Name: isolation of histone from sorghum leaf tissue for top down mass spectrometry profiling of potential epigenetic markers
Uploaded: 2021-03-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Histone from Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profiling of Potential Epigenetic Markers at JoVE.com

Ronald Moore ve Thomas Fillmore'a kütle spektrometresi deneylerine yardım ettiği için ve Matthew Monroe'ya veri ifadesi için teşekkür ederiz. Bu araştırma, ABD Tarım Bakanlığı'ndan (USDA) DE-SC0014081 ödül numarası altında Sorgum'da Kuraklık Tepkisinin Epigenetik Kontrolü (EPICON) projesi aracılığıyla ABD Enerji Bakanlığı (DOE) Biyolojik ve ÇevreSel Araştırmalar tarafından finanse edildi; CRIS 2030-21430-008-00D) ve Lawrence Berkeley Ulusal Laboratuvarı ile DOE arasında DOE (Contract DE-AC02-05CH11231) sponsorluğunda bir tesis olan Joint BioEnergy Institute (JBEI) aracılığıyla. Araştırma, Biyolojik ve Çevresel Araştırmalar Ofisi sponsorluğunda bir DOE Bilim Kullanıcı Tesisi Ofisi olan Çevre Moleküler Bilimler Laboratuvarı (EMSL) (grid.436923.9) kullanılarak gerçekleştirildi.

1. Sorgum yaprağı malzemesinin hazırlanması
NOT: Sorgum bitkileri Parlier, CA'daki tarlada toprakta yetiştirildi.
<ol><li>Sorgum yapraklarını bitkilerden 50 mL santrifüj tüpler halinde toplayın ve tüpü hemen sıvı nitrojen içinde dondurun. Birincil çapalayıcıdan üçüncü ve dördüncü tamamen ortaya çıkan yaprağı kopararak yaprak dokusunu toplayın. NOT: Alan durumu, örnek büyüme ve toplama hakkında daha fazla ayrıntı yayınlanan rapor18'de<...

