Name: isolation of histone from sorghum leaf tissue for top down mass spectrometry profiling of potential epigenetic markers
Uploaded: 2021-03-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Histone from Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profiling of Potential Epigenetic Markers at JoVE.com

Agradecemos a Ronald Moore e Thomas Fillmore por ajudarem em experimentos de espectrometria em massa, e Matthew Monroe pela deposição de dados. Esta pesquisa foi financiada por subsídios do Departamento de Energia dos EUA (DOE) Pesquisa Biológica e Ambiental através do projeto Controle Epigenético da Resposta à Seca em Sorgo (EPICON) sob o número de premiação DE-SC0014081, do Departamento de Agricultura dos EUA (USDA; CRIS 2030-21430-008-00D), e através do Joint BioEnergy Institute (JBEI), uma instalação patrocinada pelo DOE (Contrato DE-AC02-05CH11231) entre o Lawrence Berkeley National Laboratory e o DOE. A pesquisa foi realizada utilizando-se o Laboratório de Ciências Moleculares Ambientais (EMSL) (grid.436923.9), um DoE Office of Science User Facility patrocinado pelo Escritório de Pesquisa Biológica e Ambiental.

1. Preparando material de folha de sorgo
NOTA: As plantas de sorgo foram cultivadas em solo no campo em Parlier, CA.
<ol><li>Colete folhas de sorgo das plantas em tubos de centrífugas de 50 mL e congele imediatamente o tubo em nitrogênio líquido. Coletar tecido de folha arrancando a terceira e quarta folha totalmente emergida do leme primário. NOTA: Mais detalhes sobre condição de campo, crescimento amostral e coleta podem ser encontrados no relatório publicado18<...

