved hjelp av den øverste ned LC-MS arbeidsflyten, og dermed gir den globale PTM-profilen til kjernehtoner (H4, H2A, H2B, H3). Vi har brukt denne protokollen tidligere for å profilere histone-PTMer fra sorghum bladvev samlet inn fra en storstilt feltstudie, med sikte på å identifisere epigenetiske markører for tørkemotstand. Protokollen kan potensielt tilpasses og optimaliseres for kromatin immunoprecipitation-sekvensering (ChIP-seq), eller for å studere histone PTMs i lignende planter.

Etter protokollen kan histonene trekkes ut og identifiseres ved hjelp av LC-MS-analysen. Rådata og bearbeidede resultater er tilgjengelige på MassIVE (https://massive.ucsd.edu/) via tiltredelse: MSV000085770. Basert på TopPIC-resultatene fra det representative utvalget (også tilgjengelig fra MassIVE), identifiserte vi 303 histoneproteoformer (106 H2A, 72 H2B, 103 H3 og 22 H4 proteoformer). Samtidige ribosomale proteoformer har også blitt oppdaget, vanligvis eluting tidlig i LC. De består vanligvis av ~ 20% av de id...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Histone from Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profiling of Potential Epigenetic Markers at JoVE.com

Isolation of Histone from Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profiling of Potential Epigenetic Markers

Protokollen er utviklet for effektivt å trekke ut intakte histoner fra sorghumbladmaterialer for profilering av histone post-translational modifikasjoner som kan tjene som potensielle epigenetiske markører for å hjelpe engineering tørkebestandige avlinger.

Isolering av Histone fra Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profilering av potensielle epigenetiske markører

Histones belong to a family of highly conserved proteins in eukaryotes. They pack DNA into nucleosomes as functional units of chromatin. ...

