Name: isolation of histone from sorghum leaf tissue for top down mass spectrometry profiling of potential epigenetic markers
Uploaded: 2021-03-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Histone from Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profiling of Potential Epigenetic Markers at JoVE.com

Мы благодарим Рональда Мура и Томаса Филлмора за помощь в экспериментах по масс-спектрометрии, а Также Мэтью Монро за осаждение данных. Это исследование финансировалось за счет грантов Министерства энергетики США (DOE) биологических и экологических исследований в рамках эпигенетического контроля засухи ответ в Сорго (EPICON) проекта под номером премии DE-SC0014081, от Министерства сельского хозяйства США (USDA; CRIS 2030-21430-008-00D), а также через Объединенный институт биоэнергетики (JBEI), объект, спонсируемый DOE (контракт DE-AC02-05CH11231) между Национальной лабораторией Лоуренса Беркли и Министерством здравоохранения. Исследование проводилось с использованием Лаборатории экологических молекулярных наук (EMSL) (grid.436923.9), Управления научных пользователей, спонсируемого Управлением биологических и экологических исследований.

1. Подготовка материала из листьев сорго
ПРИМЕЧАНИЕ: Сорго растения были выращены в почве в поле в Parlier, Калифорния.
<ol><li>Соберите листья сорго из растений в 50 мл центрифуг трубки и немедленно заморозить трубку в жидком азоте. Соберите листовую ткань, оторвав третий и четв?...