<ol>
	<li>Farooq, M., Wahid, A., Kobayashi, N., Fujita, D., Basra, S. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+drought+stress:+Effects,+mechanisms+and+management.">Plant drought stress: Effects, mechanisms and management.</a> Agronomy for Sustainable Development. , 153-188 (2009).</li><li>Dai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drought+under+global+warming:+a+review.">Drought under global warming: a review.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Climate Change. 2 (1), 45-65 (2011).</li><li>Rooney, W. L., Blumenthal, J., Bean, B., Mullet, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+sorghum+as+a+dedicated+bioenergy+feedstock.">Designing sorghum as a dedicated bioenergy feedstock.</a> Biofuels, Bioproducts and Biorefining. 1 (2), 147-157 (2007).</li><li>Mullet, J. E., Klein, R. R., Klein, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorghum+bicolor+-+an+important+species+for+comparative+grass+genomics+and+a+source+of+beneficial+genes+for+agriculture.">Sorghum bicolor - an important species for comparative grass genomics and a source of beneficial genes for agriculture.</a> Current Opinion in Plant Biology. 5 (2), 118-121 (2002).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drought+delays+development+of+the+sorghum+root+microbiome+and+enriches+for+monoderm+bacteria.">Drought delays development of the sorghum root microbiome and enriches for monoderm bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (18), 4284-4293 (2018).</li><li>Gao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strong+succession+in+arbuscular+mycorrhizal+fungal+communities.">Strong succession in arbuscular mycorrhizal fungal communities.</a> ISME Journal. 13 (1), 214-226 (2019).</li><li>Gao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+community+assembly+in+drought-stressed+sorghum+shows+stochasticity,+selection,+and+universal+ecological+dynamics.">Fungal community assembly in drought-stressed sorghum shows stochasticity, selection, and universal ecological dynamics.</a> Nature Communications. 11 (1), (2020).</li><li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications.">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).</li><li>Yuan, L., Liu, X., Luo, M., Yang, S., Wu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+histone+modifications+in+plant+abiotic+stress+responses.">Involvement of histone modifications in plant abiotic stress responses.</a> Journal of Integrative Plant Biology. 55 (10), 892-901 (2013).</li><li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq:+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology.">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nature Reviews. Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).</li><li>Huang, H., Lin, S., Garcia, B. A., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomic+analysis+of+histone+modifications.">Quantitative proteomic analysis of histone modifications.</a> Chemical Reviews. 115 (6), 2376-2418 (2015).</li><li>Moradian, A., Kalli, A., Sweredoski, M. J., Hess, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+top-down,+middle-down,+and+bottom-up+mass+spectrometry+approaches+for+characterization+of+histone+variants+and+their+post-translational+modifications.">The top-down, middle-down, and bottom-up mass spectrometry approaches for characterization of histone variants and their post-translational modifications.</a> Proteomics. 14 (4-5), 489-497 (2014).</li><li>Sidoli, S., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+individual+histone+posttranslational+modifications+and+their+combinatorial+patterns+by+mass+spectrometry-based+proteomics+strategies.">Characterization of individual histone posttranslational modifications and their combinatorial patterns by mass spectrometry-based proteomics strategies.</a> Methods in Molecular Biology. 1528, 121-148 (2017).</li><li>Maile, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+quantification+of+histone+post-translational+modifications+by+a+hybrid+chemical+labeling+method.">Mass spectrometric quantification of histone post-translational modifications by a hybrid chemical labeling method.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 14 (4), 1148-1158 (2015).</li><li>Dang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+pilot+project+of+the+consortium+for+top-down+proteomics:+a+status+report.">The first pilot project of the consortium for top-down proteomics: a status report.</a> Proteomics. 14 (10), 1130-1140 (2014).</li><li>Schaffer, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantification+of+proteoforms+by+mass+spectrometry.">Identification and quantification of proteoforms by mass spectrometry.</a> Proteomics. 19 (10), 1800361 (2019).</li><li>Cupp-Sutton, K. A., Wu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+quantitative+top-down+proteomics.">High-throughput quantitative top-down proteomics.</a> Molecular Omics. , (2020).</li><li>Varoquaux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+field-droughted+sorghum+from+seedling+to+maturity+reveals+biotic+and+metabolic+responses.">Transcriptomic analysis of field-droughted sorghum from seedling to maturity reveals biotic and metabolic responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (52), 27124 (2019).</li><li>Gordon, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+vanadate+as+protein-phosphotyrosine+phosphatase+inhibitor.">Use of vanadate as protein-phosphotyrosine phosphatase inhibitor.