<ol>
	<li>Farooq, M., Wahid, A., Kobayashi, N., Fujita, D., Basra, S. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+drought+stress:+Effects,+mechanisms+and+management.">Plant drought stress: Effects, mechanisms and management.</a> Agronomy for Sustainable Development. , 153-188 (2009).</li><li>Dai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drought+under+global+warming:+a+review.">Drought under global warming: a review.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Climate Change. 2 (1), 45-65 (2011).</li><li>Rooney, W. L., Blumenthal, J., Bean, B., Mullet, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+sorghum+as+a+dedicated+bioenergy+feedstock.">Designing sorghum as a dedicated bioenergy feedstock.</a> Biofuels, Bioproducts and Biorefining. 1 (2), 147-157 (2007).</li><li>Mullet, J. E., Klein, R. R., Klein, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorghum+bicolor+-+an+important+species+for+comparative+grass+genomics+and+a+source+of+beneficial+genes+for+agriculture.">Sorghum bicolor - an important species for comparative grass genomics and a source of beneficial genes for agriculture.</a> Current Opinion in Plant Biology. 5 (2), 118-121 (2002).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drought+delays+development+of+the+sorghum+root+microbiome+and+enriches+for+monoderm+bacteria.">Drought delays development of the sorghum root microbiome and enriches for monoderm bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (18), 4284-4293 (2018).</li><li>Gao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strong+succession+in+arbuscular+mycorrhizal+fungal+communities.">Strong succession in arbuscular mycorrhizal fungal communities.</a> ISME Journal. 13 (1), 214-226 (2019).</li><li>Gao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+community+assembly+in+drought-stressed+sorghum+shows+stochasticity,+selection,+and+universal+ecological+dynamics.">Fungal community assembly in drought-stressed sorghum shows stochasticity, selection, and universal ecological dynamics.</a> Nature Communications. 11 (1), (2020).</li><li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications.">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).</li><li>Yuan, L., Liu, X., Luo, M., Yang, S., Wu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+histone+modifications+in+plant+abiotic+stress+responses.">Involvement of histone modifications in plant abiotic stress responses.</a> Journal of Integrative Plant Biology. 55 (10), 892-901 (2013).</li><li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq:+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology.">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nature Reviews. Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).</li><li>Huang, H., Lin, S., Garcia, B. A., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomic+analysis+of+histone+modifications.">Quantitative proteomic analysis of histone modifications.</a> Chemical Reviews. 115 (6), 2376-2418 (2015).</li><li>Moradian, A., Kalli, A., Sweredoski, M. J., Hess, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+top-down,+middle-down,+and+bottom-up+mass+spectrometry+approaches+for+characterization+of+histone+variants+and+their+post-translational+modifications.">The top-down, middle-down, and bottom-up mass spectrometry approaches for characterization of histone variants and their post-translational modifications.</a> Proteomics. 14 (4-5), 489-497 (2014).</li><li>Sidoli, S., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+individual+histone+posttranslational+modifications+and+their+combinatorial+patterns+by+mass+spectrometry-based+proteomics+strategies.">Characterization of individual histone posttranslational modifications and their combinatorial patterns by mass spectrometry-based proteomics strategies.</a> Methods in Molecular Biology. 1528, 121-148 (2017).</li><li>Maile, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+quantification+of+histone+post-translational+modifications+by+a+hybrid+chemical+labeling+method.">Mass spectrometric quantification of histone post-translational modifications by a hybrid chemical labeling method.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 14 (4), 1148-1158 (2015).</li><li>Dang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+pilot+project+of+the+consortium+for+top-down+proteomics:+a+status+report.">The first pilot project of the consortium for top-down proteomics: a status report.</a> Proteomics. 14 (10), 1130-1140 (2014).</li><li>Schaffer, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantification+of+proteoforms+by+mass+spectrometry.">Identification and quantification of proteoforms by mass spectrometry.</a> Proteomics. 19 (10), 1800361 (2019).</li><li>Cupp-Sutton, K. A., Wu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+quantitative+top-down+proteomics.">High-throughput quantitative top-down proteomics.</a> Molecular Omics. , (2020).</li><li>Varoquaux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+field-droughted+sorghum+from+seedling+to+maturity+reveals+biotic+and+metabolic+responses.">Transcriptomic analysis of field-droughted sorghum from seedling to maturity reveals biotic and metabolic responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (52), 27124 (2019).</li><li>Gordon, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+vanadate+as+protein-phosphotyrosine+phosphatase+inhibitor.">Use of vanadate as protein-phosphotyrosine phosphatase inhibitor.