Vår protokoll avdekker epigenetiske markører for sorghum planteutvikling og tørkemotstand. En slik molekylær forståelse vil bidra til å utvikle bedre løsninger for å tilpasse avlinger for ekstreme klimaer i fremtiden. Denne protokollen genererer høy renhet histoner fra sorghum bladvev egnet for un-målrettet profilering av post-translasjonelle modifikasjoner av massespektrometri.Demonstrere prosedyren vil være Shadan Abdali og Tanya Winkler, post-bachelor forskningsmedarbeidere fra EMSL. Til å begynne med, slip noen sorghume blader med flytende nitrogen og lagre dem i et 50 milliliter sentrifugerør ved minus 80 grader Celsius. Bruk omtrent fire gram bladpulver for histonanalyse av hver prøve.Forbered ekstraksjonsbuffere 1, 2A og 2B som beskrevet i tekstmanuskriptet, og legg til en proteasehemmertablett til ekstraksjonsbuffer en for å lage en endelig konsentrasjon på 0,2X. Tilsett deretter 20 milliliter av den tilberedte ekstraksjonsbufferen en til det jordede bladpulveret og bland forsiktig eller vortex i 10 minutter. Bruk mesh 100, skyll det filtrerte materialet to ganger med to milliliter ekstraksjonsbuffer en hver gang.Deretter sentrifuger filtratet ved 3000 ganger G i 10 minutter ved fire grader Celsius i en svingende bøtterotor for å pellet cellerester og store subcellulære organeller. Til sammen forbereder du ekstraksjonsbuffer 2A ved å legge proteasehemmer til en endelig konsentrasjon på 0,4X. Kast det overnaturlige uten å forstyrre pelleten.Deretter resuspend pellet i fem milliliter av forberedt ekstraksjon buffer 2A. Inkuber den på is i 10 minutter med skånsom blanding. Sentrifuger oppløsningen ved 2, 100 ganger G i 15 minutter ved fire grader Celsius i en svingende bøtterotor for å pellet rusk og kjerner.Dekanter supernatanten forsiktig uten å forstyrre pelleten. Forbered ekstraksjonsbuffer 2B ved å legge proteasehemmerne til en endelig konsentrasjon på 1X. Tilsett fem milliliter av denne forberedte bufferen til pellet oppnådd etter sentrifugeringen.Sentrifuge ved 2, 100 ganger G i 15 minutter ved fire grader Celsius i den svingende bøtterotoren til pelletrusk og kjerner. Lag kjernerlysbuffer ved å legge til en proteasehemmertablett. Dekanter forsiktig det overnaturante uten å forstyrre pelleten og gjenbruke pelleten i 250 mikroliter av lysisbufferen.Vortex løsningen i 15 sekunder ved maksimal hastighet for å homogenisere den og gjenbruke materialet. Deretter sonikere det i fem minutter ved fire grader Celsius og lagre den på minus 80 grader Celsius. Tin den frosne kjerneprøven og tilsett 750 mikroliter med 5 % guanidinbuffer.Deretter sonikere det i 15 minutter ved fire grader Celsius. Overfør prøven til et to milliliter rør og spinn den til 10 000 ganger G i 10 minutter ved fire grader Celsius. Samtidig forbereder du en ionutvekslingskromatografikolonne ved å skylle den med to milliliter acetonitril og fire milliliter vann for å minimere forurensning på overflaten.Last ca 200 til 300 mikroliter med svak kation utveksling harpiks på kromatografikolonnen og la harpiksen bosette seg. Vask harpiksen fire ganger med guanidinbuffer og legg røret og kolonnen på is. Sett kolonnen på et to milliliter oppsamlingsrør og last supernatanten fra den tilberedte prøven sakte på harpikssengen uten å forstyrre harpiksen.Etter hvert som løsningen strømmer gjennom, laster du eluenten tilbake til toppen av kolonnen seks til åtte ganger for å tillate maksimal binding til harpiksen. Deretter laster du to milliliter med 5% guanidinbuffer for å vaske ikke-histonproteinene av kolonnen. Elute histoneproteinene med en milliliter 5% guanidinbuffer og samle eluent.Rengjør et tre kilodaltont avskjæringsspinnfilter med 500 mikroliter vaskemiddel, og avsalt deretter den gjenværende eluenten ved hjelp av det forhåndsrengjorte spinnfilteret. Store histonproteiner ble observert i bestemte regioner i LC-MS-funksjonskartet som indikerer eksperimentets suksess. Dette representative kartet viser intakte histoner i stiplede bokser.LC-MS-funksjonskartet over H2B og 16 kilodalton H2A-proteoformer viser at begge har flere homologer med lignende sekvenser som nevnt av de unike produktøktnumrene. En annen gruppe H2A histoner uten de utvidede haler kan sees. N-terminal acetylering, ekstra lysin acetyler, og metionin oksidasjoner i H4 histone proteiner kan observeres ved å undersøke masseforskjellene i LC-MS funksjonskartet vist her.Det var to proteinsekvenser identifisert for H3 histoneproteiner, H3.3 og H3.2. Elektronoverføringsdissosiasjonsfragmentering ble brukt til å generere fragmenteringsspekteret til den identifiserte H3.2 proteoformen. Forløperionene og den forrige og neste Ms1-spektraen vises her med sine matchende isotoptopper uthevet i lilla.Endringer etter oversettelsen kan lokaliseres ved hjelp av sekvensdekningskartet. Ved å sammenligne den relative overflod av proteoformene ble det oppdaget endringer av avkortede histoneproteoformer som er spesifikke for prøveforhold. C-terminal avkorting av H4 ble observert bare i uke tre og ni for noen av prøvene.For H3.2 var N-terminal avkortede proteoformer generelt mer rikelig i uke 10. C-terminal avkortet H3.2 ble derimot sett tidligere tidspunkter. H4 C-terminalen avkortet proteoformer var betydelig mer rikelig i BTx642 enn i RTx430.Når du prøver denne protokollen, vær oppmerksom på fargene til det overnaturlige og pellet. Fargeendringen bidrar til å identifisere potensielle problemer i sliping eller lysis av kloroplasten. Vi håper at denne robuste protokollen for histone isolasjon fra sorghum blader vil muliggjøre epigenetisk forskning for andre lignende planter.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Kapillær elektroforese-massespektrometri for Metabolsk profilering av biologiske prøver

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrospray-ionisering Hydrogen-deuterium Veksling massespektrometri for å studere Protein struktur og dynamikk

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Løse affinitetsrenset protein komplekser av Blå Native PAGE og Protein korrelasjon Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Lipid Droplet Isolasjon for Quantitative massespektrometri analyse

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Eksempel forberedelse til masse massespektrometri-baserte identifikasjon av RNA-bindende områder

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Dyp proteom profilering av isobar merking, omfattende flytende Ture, massespektrometri og Software-baserte kvantifisering

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Blad Spray massespektrometri: En rask Ambient ionisering teknikk å vurdere direkte metabolitter fra anlegget vev

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptide profilering og identifisering illustrert av angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Prøve forberedelse til sonde elektrospray ionisering massespektrometri

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Label-fri Immunutfelling masse massespektrometri arbeidsflyt for stor skala kjernefysisk Interactome profilering

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...