</a> Methods in Enzymology. 201, 477-482 (1991).</li><li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+changes+in+histone+post-translational+modifications+by+top-down+mass+spectrometry.">Profiling changes in histone post-translational modifications by top-down mass spectrometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1507, 153-168 (2017).</li><li>Chambers, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cross-platform+toolkit+for+mass+spectrometry+and+proteomics.">A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics.</a> Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).</li><li>Kou, Q., Xun, L., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopPIC:+a+software+tool+for+top-down+mass+spectrometry-based+proteoform+identification+and+characterization.">TopPIC: a software tool for top-down mass spectrometry-based proteoform identification and characterization.</a> Bioinformatics (Ocford, England). 32 (22), (2016).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Informed-Proteomics:+open-source+software+package+for+top-down+proteomics.">Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics.</a> Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).</li><li>LeDuc, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C-Score:+a+bayesian+framework+to+sharply+improve+proteoform+scoring+in+high-throughput+top+down+proteomics.">The C-Score: a bayesian framework to sharply improve proteoform scoring in high-throughput top down proteomics.</a> Journal of Proteome Research. 13 (7), 3231-3240 (2014).</li><li>Fornelli, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+top-down+analysis+of+the+human+proteome+using+a+benchtop+quadrupole-orbitrap+mass+spectrometer.">Advancing top-down analysis of the human proteome using a benchtop quadrupole-orbitrap mass spectrometer.</a> Journal of Proteome Research. 16 (2), 609-618 (2017).</li><li>Sun, R. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pTop+1.0:+A+high-accuracy+and+high-efficiency+search+engine+for+intact+protein+identification.">pTop 1.0: A high-accuracy and high-efficiency search engine for intact protein identification.</a> Analytical Chemistry. 88 (6), 3082-3090 (2016).</li><li>Xiao, K., Yu, F., Tian, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+protein+identification+using+isotopic+envelope+fingerprinting.">Top-down protein identification using isotopic envelope fingerprinting.</a> Journal of Proteomics. 152, 41-47 (2017).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MASH+Suite+Pro:+A+comprehensive+software+tool+for+top-down+proteomics.">MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics: MCP. 15 (2), 703-714 (2016).</li><li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+mass+spectrometry+of+histone+modifications+in+sorghum+reveals+potential+epigenetic+markers+for+drought+acclimation.">Top-down mass spectrometry of histone modifications in sorghum reveals potential epigenetic markers for drought acclimation.</a> Methods. , (2019).</li><li>Garcia, B. A., Pesavento, J. J., Mizzen, C. A., Kelleher, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pervasive+combinatorial+modification+of+histone+H3+in+human+cells.">Pervasive combinatorial modification of histone H3 in human cells.</a> Nature Methods. 4 (6), 487-489 (2007).</li><li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unabridged+analysis+of+human+histone+H3+by+differential+top-down+mass+spectrometry+reveals+hypermethylated+proteoforms+from+MMSET/NSD2+overexpression.">Unabridged analysis of human histone H3 by differential top-down mass spectrometry reveals hypermethylated proteoforms from MMSET/NSD2 overexpression.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics: MCP. 15 (3), 776-790 (2016).</li><li>Garcia, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+derivatization+of+histones+for+facilitated+analysis+by+mass+spectrometry.">Chemical derivatization of histones for facilitated analysis by mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 2 (4), 933-938 (2007).</li><li>Holt, M. V., Wang, T., Young, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-pot+quantitative+top-+and+middle-down+analysis+of+GluC-digested+histone+H4.">One-pot quantitative top- and middle-down analysis of GluC-digested histone H4.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (12), 2514-2525 (2019).</li><li>Tian, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+top-down+characterization+of+histone+post-translational+modifications.">Enhanced top-down characterization of histone post-translational modifications.</a> Genome Biology. 13 (10), (2012).</li><li>Wang, Z., Ma, H., Smith, K., Wu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+separation+using+high-pH+and+low-pH+reversed+phase+liquid+chromatography+for+top-down+proteomics.">Two-dimensional separation using high-pH and low-pH reversed phase liquid chromatography for top-down proteomics.</a> International Journal of Mass Spectrometry. 427, 43-51 (2018).</li><li>Gargano, A. F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+separation+capacity+of+intact+histone+proteoforms+chromatography+coupling+online+weak+cation+exchange-HILIC+to+reversed+phase+LC+UVPD-HRMS.">Increasing the separation capacity of intact histone proteoforms chromatography coupling online weak cation exchange-HILIC to reversed phase LC UVPD-HRMS.</a> Journal of Proteome Research. 17 (11), 3791-3800 (2018).</li></ol>