<ol>
	<li>Farooq, M., Wahid, A., Kobayashi, N., Fujita, D., Basra, S. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+drought+stress:+Effects,+mechanisms+and+management.">Plant drought stress: Effects, mechanisms and management.</a> Agronomy for Sustainable Development. , 153-188 (2009).</li><li>Dai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drought+under+global+warming:+a+review.">Drought under global warming: a review.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Climate Change. 2 (1), 45-65 (2011).</li><li>Rooney, W. L., Blumenthal, J., Bean, B., Mullet, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+sorghum+as+a+dedicated+bioenergy+feedstock.">Designing sorghum as a dedicated bioenergy feedstock.</a> Biofuels, Bioproducts and Biorefining. 1 (2), 147-157 (2007).</li><li>Mullet, J. E., Klein, R. R., Klein, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorghum+bicolor+-+an+important+species+for+comparative+grass+genomics+and+a+source+of+beneficial+genes+for+agriculture.">Sorghum bicolor - an important species for comparative grass genomics and a source of beneficial genes for agriculture.</a> Current Opinion in Plant Biology. 5 (2), 118-121 (2002).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drought+delays+development+of+the+sorghum+root+microbiome+and+enriches+for+monoderm+bacteria.">Drought delays development of the sorghum root microbiome and enriches for monoderm bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (18), 4284-4293 (2018).</li><li>Gao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strong+succession+in+arbuscular+mycorrhizal+fungal+communities.">Strong succession in arbuscular mycorrhizal fungal communities.</a> ISME Journal. 13 (1), 214-226 (2019).</li><li>Gao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+community+assembly+in+drought-stressed+sorghum+shows+stochasticity,+selection,+and+universal+ecological+dynamics.">Fungal community assembly in drought-stressed sorghum shows stochasticity, selection, and universal ecological dynamics.</a> Nature Communications. 11 (1), (2020).</li><li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications.">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).</li><li>Yuan, L., Liu, X., Luo, M., Yang, S., Wu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+histone+modifications+in+plant+abiotic+stress+responses.">Involvement of histone modifications in plant abiotic stress responses.</a> Journal of Integrative Plant Biology. 55 (10), 892-901 (2013).</li><li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq:+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology.">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nature Reviews. Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).</li><li>Huang, H., Lin, S., Garcia, B. A., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomic+analysis+of+histone+modifications.">Quantitative proteomic analysis of histone modifications.</a> Chemical Reviews. 115 (6), 2376-2418 (2015).</li><li>Moradian, A., Kalli, A., Sweredoski, M. J., Hess, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+top-down,+middle-down,+and+bottom-up+mass+spectrometry+approaches+for+characterization+of+histone+variants+and+their+post-translational+modifications.">The top-down, middle-down, and bottom-up mass spectrometry approaches for characterization of histone variants and their post-translational modifications.</a> Proteomics. 14 (4-5), 489-497 (2014).</li><li>Sidoli, S., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+individual+histone+posttranslational+modifications+and+their+combinatorial+patterns+by+mass+spectrometry-based+proteomics+strategies.">Characterization of individual histone posttranslational modifications and their combinatorial patterns by mass spectrometry-based proteomics strategies.</a> Methods in Molecular Biology. 1528, 121-148 (2017).</li><li>Maile, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+quantification+of+histone+post-translational+modifications+by+a+hybrid+chemical+labeling+method.">Mass spectrometric quantification of histone post-translational modifications by a hybrid chemical labeling method.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 14 (4), 1148-1158 (2015).</li><li>Dang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+pilot+project+of+the+consortium+for+top-down+proteomics:+a+status+report.">The first pilot project of the consortium for top-down proteomics: a status report.</a> Proteomics. 14 (10), 1130-1140 (2014).</li><li>Schaffer, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantification+of+proteoforms+by+mass+spectrometry.">Identification and quantification of proteoforms by mass spectrometry.</a> Proteomics. 19 (10), 1800361 (2019).</li><li>Cupp-Sutton, K. A., Wu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+quantitative+top-down+proteomics.">High-throughput quantitative top-down proteomics.</a> Molecular Omics. , (2020).</li><li>Varoquaux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+field-droughted+sorghum+from+seedling+to+maturity+reveals+biotic+and+metabolic+responses.">Transcriptomic analysis of field-droughted sorghum from seedling to maturity reveals biotic and metabolic responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (52), 27124 (2019).</li><li>Gordon, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+vanadate+as+protein-phosphotyrosine+phosphatase+inhibitor.">Use of vanadate as protein-phosphotyrosine phosphatase inhibitor.