</a> Methods in Enzymology. 201, 477-482 (1991).</li><li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+changes+in+histone+post-translational+modifications+by+top-down+mass+spectrometry.">Profiling changes in histone post-translational modifications by top-down mass spectrometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1507, 153-168 (2017).</li><li>Chambers, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cross-platform+toolkit+for+mass+spectrometry+and+proteomics.">A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics.</a> Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).</li><li>Kou, Q., Xun, L., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopPIC:+a+software+tool+for+top-down+mass+spectrometry-based+proteoform+identification+and+characterization.">TopPIC: a software tool for top-down mass spectrometry-based proteoform identification and characterization.</a> Bioinformatics (Ocford, England). 32 (22), (2016).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Informed-Proteomics:+open-source+software+package+for+top-down+proteomics.">Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics.</a> Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).</li><li>LeDuc, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C-Score:+a+bayesian+framework+to+sharply+improve+proteoform+scoring+in+high-throughput+top+down+proteomics.">The C-Score: a bayesian framework to sharply improve proteoform scoring in high-throughput top down proteomics.</a> Journal of Proteome Research. 13 (7), 3231-3240 (2014).</li><li>Fornelli, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+top-down+analysis+of+the+human+proteome+using+a+benchtop+quadrupole-orbitrap+mass+spectrometer.">Advancing top-down analysis of the human proteome using a benchtop quadrupole-orbitrap mass spectrometer.</a> Journal of Proteome Research. 16 (2), 609-618 (2017).</li><li>Sun, R. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pTop+1.0:+A+high-accuracy+and+high-efficiency+search+engine+for+intact+protein+identification.">pTop 1.0: A high-accuracy and high-efficiency search engine for intact protein identification.</a> Analytical Chemistry. 88 (6), 3082-3090 (2016).</li><li>Xiao, K., Yu, F., Tian, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+protein+identification+using+isotopic+envelope+fingerprinting.">Top-down protein identification using isotopic envelope fingerprinting.</a> Journal of Proteomics. 152, 41-47 (2017).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MASH+Suite+Pro:+A+comprehensive+software+tool+for+top-down+proteomics.">MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics: MCP. 15 (2), 703-714 (2016).</li><li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+mass+spectrometry+of+histone+modifications+in+sorghum+reveals+potential+epigenetic+markers+for+drought+acclimation.">Top-down mass spectrometry of histone modifications in sorghum reveals potential epigenetic markers for drought acclimation.</a> Methods. , (2019).</li><li>Garcia, B. A., Pesavento, J. J., Mizzen, C. A., Kelleher, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pervasive+combinatorial+modification+of+histone+H3+in+human+cells.">Pervasive combinatorial modification of histone H3 in human cells.</a> Nature Methods. 4 (6), 487-489 (2007).</li><li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unabridged+analysis+of+human+histone+H3+by+differential+top-down+mass+spectrometry+reveals+hypermethylated+proteoforms+from+MMSET/NSD2+overexpression.">Unabridged analysis of human histone H3 by differential top-down mass spectrometry reveals hypermethylated proteoforms from MMSET/NSD2 overexpression.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics: MCP. 15 (3), 776-790 (2016).</li><li>Garcia, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+derivatization+of+histones+for+facilitated+analysis+by+mass+spectrometry.">Chemical derivatization of histones for facilitated analysis by mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 2 (4), 933-938 (2007).</li><li>Holt, M. V., Wang, T., Young, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-pot+quantitative+top-+and+middle-down+analysis+of+GluC-digested+histone+H4.">One-pot quantitative top- and middle-down analysis of GluC-digested histone H4.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (12), 2514-2525 (2019).</li><li>Tian, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+top-down+characterization+of+histone+post-translational+modifications.">Enhanced top-down characterization of histone post-translational modifications.</a> Genome Biology. 13 (10), (2012).</li><li>Wang, Z., Ma, H., Smith, K., Wu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+separation+using+high-pH+and+low-pH+reversed+phase+liquid+chromatography+for+top-down+proteomics.">Two-dimensional separation using high-pH and low-pH reversed phase liquid chromatography for top-down proteomics.</a> International Journal of Mass Spectrometry. 427, 43-51 (2018).</li><li>Gargano, A. F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+separation+capacity+of+intact+histone+proteoforms+chromatography+coupling+online+weak+cation+exchange-HILIC+to+reversed+phase+LC+UVPD-HRMS.">Increasing the separation capacity of intact histone proteoforms chromatography coupling online weak cation exchange-HILIC to reversed phase LC UVPD-HRMS.</a> Journal of Proteome Research. 17 (11), 3791-3800 (2018).</li></ol>