O protocolo apresentado descreve como extrair histonas de amostras de folhas de sorgo (ou mais geralmente folha de plantas). Espera-se que o rendimento médio da histona seja de 2 a 20 μg por material de folha de sorgo de 4 a 5 g. Os materiais são suficientemente puros para a análise de histona a jusante por LC-MS (principalmente histones com ~20% de contaminação por proteína ribossômica). O rendimento mais baixo pode ser obtido devido a variações amostrais ou possíveis falhas/falhas ao longo do protocolo. Mant...

Espera-se que a gravidade e a frequência crescentes da seca afetem a produtividade das culturas cereais1,2. O sorgo é uma cultura de alimentos e energia de cereais conhecida por sua excepcional capacidade de suportar condições limitantes da água3,4. Estamos buscando a compreensão mecanicista da interação entre o estresse da seca, o desenvolvimento das plantas e a epigenética das plantas desorgo bicolor (L.) Moench). Nosso trabalho anterior demonstrou fortes conexões entre microbioma vegetal e rizosfera na aclimatação da seca e respostas no nível molecular5,6,7. Esta pesquisa abrirá caminho para a utilização da engenharia epigenética na adaptação das culturas aos cenários climáticos futuros. Como parte dos esforços na compreensão da epigenética, pretendemos estudar marcadores proteicos que impactam a expressão genética dentro do organismo vegetal.
Histones pertencem a uma família altamente conservada de proteínas em eucariotes que embalam DNA em nucleosósmos como unidades fundamentais de cromatina. Modificações pós-translacionais (PTMs) de histones são dinamicamente reguladas para controlar a estrutura da cromatina e influenciar a expressão genética. Como outros fatores epigenéticos, incluindo a metilação do DNA, os PTMs histonas desempenham papéis importantes em muitos processos biológicos8,9. Ensaios baseados em anticorpos, como manchas ocidentais, têm sido amplamente usados para identificar e quantificar PTMs histonas. Além disso, a interação de PTMs histonas e DNA pode ser efetivamente sondada pela imunoprecipitação chromatina – sequenciamento (ChIP-seq)10. Em ChIP-seq, cromatina com histone PTM específico é enriquecida por anticorpos contra esse PTM específico. Então, os fragmentos de DNA podem ser liberados da cromatina enriquecida e sequenciados. Regiões de genes que interagem com o ptm histona-alvo são reveladas. No entanto, todos esses experimentos dependem fortemente de anticorpos de alta qualidade. Para algumas variantes/homólogos de histona ou combinações de PTMs, o desenvolvimento de anticorpos robustos pode ser extremamente desafiador (especialmente para vários PTMs). Além disso, anticorpos só podem ser desenvolvidos se o PTM de histona-alvo for conhecido. 11 Portanto, são necessários métodos alternativos para perfis não-alvos globais de PTMs histonas.
A espectrometria de massa (MS) é um método complementar para caracterizar PTMs histonas, incluindo PTMs desconhecidos para os quais os anticorpos não estão disponíveis11,12. O bem estabelecido fluxo de trabalho "bottom-up" usa proteases para digerir proteínas em pequenos peptídeos antes da separação da cromatografia líquida (LC) e da detecção de ESM. Como as histonas têm um grande número de resíduos básicos (lise e arginina), a digestão de trippsina (protease específica para lysina e arginina) no fluxo de trabalho padrão de baixo para cima corta as proteínas em peptídeos muito curtos. Os peptídeos curtos são tecnicamente difíceis de analisar pela LC-MS padrão, e não preservam as informações sobre a conectividade e estequiometria de múltiplos PTMs. O uso de outras enzimas ou rotulagem química para bloquear a lises gera peptídeos mais longos que são mais adequados para caracterização de PTMs histone13,14.
Alternativamente, o passo de digestão pode ser completamente omitido. Nesta abordagem "de cima para baixo", íons proteicos intactos são introduzidos no MS por ionização eletrospray (ESI) após a separação on-line da LC, produzindo íons dos proteoformes de histona intactos. Além disso, íons (ou seja, proteoforms) de interesse podem ser isolados e fragmentados no espectrômetro de massa para produzir os íons sequenciais para identificação e localização de PTM. Assim, a MS de cima para baixo tem a vantagem de preservar as informações de nível proteoforme capturar a conectividade de múltiplos PTMs e truncações terminais na mesma proteoforme15,16. Experimentos de cima para baixo também podem fornecer informações quantitativas e oferecer insights de biomarcadores no nível de proteína intactanível 17. Aqui, descrevemos um protocolo para extrair histona da folha de sorgo e analisar as histonas intactas por LC-MS de cima para baixo.
Os dados de exemplo mostrados na Figura 1 e Figura 2 são da folha de sorgo coletada na semana 2 após o plantio. Embora a variação de rendimento seja esperada, este protocolo é geralmente agnóstico para condições amostrais específicas. O mesmo protocolo tem sido usado com sucesso para tecido de folha de plantas de sorgo coletados de 2, 3, 5, 8, 9 e 10 semanas após o plantio.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A955-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, 500mM Solution, pH 8.0</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>324504-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine Hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G3272-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate, dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3786-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail, cOmplete tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5892791001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium butyrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>303410-5G</td>
			<td>Used for histone deacetylase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7020-100G</td>
			<td>Used for phosphatase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Orthovanadate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>450243-10G</td>
			<td>Used for phosphatase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7903-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP153-500 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weak cation exchange resin, mesh 100-200 analytical (BioRex70)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>142-5842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatography column (Bio-Spin)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>732-6008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh 100 filter cloth</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>NY1H09000</td>
			<td>This is part of the Sigma kit (catalog # CELLYTPN1) for plant nuclei extraction. Similar filters with the same mesh size can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips (P20, P200, P1000)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube, 50mL/15mL, Centrifuge, Conical</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>28-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube, Microcentrifuge, 1.5/2 mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-912-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers (50mL &#8211; 2L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge with cooling</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-690-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinging-bucket centrifuge with cooling</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-728-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath Sonicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-336-120</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of histone from sorghum leaf tissue for top down mass spectrometry profiling of potential epigenetic markers