</a> Methods in Enzymology. 201, 477-482 (1991).</li><li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+changes+in+histone+post-translational+modifications+by+top-down+mass+spectrometry.">Profiling changes in histone post-translational modifications by top-down mass spectrometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1507, 153-168 (2017).</li><li>Chambers, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cross-platform+toolkit+for+mass+spectrometry+and+proteomics.">A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics.</a> Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).</li><li>Kou, Q., Xun, L., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopPIC:+a+software+tool+for+top-down+mass+spectrometry-based+proteoform+identification+and+characterization.">TopPIC: a software tool for top-down mass spectrometry-based proteoform identification and characterization.</a> Bioinformatics (Ocford, England). 32 (22), (2016).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Informed-Proteomics:+open-source+software+package+for+top-down+proteomics.">Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics.</a> Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).</li><li>LeDuc, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C-Score:+a+bayesian+framework+to+sharply+improve+proteoform+scoring+in+high-throughput+top+down+proteomics.">The C-Score: a bayesian framework to sharply improve proteoform scoring in high-throughput top down proteomics.</a> Journal of Proteome Research. 13 (7), 3231-3240 (2014).</li><li>Fornelli, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+top-down+analysis+of+the+human+proteome+using+a+benchtop+quadrupole-orbitrap+mass+spectrometer.">Advancing top-down analysis of the human proteome using a benchtop quadrupole-orbitrap mass spectrometer.</a> Journal of Proteome Research. 16 (2), 609-618 (2017).</li><li>Sun, R. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pTop+1.0:+A+high-accuracy+and+high-efficiency+search+engine+for+intact+protein+identification.">pTop 1.0: A high-accuracy and high-efficiency search engine for intact protein identification.</a> Analytical Chemistry. 88 (6), 3082-3090 (2016).</li><li>Xiao, K., Yu, F., Tian, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+protein+identification+using+isotopic+envelope+fingerprinting.">Top-down protein identification using isotopic envelope fingerprinting.</a> Journal of Proteomics. 152, 41-47 (2017).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MASH+Suite+Pro:+A+comprehensive+software+tool+for+top-down+proteomics.">MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics: MCP. 15 (2), 703-714 (2016).</li><li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+mass+spectrometry+of+histone+modifications+in+sorghum+reveals+potential+epigenetic+markers+for+drought+acclimation.">Top-down mass spectrometry of histone modifications in sorghum reveals potential epigenetic markers for drought acclimation.</a> Methods. , (2019).</li><li>Garcia, B. A., Pesavento, J. J., Mizzen, C. A., Kelleher, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pervasive+combinatorial+modification+of+histone+H3+in+human+cells.">Pervasive combinatorial modification of histone H3 in human cells.</a> Nature Methods. 4 (6), 487-489 (2007).</li><li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unabridged+analysis+of+human+histone+H3+by+differential+top-down+mass+spectrometry+reveals+hypermethylated+proteoforms+from+MMSET/NSD2+overexpression.">Unabridged analysis of human histone H3 by differential top-down mass spectrometry reveals hypermethylated proteoforms from MMSET/NSD2 overexpression.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics: MCP. 15 (3), 776-790 (2016).</li><li>Garcia, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+derivatization+of+histones+for+facilitated+analysis+by+mass+spectrometry.">Chemical derivatization of histones for facilitated analysis by mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 2 (4), 933-938 (2007).</li><li>Holt, M. V., Wang, T., Young, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-pot+quantitative+top-+and+middle-down+analysis+of+GluC-digested+histone+H4.">One-pot quantitative top- and middle-down analysis of GluC-digested histone H4.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (12), 2514-2525 (2019).</li><li>Tian, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+top-down+characterization+of+histone+post-translational+modifications.">Enhanced top-down characterization of histone post-translational modifications.</a> Genome Biology. 13 (10), (2012).</li><li>Wang, Z., Ma, H., Smith, K., Wu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+separation+using+high-pH+and+low-pH+reversed+phase+liquid+chromatography+for+top-down+proteomics.">Two-dimensional separation using high-pH and low-pH reversed phase liquid chromatography for top-down proteomics.</a> International Journal of Mass Spectrometry. 427, 43-51 (2018).</li><li>Gargano, A. F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+separation+capacity+of+intact+histone+proteoforms+chromatography+coupling+online+weak+cation+exchange-HILIC+to+reversed+phase+LC+UVPD-HRMS.">Increasing the separation capacity of intact histone proteoforms chromatography coupling online weak cation exchange-HILIC to reversed phase LC UVPD-HRMS.</a> Journal of Proteome Research. 17 (11), 3791-3800 (2018).</li></ol>