Sunulan protokol, histonların sorgum yaprağı (veya daha genel olarak bitki yaprağı) örneklerinden nasıl çıkarılacağını açıklar. Ortalama histone veriminin 4-5 g sorgum yaprağı malzemesi başına 2-20 μg olması beklenebilir. Malzemeler, LC-MS tarafından aşağı akış histon analizi için yeterince saftır (çoğunlukla ~% 20 ribozomal protein kontaminasyonuna sahip histonlar). Örnek varyasyonlar veya protokol boyunca olası yanlış işlenme/arızalar nedeniyle daha düşük verim elde edilebilir. ?...

Artan kuraklık şiddeti ve sıklığının tahıl bitkilerinin verimliliğini etkilemesi bek edilmektedir1,2. Sorgum, su sınırlayıcı koşullara dayanma olağanüstü yeteneği ile bilinen bir tahıl gıda ve enerji mahsulüdür3,4. Kuraklık stresi, bitki gelişimi ve sorgumun epigenetiği [Sorgum çift renkli (L.) Moench] bitkileri arasındaki etkileşimi mekanistik bir şekilde anlamaya çalışıyoruz. Önceki çalışmalarımız kuraklık iklimlendirmesinde bitki ve rizosfer mikrobiyomu ile moleküler düzeyde5,6,7. Bu araştırma, bitkileri gelecekteki iklim senaryolarına uyarlamada epigenetik mühendisliğin kullanılmasının önünü açacaktır. Epigenetiği anlama çabalarının bir parçası olarak, bitki organizmasında gen ekspresyonını etkileyen protein belirteçlerini incelemeyi amaçlıyoruz.
Histonlar, ökaryotlarda DNA'yı kromatin temel birimleri olarak nükleozomlara paketleyen yüksek oranda korunmuş bir protein ailesine aittir. Histonların çeviri sonrası modifikasyonları (PTM' ler) kromatin yapısını kontrol etmek ve gen ekspresyonunu etkilemek için dinamik olarak düzenlenir. DNA metilasyonu da dahil olmak üzere diğer epigenetik faktörler gibi, histone PTM'leri de birçok biyolojik işlemde önemli roller oynar8,9. Batı lekeleri gibi antikor bazlı tahliller, histone PTM'lerini tanımlamak ve ölçmek için yaygın olarak kullanılmıştır. Ek olarak, histone PTM'lerinin ve DNA'nın etkileşimi Chromatin immünorepritasyon ile etkili bir şekilde araştırılabilir - sıralama (ChIP-seq)10. ChIP-seq'te, spesifik hedefli histone PTM'ye sahip kromatin, bu spesifik PTM'ye karşı antikorlarla zenginleştirilir. Daha sonra, DNA parçaları zenginleştirilmiş kromatinden serbest bırakılabilir ve sıralanabilir. Hedeflenen histone PTM ile etkileşime giren genlerin bölgeleri ortaya konmuştır. Bununla birlikte, tüm bu deneyler büyük ölçüde yüksek kaliteli antikorlara dayanır. Bazı histone varyantları / homologları veya PTM kombinasyonları için, sağlam antikorların geliştirilmesi son derece zor olabilir (özellikle birden fazla PTM için). Ek olarak, antikorlar ancak hedeflenen histone PTM biliniyorsa geliştirilebilir. 11 Bu nedenle, histone PTM'lerin hedefsiz, genel profil oluşturma için alternatif yöntemler gereklidir.
Kütle spektrometresi (MS), antikorların bulunmadığı bilinmeyen PTM'ler de dahil olmak üzere histone PTM'leri karakterize etmek için tamamlayıcı bir yöntemdir11,12. Köklü "aşağıdan yukarıya" MS iş akışı, sıvı kromatografi (LC) ayrımı ve MS algılamadan önce proteinleri küçük peptitlere sindirmek için proteaz kullanır. Histonlar çok sayıda temel kalıntıya (lizin ve arginin) sahip olduğundan, standart aşağıdan yukarıya iş akışındaki tripsin sindirimi (lizin ve arginin'e özgü proteaz) proteinleri çok kısa peptitlere keser. Kısa peptitlerin standart LC-MS tarafından analiz etmesi teknik olarak zordur ve birden fazla PTM'nin bağlantısı ve stoichiometry'si hakkındaki bilgileri korumaz. Lizinleri bloke etmek için diğer enzimlerin veya kimyasal etiketlemeninkullanılması,histone PTM'lerin karakterizasyonu için daha uygun olan daha uzun peptitler üretir13,14.
Alternatif olarak, sindirim adımı tamamen atlanabilir. Bu "yukarıdan aşağıya" yaklaşımda, bozulmamış protein iyonları, çevrimiçi LC ayrımından sonra elektrospray iyonizasyonu (ESI) ile MS'e sokulur ve bozulmamış histone proteoformlarının iyonlarını verir. Ek olarak, ilgi çekici iyonlar (yani proteoformlar), tanımlama ve PTM lokalizasyonu için sıra iyonlarını elde etmek için kütle spektrometresinde izole edilebilir ve parçalanabilir. Bu nedenle, yukarıdan aşağıya MS, proteoform düzeyindeki bilgileri koruma ve aynı proteoform15 , 16üzerindeki birden fazla PTM ve terminal kesilmelerinin bağlantısını yakalama avantajına sahiptir. Yukarıdan aşağıya deneyler ayrıca nicel bilgiler sağlayabilir ve bozulmamış protein seviyesindeki biyobelirteçlerin içgörülerini sunabilir17. Burada, sorgum yaprağından histone çıkarmak ve bozulmamış histonları yukarıdan aşağıya LC-MS ile analiz etmek için bir protokol açıklıyoruz.
Şekil 1 ve Şekil 2'de gösterilen örnek veriler ekimden sonraki 2. haftada toplanan sorgum yaprağındandır. Verim değişimi beklenmekle birlikte, bu protokol genellikle belirli örnek koşullara göre belirsizdir. Aynı protokol, ekimden 2, 3, 5, 8, 9 ve 10 hafta sonra toplanan sorgum bitki yaprak dokusu için başarıyla kullanılmıştır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A955-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, 500mM Solution, pH 8.0</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>324504-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine Hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G3272-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate, dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3786-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail, cOmplete tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5892791001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium butyrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>303410-5G</td>
			<td>Used for histone deacetylase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7020-100G</td>
			<td>Used for phosphatase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Orthovanadate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>450243-10G</td>
			<td>Used for phosphatase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7903-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP153-500 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weak cation exchange resin, mesh 100-200 analytical (BioRex70)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>142-5842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatography column (Bio-Spin)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>732-6008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh 100 filter cloth</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>NY1H09000</td>
			<td>This is part of the Sigma kit (catalog # CELLYTPN1) for plant nuclei extraction. Similar filters with the same mesh size can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips (P20, P200, P1000)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube, 50mL/15mL, Centrifuge, Conical</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>28-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube, Microcentrifuge, 1.5/2 mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-912-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers (50mL &#8211; 2L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge with cooling</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-690-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinging-bucket centrifuge with cooling</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-728-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath Sonicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-336-120</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of histone from sorghum leaf tissue for top down mass spectrometry profiling of potential epigenetic markers