Histones pertencem a uma família de proteínas altamente conservadas em eucariotes. Eles embalam DNA em nucleosósmos como unidades funcionais de cromatina. Modificações pós-translacionais (PTMs) de histones, que são altamente dinâmicas e podem ser adicionadas ou removidas por enzimas, desempenham papéis críticos na regulação da expressão genética. Nas plantas, fatores epigenéticos, incluindo PTMs histonas, estão relacionados às suas respostas adaptativas ao meio ambiente. Compreender os mecanismos moleculares do controle epigenético pode trazer oportunidades sem precedentes para soluções inovadoras de bioengenharia. Aqui, descrevemos um protocolo para isolar os núcleos e purificar histones do tecido da folha de sorgo. As histonas extraídas podem ser analisadas em suas formas intactas por espectrometria de massa superior para baixo (MS) juntamente com cromatografia líquida de fase invertida on-line (RP) (LC). Combinações e estequiometria de múltiplos PTMs na mesma histona proteoforma podem ser facilmente identificadas. Além disso, o recorte da cauda de histone pode ser detectado usando o fluxo de trabalho LC-MS de cima para baixo, produzindo assim o perfil global PTM de histones centrais (H4, H2A, H2B, H3). Aplicamos este protocolo anteriormente para traçar o perfil de PTMs histítonos a partir de tecido de folha de sorgo coletados de um estudo de campo em larga escala, com o objetivo de identificar marcadores epigenéticos de resistência à seca. O protocolo poderia potencialmente ser adaptado e otimizado para sequenciamento de imunoprecipitação de cromatina (ChIP-seq), ou para estudar PTMs de histona em plantas semelhantes.

Seguindo o protocolo, as histonas podem ser extraídas e identificadas por meio da análise LC-MS. Os dados brutos e os resultados processados estão disponíveis no MassIVE (https://massive.ucsd.edu/) via adesão: MSV000085770. Com base nos resultados toppic da amostra representativa (disponível também no MassIVE), identificamos 303 proteoformes histona (106 H2A, 72 H2B, 103 H3 e 22 proteoforms H4). Proteoformes ribossômicos co-purificados também foram detectados, tipicamente elundo no início da LC. Eles geralmente...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Histone from Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profiling of Potential Epigenetic Markers at JoVE.com

Isolation of Histone from Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profiling of Potential Epigenetic Markers

O protocolo foi desenvolvido para extrair efetivamente histonas intactas de materiais de folhas de sorgo para o perfil de modificações pós-translacionais de histona que podem servir como potenciais marcadores epigenéticos para ajudar as culturas resistentes à seca de engenharia.