Представленный протокол описывает, как извлечь гистоны из листьев сорго (или, в более общем плане, листьев растений) образцов. Средняя урожайность гистона, как ожидается, будет 2-20 мкг на 4-5 г материала листьев сорго. Материалы достаточно чисты для анализа гистона вниз по течению LC-MS (в осн...

Увеличение тяжести и частоты засухи, как ожидается, повлияет на производительность зерновыхкультур 1,2. Сорго является зерновых продуктов питания и энергии культур известен своей исключительной способностью выдерживать ограничения водыусловиях 3,4. Мы преследуем механистическое понимание взаимодействия между засухой, развитием растений и эпигенетикой растений соргои двухцветного сорго (L.) Moench. Наша предыдущая работа продемонстрировала сильную связь между микробиомом растений и корневища при акклиматизации засухи иреакциями на молекулярном уровне 5,6,7. Это исследование проложит путь для использования эпигенетической инженерии в адаптации сельскохозяйственных культур к будущим климатическим сценариям. В рамках усилий по пониманию эпигенетики мы стремимся изучить белковые маркеры, которые влияют на экспрессию генов в организме растения.
Гистоны принадлежат к высоко сохраниваемому семейство белков в эукариотах, которые упаковывают ДНК в нуклеосомы в качестве основных единиц хроматина. Пост-трансляционные модификации (ПТМ) гистонов динамически регулируются для контроля структуры хроматина и влияния на экспрессию генов. Как и другие эпигенетические факторы, в том числе метилирование ДНК, гистон PTMs играют важную роль во многихбиологических процессах 8,9. Анализы на основе антител, такие как западные помарки, широко используются для выявления и количественной оценки гистоновых ПТМ. Кроме того, взаимодействие гистона ПТМ и ДНК может быть эффективно исследовано иммунопреципиентацией хроматина – секвенированием (ChIP-seq)10. В ChIP-seq хроматин с специфическим целевым гистоном PTM обогащается антителами против этого конкретного PTM. Затем фрагменты ДНК могут быть освобождены от обогащенного хроматина и секвенированы. Выявлены области генов, взаимодействующих с целевым гистоном PTM. Однако все эти эксперименты в значительной степени опираются на высококачественные антитела. Для некоторых вариантов гистон / омологов или комбинаций ПТМ, разработка надежных антител может быть чрезвычайно сложной задачей (особенно для нескольких ПТМ). Кроме того, антитела могут быть разработаны только в том случае, если целевой гистон PTM известен. 11 Поэтому необходимы альтернативные методы нецелесохозяемого глобального профилирования Гистоновых ПТМ.
Масс-спектрометрия (MS) является дополнительным методом для характеристики гистон PTMs, в том числе неизвестных ПТМ, длякоторых антитела не доступны 11,12. Устоявшийся "снизу вверх" MS рабочий процесс использует протеасы для переваривания белков в небольших пептидов до жидкой хроматографии (LC) разделения и обнаружения MS. Поскольку гистоны имеют большое количество основных остатков (лизин и аргинин), пищеварение трипсина (протеаза, специфичная для лизина и аргинина) в стандартном рабочем процессе снизу вверх разрезает белки на очень короткие пептиды. Короткие пептиды технически трудно анализировать стандартными LC-MS, и не сохраняют информацию о подключении и стоихиометрии нескольких ПТМ. Использование других ферментов или химической маркировки для блокирования лизинов генерирует более длинные пептиды, которые больше подходят для характеристики гистон PTMs13,14.
Кроме того, шаг пищеварения может быть полностью опущен. В этом "сверху вниз" подход, нетронутыми ионов белка вводятся в MS электроспрей ионизации (ESI) после онлайн разделения LC, что дает ионы нетронутыми протеоформов гистона. Кроме того, ионы (т.е. протеоформы), представляющие интерес, могут быть изолированы и фрагментированы в масс-спектрометре для получения последовательности ионов для идентификации и локализации PTM. Таким образом, сверху вниз MS имеет преимущество, чтобы сохранить информацию на уровне протеоформ и захватить подключение нескольких PTMs и терминальных усечений на той жепротеоформы 15,16. Эксперименты сверху вниз могут также предоставить количественную информацию и предложить понимание биомаркеров на нетронутом уровне белка17. В этом случае мы описываем протокол для извлечения гистона из листьев сорго и анализа неповрежденных гистонов сверху вниз LC-MS.
Примерные данные, показанные на рисунке 1 и рисунке 2, являются данными из листьев сорго, собранных на второй неделе после посадки. Хотя ожидается изменение урожайности, этот протокол, как правило, агностик к конкретным условиям выборки. Тот же протокол был успешно использован для тканей листьев растений сорго, собранных из 2, 3, 5, 8, 9 и 10 недель после посадки.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A955-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, 500mM Solution, pH 8.0</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>324504-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine Hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G3272-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate, dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3786-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail, cOmplete tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5892791001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium butyrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>303410-5G</td>
			<td>Used for histone deacetylase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7020-100G</td>
			<td>Used for phosphatase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Orthovanadate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>450243-10G</td>
			<td>Used for phosphatase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7903-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP153-500 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weak cation exchange resin, mesh 100-200 analytical (BioRex70)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>142-5842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatography column (Bio-Spin)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>732-6008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh 100 filter cloth</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>NY1H09000</td>
			<td>This is part of the Sigma kit (catalog # CELLYTPN1) for plant nuclei extraction. Similar filters with the same mesh size can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips (P20, P200, P1000)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube, 50mL/15mL, Centrifuge, Conical</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>28-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube, Microcentrifuge, 1.5/2 mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-912-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers (50mL &#8211; 2L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge with cooling</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-690-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinging-bucket centrifuge with cooling</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-728-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath Sonicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-336-120</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of histone from sorghum leaf tissue for top down mass spectrometry profiling of potential epigenetic markers

Гистоны принадлежат к семейство высокосхраняемых белков в эукариотах. Они упаковывают ДНК в нуклеосомы как функциональные единицы хроматина. Пост-трансляционные модификации (ПТМ) гистонов, которые являются высокодинамических и могут быть добавлены или удалены ферментами, играют важную роль в регулировании экспрессии генов. В растениях эпигенетические факторы, в том числе гистон ПТМ, связаны с их адаптивной реакцией на окружающую среду. Понимание молекулярных механизмов эпигенетического контроля может принести беспрецедентные возможности для инновационных биоинженерных решений. В этом случае мы описываем протокол изоляции ядер и очистки гистонов от тканей листьев сорго. Извлеченные гистоны могут быть проанализированы в их неповрежденных формах с помощью масс-спектрометрии сверху вниз (MS) в сочетании с онлайн обратной фазой (RP) жидкой хроматографией (LC). Комбинации и стоихиометрия нескольких ПТМ на одной и той же протеоформе гистона могут быть легко идентифицированы. Кроме того, отрезание хвоста гистона может быть обнаружено с помощью рабочего процесса LC-MS сверху вниз, что дает глобальный профиль PTM основных гистонов (H4, H2A, H2B, H3). Ранее мы применяли этот протокол для определения гистоновых ПТМ из тканей листьев сорго, собранных в ходе крупномасштабного полевого исследования, направленного на выявление эпигенетических маркеров засухоустойчивости. Протокол потенциально может быть адаптирован и оптимизирован для хроматина иммунопреципиентации секвенирования (ChIP-seq), или для изучения гистон PTMs в аналогичных растений.