Histonlar, ökaryotlarda yüksek oranda korunmuş protein ailesine aittir. DNA'yı fonksiyonel kromatin birimleri olarak nükleozomlara paketlerler. Son derece dinamik olan ve enzimler tarafından eklenebilen veya çıkarılabilen histonların çeviri sonrası modifikasyonları (PTM'ler) gen ekspresyonunun düzenlenmesinde kritik roller oynar. Bitkilerde, histone PTM'leri de dahil olmak üzere epigenetik faktörler, çevreye adaptif tepkileri ile ilgilidir. Epigenetik kontrolün moleküler mekanizmalarını anlamak, yenilikçi biyomühendislik çözümleri için benzeri görülmemiş fırsatlar getirebilir. Burada, çekirdeği izole etmek ve histonları sorgum yaprak dokusundan arındırmak için bir protokol açıklıyoruz. Çıkarılan histonlar, çevrimiçi ters fazlı (RP) sıvı kromatografisi (LC) ile birlikte yukarıdan aşağıya kütle spektrometresi (MS) ile bozulmamış formlarında analiz edilebilir. Aynı histone proteoformdaki birden fazla PTM'nin kombinasyonları ve stoichiometry kolayca tanımlanabilir. Ek olarak, histone kuyruk kırpması yukarıdan aşağıya LC-MS iş akışı kullanılarak algılanabilir, böylece çekirdek histonların (H4, H2A, H2B, H3) küresel PTM profilini elde eder. Bu protokolü daha önce, kuraklık direncinin epigenetik belirteçlerini tanımlamayı amaçlayan büyük ölçekli bir saha çalışmasından toplanan sorgum yaprak dokusundan histone PTM'lerinin profilini çıkarmak için uygulamiştik. Protokol potansiyel olarak kromatin immünorepipitasyon-dizileme (ChIP-seq) veya benzer bitkilerdeki histone PTM'lerini incelemek için uyarlanabilir ve optimize edilebilir.

Protokolün ardından, histonlar LC-MS analizi kullanılarak çıkarılabilir ve tanımlanabilir. Ham veriler ve işlenmiş sonuçlar MassIVE'de (https://massive.ucsd.edu/) katılım yoluyla kullanılabilir: MSV000085770. Temsili numuneden elde edilen TopPIC sonuçlarına dayanarak (MassIVE'den de edinilebilir), 303 histone proteoform (106 H2A, 72 H2B, 103 H3 ve 22 H4 proteoform) tespit ettik. Ko-saflaştırılmış ribozomal proteoformlar da tespit edilmiştir, tipik olarak LC'nin başlarında ortaya çıktı. Genellikl...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Histone from Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profiling of Potential Epigenetic Markers at JoVE.com

Isolation of Histone from Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profiling of Potential Epigenetic Markers

Protokol, kuraklığa dayanıklı ürünlerin mühendisliğine yardımcı olmak için potansiyel epigenetik belirteçler olarak hizmet edebilecek histone post-translational modifikasyonların profillenebilmesi için sorgum yaprağı malzemelerinden bozulmamış histonları etkili bir şekilde çıkarmak için geliştirilmiştir.