Isolamento de Histone do tecido da folha de sorgo para perfil de espectrometria de massa de top down de potenciais marcadores epigenéticos

Histones belong to a family of highly conserved proteins in eukaryotes. They pack DNA into nucleosomes as functional units of chromatin. ...

Nosso protocolo revela marcadores epigenéticos para o desenvolvimento de plantas de sorgo e resistência à seca. Tal compreensão molecular ajudará a desenvolver melhores soluções para adaptar as culturas para climas extremos no futuro. Este protocolo gera histones de alta pureza a partir de tecido de folha de sorgo adequado para perfil não direcionado de modificações pós-translacionais por espectrometria de massa.Demonstrando o procedimento serão Shadan Abdali e Tanya Winkler, pós-bacharelados associados de pesquisa da EMSL. Para começar, triture algumas folhas de sorgo com nitrogênio líquido e armazene-as em um tubo de centrífuga de 50 mililitros a menos 80 graus Celsius. Use aproximadamente quatro gramas do pó de folha para análise de histona de cada amostra.Prepare os buffers de extração 1, 2A e 2B conforme descrito no manuscrito do texto e adicione um comprimido inibidor de protease ao buffer de extração um para fazer uma concentração final de 0,2X. Em seguida, adicione 20 mililitros do tampão de extração preparado um ao pó da folha moída e misture suavemente ou vórtice por 10 minutos. Utilizando a malha 100, enxágue o material filtrado duas vezes com dois mililitros de tampão de extração um cada vez.Em seguida, centrifugar o filtrado a 3.000 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius em um rotor de balde balançando para pelotar os detritos celulares e grandes organelas subcelulares. Simultaneamente, prepare o tampão de extração 2A adicionando o inibidor de protease a uma concentração final de 0,4X. Descarte o supernatante sem perturbar a pelota.Em seguida, resuspenha a pelota em cinco mililitros do tampão de extração preparado 2A. Incubar no gelo por 10 minutos com mistura suave. Centrifugar a solução a 2.100 vezes G por 15 minutos a quatro graus Celsius em um rotor de balde balançando para pelotar os detritos e núcleos.Decante o supernatante cuidadosamente sem perturbar a pelota. Prepare o tampão de extração 2B adicionando os inibidores de protease a uma concentração final de 1X. Adicione cinco mililitros deste tampão preparado à pelota obtida após a centrifugação.Centrífuga a 2.100 vezes G por 15 minutos a quatro graus Celsius no rotor de balde balançando para detritos de pelotas e núcleos. Simultaneamente, prepare o tampão de lise dos núcleos adicionando um comprimido inibidor de protease. Decante cuidadosamente o supernascer sem perturbar a pelota e resuspense a pelota em 250 microliters do tampão de lise.Vórtice a solução por 15 segundos em velocidade máxima para homogeneizá-la e resuspensá-la. Em seguida, sonicate-lo por cinco minutos a quatro graus Celsius e armazená-lo a menos 80 graus Celsius. Descongele a amostra de núcleos congelados e adicione 750 microliters de 5% de tampão de guanidina.Em seguida, sonicate-lo por 15 minutos a quatro graus Celsius. Transfira a amostra para um tubo de dois mililitros e gire-a a 10.000 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Simultaneamente, prepare uma coluna de cromatografia de troca de íons enxaguando-a com dois mililitros de acetonitrilo e quatro mililitros de água para minimizar a contaminação na superfície.Carregue aproximadamente 200 a 300 microliters de fraca resina de troca de cálice na coluna cromatografia e deixe a resina se instalar. Lave a resina quatro vezes com tampão de guanidina e coloque o tubo e a coluna no gelo. Coloque a coluna em um tubo de coleta de dois mililitros e carregue o sobrenante da amostra preparada lentamente na cama de resina sem interromper a resina.