Следуя протоколу, гистоны могут быть извлечены и идентифицированы с помощью анализа LC-MS. Необработанные данные и обработанные результаты доступны в MassIVE (https://massive.ucsd.edu/) через присоединение: MSV000085770. На основе результатов TopPIC из репрезентативной выборки (доступно также от MassIVE), мы опреде?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Histone from Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profiling of Potential Epigenetic Markers at JoVE.com

Isolation of Histone from Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profiling of Potential Epigenetic Markers

Протокол был разработан для эффективного извлечения нетронутыми гистонами из материалов листьев сорго для профилирования гистон пост-переводных модификаций, которые могут служить потенциальными эпигенетическими маркерами для оказания помощи инженерных засухоустойчивых культур.

Изоляция гистона от ткани листьев сорго для Top Down Масс Спектрометрия Профилирование потенциальных эпигенетических маркеров

Histones belong to a family of highly conserved proteins in eukaryotes. They pack DNA into nucleosomes as functional units of chromatin. ...

Наш протокол раскрывает эпигенетические маркеры для развития растений сорго и засухоустойчивости. Такое молекулярное понимание поможет разработать более эффективные решения для адаптации сельскохозяйственных культур к экстремальным климатическим условиям в будущем. Этот протокол генерирует высокой чистоты гистоны из ткани листьев сорго подходит для не-целенаправленного профилирования пост-трансляционных модификаций масс-спектрометрии.Демонстрация процедуры будет Шадан Абдали и Таня Винклер, после бакалавра научных сотрудников из EMSL. Для начала измельчите несколько листьев сорго жидким азотом и храните их в 50-миллилитровой центрифуге при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Используйте приблизительно четыре грамма порошка листа для анализа гистонов каждого образца.Подготовь буферы извлечения 1, 2A и 2B, как описано в рукописи текста, и добавьте таблетку ингибитора протеазы для извлечения буфера, чтобы сделать окончательную концентрацию 0.2X. Затем добавьте 20 миллилитров подготовленного буфера экстракции один в порошок сусального листа земли и аккуратно перемешайте или вихрь в течение 10 минут. Используя сетку 100, промыть фильтрованный материал дважды с двумя миллилитров буфера извлечения по одному каждый раз.Далее, центрифуга фильтрата на 3000 раз G в течение 10 минут при четырех градусах по Цельсию в размахивая ротором ведро гранулы клеточного мусора и больших субклеточных органелл. Одновременно подготовьте буфер экстракции 2A, добавив ингибитор протеазы к окончательной концентрации 0,4X. Откажитесь от супернатанта, не нарушая гранулы.Затем повторно посыку гранулы в пять миллилитров подготовленного буфера извлечения 2A. Инкубировать его на льду в течение 10 минут с нежным смешивания. Центрифуга раствор на 2, 100 раз G в течение 15 минут при четырех градусах по Цельсию в размахивая ротором ведро гранулы мусора и ядер.Декант супернатант тщательно, не нарушая гранулы. Подготовьте буфер экстракции 2B, добавив ингибиторы протеазы к окончательной концентрации 1X. Добавьте пять миллилитров этого подготовленного буфера в гранулы, полученные после центрифугации.Центрифуга при 2, 100 раз G в течение 15 минут при четырех градусах по Цельсию в размахивая ротором ведра гранулы мусора и ядер. Одновременно подготовьте буфер лиза ядер, добавив таблетку ингибитора протеазы. Тщательно decant supernatant, не нарушая гранулы и повторно гранулы в 250 микролитров буфера лиза.Вихрь раствор в течение 15 секунд на максимальной скорости, чтобы гомогенизировать его и повторно использовать материал. Затем sonicate его в течение пяти минут при четырех градусах по Цельсию и хранить его при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Оттепель замороженных ядер образца и добавить 750 микролитров 5%guanidine буфера.Затем sonicate его в течение 15 минут при четырех градусах по Цельсию. Перенесите образец в двухми миллилитровую трубку и вращай его при 10 000 раз G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Одновременно подготовь ионный обмен хроматографическим столбцом, опоясыв его двумя миллилитровами ацетонитрила и четырьмя миллилитров воды, чтобы свести к минимуму загрязнение поверхности.