Potansiyel Epigenetik belirteçlerin Yukarıdan Aşağıya Kütle Spektrometresi Profillemi için Sorgum Yaprak Dokusundan Histone İzolasyonu

Histones belong to a family of highly conserved proteins in eukaryotes. They pack DNA into nucleosomes as functional units of chromatin. ...

Protokolümüz sorgum bitkisi gelişimi ve kuraklık direnci için epigenetik belirteçleri ortaya çıkarır. Bu tür bir moleküler anlayış, gelecekte ekinleri aşırı iklimlere uyarlamak için daha iyi çözümler geliştirmeye yardımcı olacaktır. Bu protokol, kitle spektrometresi ile çeviri sonrası değişikliklerin hedefsiz profillenimi için uygun sorgum yaprak dokusundan yüksek saflıkta histonlar üretir.Prosedürü gösterenler, EMSL'den lisans sonrası araştırma ortakları Shadan Abdali ve Tanya Winkler olacak. Başlamak için, birkaç sorgum yaprağını sıvı nitrojenle öğütün ve eksi 80 santigrat derecede 50 mililitrelik bir santrifüj tüpünde saklayın. Her numunenin histon analizi için yaprak tozunun yaklaşık dört gramını kullanın.Metin el yazmasında açıklandığı gibi ekstraksiyon tamponları 1, 2A ve 2B hazırlayın ve 0,2X'lik son konsantrasyonu yapmak için ekstraksiyon tamponuna bir proteaz inhibitörü tablet ekleyin. Daha sonra hazırlanan ekstraksiyon tamponunun 20 mililitresini öğütülmüş yaprak tozunun içine ekleyin ve 10 dakika boyunca hafifçe karıştırın veya girdaplayın. Mesh 100'ü kullanarak, filtrelenmiş malzemeyi her seferinde bir mililitre ekstraksiyon tamponu ile iki kez durulayın.Daha sonra, hücre kalıntılarını ve büyük hücre altı organelleri peletmek için sallanan bir kova rotorunda filtratı 3.000 kez G'de 10 dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüjleyin. Aynı zamanda, 0.4X'lik son konsantrasyona proteaz inhibitörü ekleyerek ekstraksiyon tamponu 2A'yı hazırlayın. Peletin rahatsız etmeden süpernatant atın.Daha sonra peletı hazırlanan ekstraksiyon tamponu 2A'nın beş mililitresinde yeniden ıslatın. Hafifçe karıştırarak 10 dakika buzda kuluçkaya yatırın. Çözeltiyi 2, 100 kez G'de 15 dakika boyunca dört santigrat derecede sallanan bir kova rotorunda döküntü ve çekirdekleri peletmek için santrifüjleyin.Peletin rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice dekant. Proteaz inhibitörlerini 1X'lik son konsantrasyona ekleyerek ekstraksiyon tamponu 2B'yi hazırlayın. Santrifüjlemeden sonra elde edilen peletin içine bu hazırlanmış tampondan beş mililitre ekleyin.2,100 kez G'de 15 dakika boyunca dört santigrat derecede sallanan kova rotorunda pelet kalıntılarına ve çekirdeklere santrifüj. Aynı zamanda, bir proteaz inhibitörü tablet ekleyerek çekirdek lizis tamponu hazırlayın. Peletin rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice deklare edin ve peletin liziz tamponunun 250 mikrolitresinde yeniden dirildi.Çözeltiyi homojenize etmek ve malzemeyi yeniden çıkarmak için maksimum hızda 15 saniye boyunca girdaplayın. Sonra dört santigrat derecede beş dakika sonicate ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. Donmuş çekirdek örneğini çözün ve% 5 guanidin tamponunun 750 mikrolitresini ekleyin.Sonra 4 santigrat derecede 15 dakika sonicate. Örneği iki mililitrelik bir tüpe aktarın ve dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 10.000 kez G'de döndürün. Aynı zamanda, yüzeydeki kirlenmeyi en aza indirmek için iki mililitre asetonitril ve dört mililitre su ile durulayarak bir iyon değişim kromatografi sütunu hazırlayın.Kromatografi sütununa yaklaşık 200 ila 300 mikrolitre zayıf katyon değişim reçinesi yükleyin ve reçinenin yerleşmesine izin verin. Reçineyi guanidin tamponu ile dört kez yıkayın ve tüpü ve kolonu buza yerleştirin. Sütunu iki mililitrelik bir toplama tüpüne koyun ve hazırlanan numuneden süpernatantı reçineyi bozmadan yavaşça reçine yatağına yükleyin.