À medida que a solução está fluindo, carregue o eluent de volta ao topo da coluna seis a oito vezes para permitir a ligação máxima à resina. Em seguida, carregue dois mililitros de tampão de 5% de guanidina para lavar as proteínas não histonas da coluna. Elute as proteínas histonas com um mililitro de 5% de tampão de guanidina e colete o eluent.Limpe um filtro de giro de corte de três quilodaltons com 500 microliters de solvente de lavagem e, em seguida, desalente o eluent restante usando o filtro de giro pré-limpo. As principais proteínas histonas foram observadas em regiões específicas do mapa de características LC-MS indicando o sucesso do experimento. Este mapa representativo mostra histones intactos em caixas tracejadas.O mapa de recursos LC-MS de proteoforms H2B e 16 kilodalton H2A mostra que ambos têm vários homólogos com sequências semelhantes, como observado pelos números exclusivos da sessão do produto. Outro grupo de histones H2A sem as caudas estendidas pode ser visto. A acetilação n-terminal, acetilações adicionais de lysina e oxidações de methionina em proteínas histonas H4 podem ser observadas examinando as diferenças de massa no mapa de características LC-MS mostrado aqui.Foram identificadas duas sequências proteicas para proteínas de histona H3, H3.3 e H3.2. A fragmentação da dissociação da transferência de elétrons foi usada para gerar o espectro de fragmentação do proteoforme H3.2 identificado. Os íons precursores e os espectros anterior e seguinte da Ms1 são mostrados aqui com seus picos de isótopos combinados destacados em roxo.Modificações pós-translacionais podem ser localizadas usando o mapa de cobertura de sequência. Comparando-se a abundância relativa dos proteoformes, foram descobertas alterações de proteoformas de histona truncadas específicas às condições amostrais. A truncação terminal C de H4 foi observada apenas nas semanas três e nove para algumas das amostras.Para h3.2, os proteoformes truncados n-terminal foram geralmente mais abundantes na semana 10. Em contraste, o terminal C truncado H3.2 foi visto em pontos de tempo anteriores. Os proteoformes truncados do terminal H4 C foram significativamente mais abundantes em BTx642 do que em RTx430.Ao tentar este protocolo, preste muita atenção às cores do supernatante e da pelota. A mudança de cor ajuda a identificar possíveis problemas na moagem ou lise do cloroplasto. Esperamos que este protocolo robusto para o isolamento de histono das folhas de sorgo permita pesquisa epigenética para outras plantas semelhantes.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Eletroforese Capilar-Espectrometria de Massa para Metabolic Profiling de amostras biológicas

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Bioquímica

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

resolvida no tempo com ionização por electrospray Hidrogénio-deutério troca Espectrometria de Massa para estudar a estrutura e dinâmica das proteínas

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Resolver purificada por afinidade complexos de proteínas por Azul Native PAGE e Proteína Correlação Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Isolamento de gotículas de gordura para análise quantitativa Espectrometria de Massa

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Preparação da amostra para identificação de espectrometria de massa-baseada das regiões de ligação de RNA

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Proteome profunda de criação de perfil por isobárica rotulagem extensa cromatografia líquida, espectrometria de massa e quantificação assistida por Software

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Espectrometria de massa folha Spray: Uma técnica de ionização ambiente rápida para avaliar diretamente a metabolitos de tecidos vegetais

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Perfil e identificação de nitropeptídeos ilustrados pela angiotensina II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Preparação de amostras para espectrometria de ionização de eletrospray de sonda

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Fluxo de trabalho de espectrometria de massa de imunoprecipitação sem rótulos para perfis de interactom nuclear em larga escala

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...