Загрузите примерно от 200 до 300 микролитров слабой смолы обмена катиоцией на колонку хроматографии и дайте смоле осесть. Вымойте смолу четыре раза с буфером гуанидина и поместите трубку и колонку на лед. Положите колонку на двухмилитровую трубку сбора и загрузите супернатант из подготовленного образца медленно на кровать смолы, не нарушая смолы.По мере того как разрешение пропускает до конца, загрузите eluent назад к верхней части колонки 6 до 8 времен для того чтобы позволить максимальную связывать к смоле. Затем загрузите два миллилитров буфера 5%гуанидина, чтобы смыть неистоновые белки с колонки. Elute histone белки с одним миллилитр 5%guanidine буфера и собирать элуент.Очистите трехкилотонный фильтр для отсечения спином с 500 микролитров растворителя для мытья, затем разезвите оставшийся элуент с помощью предварительно очищенного спинового фильтра. Основные гистоновые белки наблюдались в определенных регионах карты функции LC-MS, что свидетельствует об успехе эксперимента. На этой репрезентативной карте показаны нетронутые полноформатные гистоны в разбитых коробках.Карта функций LC-MS H2B и 16 kilodalton H2A proteoforms показывает, что оба имеют несколько омологов с аналогичными последовательностями, как отмечено уникальными номерами сеанса продукта. Еще одна группа Гистонов H2A без вытянутых хвостов можно увидеть. N-терминальная ацетилляция, дополнительные ацетилирования лизина и окисления метамфетамина в белках гистона H4 можно наблюдать, исследуя различия массы на карте функции LC-MS, показанной здесь.Были определены две белковые последовательности для белков гистона H3, H3.3 и H3.2. Фрагментация диссоциации передачи электронов использовалась для генерации спектра фрагментации идентифицированной протеоформы H3.2. Ионы-предшественники и предыдущие и следующие спектры Ms1 показаны здесь с их совпадают изотопных пиков выделены фиолетовым цветом.Пост-трансляционные изменения могут быть локализованы с помощью карты покрытия последовательности. Сравнивая относительное изобилие протеоформ, были обнаружены изменения усеченных протеоформ гистона, характерных для условий образца. C-терминальная укоренения H4 наблюдалась только в течение трех и девяти недель для некоторых образцов.Для H3.2, N-терминал усеченные протеоформы, как правило, более обильные в неделю 10. В отличие от этого, C-терминал усеченный H3.2 были замечены в более ранних точках времени. Усеченные протеоформы H4 C-терминала были значительно более обильными в BTx642, чем в RTx430.При попытке этого протокола, обратите пристальное внимание на цвета супернатанта и гранулы. Изменение цвета помогает выявить потенциальные проблемы в шлифовке или лизе хлоропласта. Мы надеемся, что этот надежный протокол для изоляции гистон от листьев сорго позволит эпигенетические исследования для других подобных растений.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Без футляра Капиллярный электрофорез-масс-спектрометрии для Метаболический Профилирование биологических образцов

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Времяразрешенная ионизацией электрораспылением водорода дейтерий Обмен масс-спектрометрии для изучения белка структуры и динамики

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Разрешающая Affinity Очищенная Белковые комплексы от Синей Native ПААГ и белка корреляции профилирование

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Липидное Выделение капельного для количественной анализа масс-спектрометрии

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Пробоподготовка для массы на основе спектрометрии идентификации RNA-связывая регионов

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Глубокая протеома профилирование Изобарический маркировки, обширные жидкостная хроматография, масс-спектрометрии и при содействии программного обеспечения количественной оценки

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Масс-спектрометрия спрей лист: Быстрое окружающего ионизации техника непосредственно оценить метаболитов из растительных тканей

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

НитропептидНое профилирование и идентификация Иллюстрировано Ангиотензином II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Образец Подготовки для зонда Электроспрей ионизации масс-спектрометрии

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Без этикетки Иммунопрецитис Масса Спектромтертрия Рабочий процесс для крупномасштабного ядерного взаимодействия Профилирование

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...