Çözelti akarken, reçineye maksimum bağlamaya izin vermek için eluent'i sütunun üstüne altı ila sekiz kez geri yükleyin. Daha sonra histone olmayan proteinleri kolondan yıkamak için iki mililitre% 5 guanidin tamponu yükleyin. Histone proteinlerini bir mililitre% 5 guanidin tamponu ile elute edin ve unu toplayın.Üç kilodalton kesme spin filtresini 500 mikrolitre yıkama çözücü ile temizleyin, ardından önceden temizlenmiş spin filtresini kullanarak kalan eluent'i tuzdan arındırın. LC-MS özellik haritasının belirli bölgelerinde deneyin başarısını gösteren büyük histone proteinleri gözlendi. Bu temsili harita kesikli kutularda bozulmamış tam uzunlukta histonları gösterir.H2B ve 16 kilodalton H2A proteoformların LC-MS özellik haritası, her ikisinin de benzersiz ürün oturum numaralarında belirtildiği gibi benzer dizilere sahip birden fazla homologa sahip olduğunu göstermektedir. Uzun kuyrukları olmayan başka bir H2A histon grubu görülebilir. H4 histone proteinlerindeki N-terminal asetilasyon, ek lizin asetilasyonları ve metiyonin oksidasyonları burada gösterilen LC-MS özellik haritasındaki kütle farklılıkları incelenerek gözlemlenebilir.H3 histone proteinleri için H3.3 ve H3.2 olmak üzere iki protein dizisi tanımlanmıştır. Elektron transferi ayrışması, tanımlanan H3.2 proteoformunun parçalanma spektrumunu oluşturmak için kullanıldı. Öncü iyonları ve önceki ve sonraki Ms1 spektrumları burada mor renkle vurgulanmış eşleştirilen izotop zirveleriyle gösterilir.Çeviri sonrası değişiklikler sıra kapsama haritası kullanılarak yerelleştirilebilir. Proteoformların göreli bolluğu karşılaştırılarak, örnek koşullara özgü kesilmiş histone proteoformlarının değişiklikleri keşfedilmiştir. H4'ün C-terminal kesilmesi sadece bazı numuneler için üç ve dokuz hafta içinde gözlendi.H3.2 için, N-terminal kesilmiş proteoformlar genellikle 10. Buna karşılık, C terminali kesilmiş H3.2 daha önceki zaman noktalarında görülmüştür. H4 C terminali kesilmiş proteoformlar BTx642'de RTx430'a göre önemli ölçüde daha fazlaydı.Bu protokolü denerken, süpernatantın ve peletin renklerine çok dikkat edin. Renk değişimi, kloroplast taşlama veya lizisteki olası sorunların belirlenmesine yardımcı olun. Sorgum yapraklarından histon izolasyonu için bu sağlam protokolün diğer benzer bitkiler için epigenetik araştırmalara olanak sağlayacağını umuyoruz.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Biyolojik Numune metabolik profil için Sheathless Kapiler Elektroforez-Kütle Spektrometre

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zaman çözülmesi elektro sprey iyonizasyon Hidrojen-döteryum Değişim Kütle Spektrometre Protein Yapısı ve Dinamikleri incelenmesi için

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Kantitatif Kütle Spektrometresi Analiz lipid Damlacık izolasyonu

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Kütle spektrometresi tabanlı kimlik RNA-bağlama bölgelerinin için numune hazırlama

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Derin Proteom izobarik etiketleme, kapsamlı sıvı Kromatografi, kütle spektrometresi ve yazılım destekli miktar tarafından profil oluşturma

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Yaprak sprey kütle spektrometresi: Doğrudan metabolitleri bitki doku üzerinden değerlendirmek için bir hızlı ortam iyonlaşma tekniği

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Anjiyotensin II tarafından gösterilen nitropeptid profil oluşturma ve tanımlama

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Probuelektrosprey Iyonizasyon Kütle Spektrometresi için Örnek Hazırlama

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Büyük Ölçekli Nükleer Etkileşimom Profilleme için Etiketsiz İmmünoprekütle Spektrometresi İş Akışı

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...